Esterilidade Comercial

A esterilidade comercial caracteriza-se pelo não desenvolvimento microbiano em amostras produzidas e armazenadas em condições normais de produção e/ou estocagem (CODEX ALIMENTARIUS, 1999). Nesta pesquisa os dois tratamentos analisados (240114 e 070714) apresentaram-se não estéreis comercialmente. Nenhuma das amostras analisadas apresentou crescimento após incubação em Meio de Carne Cozida (CMM) com Ágar selo, demonstrando ausência de bactérias esporogênicas mesófilas anaeróbias e bactérias esporogênicas termófilas anaeróbias.

Os gêneros de bactérias formadoras de esporos de interesse para produtos lácteos são o gênero Bacillus (aeróbico e anaeróbico facultativo) e o gênero Clostridium (anaeróbios estritos). O gênero Paenibacillus, originalmente incluído no gênero Bacillus, agrupa bactérias anaeróbias facultativas formadoras de endósporos, as quais são relacionadas com a deterioração de produtos lácteos

(ANGELIDIS, 2014; MARTIN et al., 2011). Apesar da reduzida probabilidade de desenvolvimento de bactérias estritamente anaeróbias no leite (ex. Clostridium spp.) o estudo da presença destes microrganismos torna-se importante devido ao envolvimento destes com episódios de surtos de intoxicação alimentar (ANGELIDIS, 2014).

Os dois tratamentos (240114 e 070714) apresentaram crescimento em Caldo Dextrose Triptona e alterações nos valores de pH acima de 0,2 unidades, fato que também caracteriza ausência de esterilidade comercial (BRASIL, 1996, 2001). Na Tabela 17 seguem os valores de pH apresentados pelas amostras do tratamento 240114.

Tabela 17 – Valores médios de pH do tratamento 240114, após o período de pré-incubação.

Amostra

pH

Pré-incubação a 55°C por 7 dias Pré-incubação a 35°C por 10 dias

1 6,02±0,01bcA 5,81±0,02bcB 2 6,03±0,00abcA 5,79±0,04bcB 3 6,05±0,00abA 5,77±0,02cB 4 6,03±0,00abcA 5,78±0,01cB 5 6,05±0,00abA 5,78±0,01cB 6 6,06 ±0,01abA 5,83±0,01abB 7 5,99±0,00cA 4,24±0,01dB 8 6,07±0,00aA 5,86±0,01aB

*Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não diferem estatisticamente entre si. Médias seguidas pela mesma letra maiúscula na linha não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

*Médias seguidas do desvio padrão

Avaliando-se a Tabela 17 verifica-se que as amostras pré-incubadas a 55°C por 7 dias e as pré-incubadas a 35°C por 10 dias apresentaram diferenças significativas entre si (p<0,05). Sendo os valores de pH das amostras pré-incubadas a 55°C por 7 dias significativamente maiores (p<0,05) do que os das amostras pré- incubadas a 35°C por 10 dias. Dentro dos dois períodos de pré-incubação todas as

amostras apresentaram-se significativamente iguais (p<0,05) à pelo menos uma das amostras do grupo, com exceção da amostra 7, pré-incubada a 35°C por 10 dias, a qual foi significativamente diferente (p<0,05) de todas as outras, apresentando um pH de 4,24±0,01 unidades.

Comparando os valores de pH do tratamento 240114 logo após o processamento, o qual apresentou com zero dia de estocagem pH igual a 6,68±0,00 (Item 4.3, Tabela 22), verificou-se alta variação ocorrida nas amostras pré-incubadas (Tabela 17). As variações ficaram entre 2,44 e 0,61 unidades, o que denota ausência de esterilidade comercial. Além de microrganismos deteriorantes e suas enzimas, os quais causam alterações na qualidade sensorial do produto durante sua estocagem, estes produtos podem conter microrganismos produtores de toxinas (PETRUS, 2004).

Após inoculação em caldo Dextrose Triptona (DifcoTM, Lawrence, EUA) e incubação, os tubos apresentaram crescimento de moderado a intenso, indicado pela mudança de coloração do caldo, de púrpura para amarelo, como pode ser visto na Figura 14.

Figura 14 – Tubos DTB do processo 240114.

Legenda: A – Pré-incubação a 55°C/7dias e Incubação a 55°C/4 dias; B - Pré-incubação a 55°C/7dias e Incubação a 35°C/10 dias; C – Pré-incubação a 35°C/10 dias e incubação a 55°C/4 dias; D – Pré- incubação a 35°C/10 dias e incubação a 35°C/10 dias.

Decorridas as etapas de caracterização, constatou-se a presença de bactérias esporogênicas aeróbias mesófilas ou termófilas facultativas e bactérias esporogênicas aeróbias termófilas facultativas. O resumo dos resultados apresenta- se na Tabela 18.

Tabela 18 – Resumo dos resultados obtidos durante caracterização do processo 240114.

Pré-incubação Incubação

(Tubos DTB)

Crescimento Resultado

55°C por 7 dias 55°C por 4 dias Positivo

Bactérias esporogênicas aeróbias termófilas

facultativas

55°C por 7 dias 35°C por 10 dias Positivo

Bactérias esporogênicas aeróbias mesófilas ou termófilas facultativas

35°C por 10 dias 55°C por 4 dias Positivo

Bactérias esporogênicas aeróbias termófilas

facultativas

35°C por 10 dias 35°C por 10 dias Negativo

____

A Figura 15 apresenta o resultado da microscopia realizada no tratamento 240114 durante a caracterização, utilizando-se os métodos de coloração de Gram e coloração de esporos (SILVA et al., 2010). Durante a análise microscópica foi constatada a presença de bastonetes Gram positivos e esporos.

Figura 15 – Resultados da análise microscópica do tratamento 240114: coloração de Gram e coloração de esporos.

Devido à ausência de esterilidade comercial, o trocador de calor foi desmontado e lavado manualmente com auxílio de escovas e esponjas. Na Figura 16 são apresentadas placas do trocador de calor anteriormente a lavagem e retirada dos depósitos lácteos.

Apesar da execução da limpeza mecânica e higienização SIP (Sterilization in Place), o tratamento 070714, da mesma forma que o tratamento 240114, não apresentou esterilidade comercial. Os valores de pH das amostras 070714, após o período de pré-incubação, são apresentados na Tabela 19.

Tabela 19 – Valores médios de pH do tratamento 070714, após o período de pré-incubação.

Amostra

pH

Pré-incubação a 55°C por 7 dias Pré-incubação a 35°C por 10 dias

1 5,79±0,04bcA 5,71±0,03eB 2 5,81±0,02bA 5,74±0,02deB 3 6,77±0,00aA 5,90±0,01bB 4 5,75±0,01cA 5,77±0,04cdA 5 5,77±0,03bcB 5,82±0,02cA 6 6,78±0,01aA 5,71±0,01eB 7 5,79±0,01bcB 6,73±0,02aA 8 6,76±0,01aA 6,74±0,02aA

*Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não diferem estatisticamente entre si. Médias seguidas pela mesma letra maiúscula na linha não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

*Médias seguidas do desvio padrão.

Avaliando-se a Tabela 19 verifica-se que as amostras pré-incubadas à 55°C por 7 dias e as pré-incubadas à 35°C por 10 dias apresentaram diferenças significativas entre si (p<0,05). Com exceção das amostras 4 e 8, que não diferiram estatisticamente (p<0,05). Dentro dos dois períodos de pré-incubação todas as amostras apresentaram-se significativamente iguais (p<0,05) à pelo menos uma das amostras do grupo, com exceção da amostra 3, pré-incubada a 35°C por 10 dias, a qual foi significativamente diferente (p<0,05) de todas as outras, apresentando um pH de 5,90±0,01unidades.

Com zero dia de estocagem o tratamento 070714, apresentou pH médio de 6,73±0,03 (Item 4.3, Tabela 22). Fazendo-se a comparação entre a amostra 070714 recém-processada e as amostras pré-incubadas (Tabela 19), verificou-se que em algumas amostras houve o desenvolvimento microbiano, ou seja, ausência de esterilidade comercial, e em outras os valores de pH quase não se alteraram, portanto estas amostras apresentaram-se comercialmente estéreis.

Em percentagem, observa-se que 68,75% das amostras foram constatadas como não estéreis. Segundo Von Bockelmann (1991) a presença de 1% de amostras com ausência de esterilidade comercial é inaceitável. A falta de esterilidade comercial indica a presença de microrganismos deteriorantes e/ou patogênicos (PETRUS, 2004).

Os resultados após inoculação em caldo Dextrose Triptona e incubação são apresentados na Figura 17. Com base nesses resultados, observa-se que o crescimento em algumas amostras demonstrou-se duvidoso, já que em outras houve um intenso desenvolvimento de coloração amarela.

Figura 17 – Tubos DTB do processo 070714.

Legenda: A – Pré-incubação a 55°C/7dias e Incubação a 55°C/4 dias; B - Pré-incubação a 55°C/7dias e Incubação a 35°C/10 dias; C – Pré-incubação a 35°C/10 dias e incubação a 55°C/4 dias; D – Pré- incubação a 35°C/10 dias e incubação a 35°C/10 dias.

Decorridas as etapas de caracterização, constatou-se a presença de bactérias esporogênicas aeróbias mesófilas ou termófilas facultativas e bactérias esporogênicas aeróbias termófilas facultativas. O resumo dos resultados apresenta- se na Tabela 20.

Tabela 20 – Resumo dos resultados obtidos durante caracterização do processo 070714.

Pré-incubação Incubação

(Tubos DTB)

Crescimento Resultado

55°C por 7 dias 55°C por 4 dias Positivo

Bactérias esporogênicas aeróbias termófilas

facultativas

55°C por 7 dias 35°C por 10 dias Positivo

Bactérias esporogênicas aeróbias mesófilas ou termófilas facultativas 35°C por 10 dias 55°C por 4 dias Negativo ---

35°C por 10 dias 35°C por 10 dias Positivo

Bactérias esporogênicas mesófilas ou termófilas

facultativas

A Figura 18 apresenta-se o resultado da microscopia realizada durante a caracterização, utilizando-se o método de coloração de Gram e coloração de esporos (SILVA et al., 2010). Durante a coloração de Gram os micro-organismos presentes apresentaram-se Gram variáveis. Geralmente bactérias esporogênicas possuem parede celular Gram positiva, porém durante a coloração pode ocorrer variação, ou somente resultado negativo. Estas bactérias apresentam-se como bastonetes retos ou um pouco curvilíneos e de vários tamanhos (SILVA et al., 2010). Dentre as bactérias aeróbias formadoras de esporos mais estudadas em microbiologia do leite estão as pertencentes ao gênero Bacillus. As bactérias deste gênero têm forma de bastonetes Gram positivos, mas que possuem labilidade, podendo apresentar-se como Gram negativos (ANGELIDIS, 2014; MADIGAN; MARTINKO; PARJER, 2002)

Figura 18 – Resultados da análise microscópica do tratamento 070714: coloração de Gram e coloração de esporos.

A ausência de esterilidade comercial nos dois tratamentos, apesar dos binômios tempo/temperatura intensos aplicados, levanta a hipótese da presença de biofilmes na linha de processamento, isto limitou o alcance dos objetivos deste trabalho, pois a presença de biofilmes ocasiona a contaminação dos produtos processados (MARCHAND et al., 2012).

As bactérias presentes no leite possuem a habilidade de aderir e se agregar nas superfícies, resultando na formação de biofilmes na linha de processo, os quais podem conter microrganismos deteriorantes e patogênicos (MARCHAND et al., 2012). Sabe-se que células bacterianas contidas em biofilmes possuem proteção contra desinfetantes (ELASRI; MILLER, 1999) e que durante o processo agregados de células ou células individuais vão sendo liberadas para o leite (TEH et al., 2012; XAVIER et al., 2003).

4.1.6. Contagens microbiológicas totais: mesófilos aeróbios,