UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
FABIANE MATIAS DOS ANJOS
AVALIAÇÃO DA RESISTÊNCIA TÉRMICA DE Geobacillus stearothermophilus E DO EFEITO DE BINÔMIOS DE PROCESSAMENTO SOBRE A VIDA DE
PRATELEIRA DE LEITE LONGA VIDA EM EMBALAGENS FLEXÍVEIS
CAMPINAS 2015
FABIANE MATIAS DOS ANJOS
AVALIAÇÃO DA RESISTÊNCIA TÉRMICA DE Geobacillus stearothermophilus E DO EFEITO DE BINÔMIOS DE PROCESSAMENTO SOBRE A VIDA DE
PRATELEIRA DE LEITE LONGA VIDA EM EMBALAGENS FLEXÍVEIS
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas, como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Tecnologia de Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. José de Assis Fonseca Faria
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA FABIANE MATIAS DOS ANJOS, ORIENTADA PELO PROF. DR. JOSÉ DE ASSIS FONSECA FARIA.
CAMPINAS 2015
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Anjos, Fabiane Matias dos,
An58a AnjAvaliação da resistência térmica de Geobacillus stearothermophilus e do efeito de binômios de processamento sobre a vida de prateleira de leite longa vida em embalagens flexíveis / Fabiane Matias dos Anjos. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.
AnjOrientador: José de Assis Fonseca Faria.
AnjDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
Anj1. Processamento térmico. 2. Leite longa vida. 3. Vida de prateleira. 4. Esporos bacterianos. I. Faria, José de Assis Fonseca. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Evaluation of Geobacillus stearothermophilus thermal resistance and the processing binomials effects on shelf life of long life milk in flexible packaging. Palavras-chave em inglês:
Thermal processing Long life milk Shelf life
Bacterial spores
Área de concentração: Tecnologia de Alimentos Titulação: Mestra em Tecnologia de Alimentos Banca examinadora:
José de Assis Fonseca Faria [Orientador] Adriano Gomes da Cruz
Carlos Alberto Rodrigues Anjos Data de defesa: 30-11-2015
Programa de Pós-Graduação: Tecnologia de Alimentos
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. José de Assis Fonseca Faria Orientador – FEA/UNICAMP
Prof. Dr. Adriano Gomes da Cruz
Membro – INSTITUTO FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
Prof. Dr. Carlos Alberto Rodrigues Anjos Membro – FEA/UNICAMP
Prof. Dr. Flavio Luis Schmidt Suplente – FEA/UNICAMP
Prof. Dr. Wellington de Freitas Castro
Suplente – INSTITUTO FEDERAL DE SÃO PAULOS – BARRETOS
A Ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Aos meus pais, Claudete e José, pela dedicação diária em me ajudar a alcançar os meus
sonhos.
Às minhas afilhadas, Kayla (minha bonequinha) e Larissa (minha Branca).
Ao meu anjo, Julio Cesar, pelo carinho.
Ao meu irmão e cunhada, Leandro e Kelly, pelo incentivo.
AGRADECIMENTOS
A Deus em primeiro lugar sempre, por ser meu refúgio e minha fortaleza.
À minha mãezinha Nossa Senhora Aparecida e Santa Ana Mestra por serem minhas intercessoras.
À minha família, que amo tanto, por toda dedicação.
À Universidade Estadual de Campinas, à Faculdade de Engenharia de Alimentos e ao Departamento de Tecnologia de Alimentos pela oportunidade para realização deste trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pela bolsa de mestrado concedida.
À Fundação de amparo à pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo financiamento deste trabalho.
À Fundação André Tosello (FAT) por fornecer a cultura de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953.
Ao Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL) por fornecer a cultura de Geobacillus stearothermophilus IAL2128.
Ao professor Assis pela orientação, compreensão e disposição durante os processos.
Aos membros da comissão examinadora pelas correções e sugestões.
À professora Pilar e à Alessandra pelo treinamento no preparo das suspensões de esporos.
Ao professor Anderson, pelo auxílio com a microbiologia preditiva. E por disponibilizar seu laboratório para as análises de resistência térmica.
À Verônica, do laboratório de microbiologia quantitativa de alimentos, pelo treinamento nos testes de resistência térmica.
À professora Juliana Alves Macedo do Departamento de Alimentos e Nutrição por permitir que eu fizesse as análises de colorimetria no laboratório central instrumental, e ao técnico por me auxiliar.
Ao professor Sérgio por me auxiliar a resolver alguns problemas.
À coordenadora técnica do SENAI Barra Funda, Cristiana Ambiel, por adequar meu horário de serviço para que eu pudesse me dedicar ao mestrado.
Aos meus alunos do técnico em alimentos do SENAI Barra Funda pelo reconhecimento e por me escolherem como professora homenageada da turma.
Aos colegas e diretora do curso técnico em panificação do Instituto do Desenvolvimento da Panificação e Confeitaria (IDPC), por serem facilitadores nas últimas semanas de mestrado e adaptarem meus horários de aula. Pelo mesmo motivo, agradeço também aos colegas e coordenadora do curso técnico em alimentos da ETEC de Sapopemba.
À técnica do laboratório de Embalagens, Alice, por toda ajuda.
À técnica do laboratório de Microbiologia, Aline, por toda dedicação em me ajudar a analisar os dados microbiológicos do meu trabalho.
Aos demais técnicos do departamento que me auxiliaram.
Às auxiliares do departamento por me ajudar a manter a organização e limpeza dos laboratórios.
As funcionárias da secretaria e funcionários do departamento pela ajuda em diversos momentos.
Aos amigos do laboratório de embalagens, Alexandre, Welliton, Eliene, Edilma, Simone, Laura, Ana Laura, Erick, Ana Sílvia e Marcelo, pelos momentos de descontração e pela ajuda.
À Eliene por dedicar seu tempo em me auxiliar nas análises de proteólise e sugestões na análise dos dados deste trabalho.
À Letícia Mami pela participação nos processos.
Aos colegas do laboratório de tecnologia emergentes pela disposição em ajudar. Em especial ao Thiago, sempre muito solícito, pela execução das análises de viscosidade.
Aos demais colegas do departamento pelos momentos alegres.
Aos amigos que me acolheram em suas casas nos momentos finais desta jornada. Mariana e Trip, obrigada pelas conversas. Adriana e Júlio, obrigada por fazerem eu me sentir em casa e pelas palavras de ânimo e fé. A vocês minha eterna gratidão.
À Edilma, querida amiga, um super agradecimento por todos os momentos de convívio na graduação, estágio e mestrado. Pelo apoio tanto nos momentos profissionais e pessoais, pelas palavras de incentivo e consolo. Eddie, obrigada por estar presente nos momentos de alegria, e principalmente nos momentos de tristeza.
Aos demais colegas da Faculdade de Engenharia de Alimentos que me auxiliaram no desenvolvimento deste projeto.
A todos que me ajudaram em algum momento, me auxiliando em alguma atividade, ou me dedicando algumas palavras de incentivo, meu muito obrigado.
Direi do Senhor: Ele é o meu Deus, o meu refúgio, a minha fortaleza, e nele confiarei.
(Salmo 91:2)
RESUMO
Os objetivos do trabalho foram determinar a resistência térmica dos esporos de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 e Geobacillus stearothermophilus IAL2128, avaliar a eficiência microbiológica de binômios não convencionais de tratamento térmico para leite (139°C/87,5s; 136°C/49,5s e 138°C/51,5s) e os efeitos destes nos parâmetros de qualidade e estabilidade de leite longa vida, bem como a viabilidade do uso de embalagem flexível em um sistema asséptico piloto. A cepa ATCC7953 apresentou valores D a 121°C (87,6 s), 125°C (30,6 s) e 127°C (20,0 s) menores que os apresentados pela cepa IAL2128, os quais foram 228,7 s, 107,6 s, 37,7 s, 17,24 s e 5,0 s, a 121°C, 125°C, 127°C, 130°C e 135°C, respectivamente. Os valores Z para as cepas ATCC7953 e IAL2128 foram 9,25°C e 8,14°C, respectivamente. As matérias-primas e os produtos obtidos foram caracterizados a partir de análises microbiológicas (contagem total de bactérias mesófilas aeróbias e psicrotróficas, contagem total de esporos de termófilos e teste de esterilidade comercial) e físico-químicas (proteólise, pH, acidez, sedimentação, viscosidade e cor instrumental). Estas análises também foram realizadas ao longo de quatro meses de estocagem ambiente para dois dos processos (240114 e 070714), nos quais não houve inoculação de esporos de Geobacillus stearothermophilus. Um terceiro processo (040315), no qual foram inoculados esporos de Geobacillus stearothermophilus IAL2128, foi avaliado durante 30 dias de estocagem. Para caracterizar a embalagem foi determinada sua espessura, taxa de permeabilidade ao oxigênio (TPO2) e transmissão da radiação ultravioleta e visível. A embalagem apresentou alta barreira ao oxigênio e à luz, compatível com materiais flexíveis já utilizados no mercado. As avaliações microbiológicas das amostras processadas não atingiram a esterilidade comercial, possivelmente devido à existência de biofilmes na linha de processamento. Os binômios testados provocaram grandes modificações na maioria dos parâmetros físico-químicos estudados durante a estocagem, apresentando em um dos processos alteração visual intensa na coloração do leite obtido. Concluiu-se que os processamentos nos binômios testados não foram satisfatórios, pois resultaram em alterações no leite e reduziram sua estabilidade durante o período de armazenamento. Também, o tratamento térmico não garantiu a eliminação total dos esporos bacterianos, os quais tiveram influência na vida de
prateleira dos produtos estudados. Por isso, a adequação dos parâmetros do processo, a adoção de binômios menos severos, o controle efetivo da qualidade físico-química e microbiológica da matéria-prima, bem como a estocagem em temperatura monitorada, continuam sendo o procedimento mais eficaz no controle das alterações do leite UHT e manutenção do seu padrão de identidade e qualidade durante sua vida de prateleira.
Palavras-chave: processamento térmico, leite longa vida, vida de prateleira, esporos bacterianos.
ABSTRACT
The objectives of this project were to determinate the thermal resistance of Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 and Geobacillus stearothermophilus IAL2128 spores, to evaluate the microbiological efficiency of no conventional binomials for milk treatment (139°C/87,5s; 136°C/49,5s and 138°C/51,5s) on the quality characteristics and stability of the UHT milk, as well as the adequacy of the flexible packaging using a pilot aseptic system. The ATCC7953 strain showed D-values at 121°C (87,6 s), 125°C (30,6s) and 127°C (20 s) minor than IAL2128 strain’s D-values, that were 228,7 s, 107,6 s, 37,7 s, 17,24 s e 5,0 s, at 121°C, 125°C, 127°C, 130°C e 135°C, respectively. The ATCC7953 strain’s Z-value was 9,25°C and IAL2128 strain’s Z-value was 8,14°C. The prime materials and products obtained were characterized for the microbiological analysis (aerobic mesophilic and psychrotrophic bacteria total count, thermophilic spores / flat-sour total count and commercial sterility) and physicochemical analysis (proteolysis, pH, acidity, sedimentation, viscosity and instrumental color). These analyses were also done every 30 days during 120 days of packaging in two of the processes (240114 e 070714); the Geobacillus stearothermophilus spores were not inoculated in these processes. In the third process (040315), which Geobacillus stearothermophilus IAL2128 spores were inoculated, it was evaluated during 30 days of packaging. To characterize the packaging, the thickness, the permeability of oxygen, and the transmission of ultra violet radiation and light were measured. The packaging presented a high barrier to the oxygen and light, compatible with packaging already used in the market. The microbiological evaluations of the processed samples demonstrated no commercial sterility. The binomial tested caused severe alterations in the majority of the physiochemical parameters studied during the storage, presenting in one of the processes, a high visual change in the coloration of the UHT milk. In conclusion, the UHT binomials tested were impracticable, considering that the thermal treatments applied caused significant changes in the milk quality and reduced its stability during the tested period. Also, the intensity of the heat treatment did not guaranty the bacterial spores’ inactivation and reduced the shelf life of the processed milk. Based on these results, it is advised to consider the importance of monitoring the adequacy of the process parameters, the adoption of binomials less
severe, the effective control of the physiochemical and microbiological quality of the raw material, in order to obtain the UHT milk with assured quality.
Sumário RESUMO... 9 ABSTRACT ... 11 1. INTRODUÇÃO ... 16 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 17 2.1. Leite UHT ... 17
2.2. Fatores que afetam a estabilidade do leite UHT ... 19
2.2.1. Sistema de embalagem ... 19
2.2.2. Qualidade microbiológica do leite in natura ... 20
2.3. Modificações no leite UHT ... 24
2.3.1. Proteínas ... 24
2.3.2. Qualidade Sensorial ... 26
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 27
3.1. Produção da suspensão de esporos de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 e Geobacillus stearothermophilus IAL2128 ... 27
3.2. Teste de Resistência Térmica dos Esporos de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 e Geobacillus stearothermophilus IAL2128. ... 28
3.3. Matéria-Prima ... 29
3.4. Processamento ... 30
3.4.1. Higienização da Linha de Processamento ... 33
3.5. Material da Embalagem ... 34
3.5.1. Higienização da Embalagem ... 35
3.6. Análises Físico-químicas ... 35
3.6.1. Proteólise ... 35
3.6.2. Quantificação dos sedimentos ... 36
3.6.3. Viscosidade ... 36
3.6.4. pH ... 36
3.6.6. Cor Instrumental ... 37
3.7. Análises Microbiológicas ... 37
3.7.1. Contagem total de aeróbios mesófilos em placas ... 37
3.7.2. Contagem de aeróbios psicrotróficos ... 38
3.7.3. Contagem de esporos de termófilos aeróbios totais e flat–sour ... 38
3.7.4. Teste de esterilidade comercial: Deterioração em alimentos de baixa acidez ... 39
3.8. Análise Estatística ... 43
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 43
4.1. Análises microbiológicas ... 43
4.1.1. Contagem da Suspensão de esporos de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 e Geobacillus stearothermophilus IAL2128. ... 43
4.1.2. Teste de Resistência Térmica dos esporos de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 ... 44
4.1.3. Teste de Resistência Térmica dos esporos de Geobacillus stearothermophilus IAL2128 ... 49
4.1.4. Descrição do processamento 131112 ... 58
4.1.5. Esterilidade Comercial ... 59
4.1.6. Contagens microbiológicas totais: mesófilos aeróbios, psicrotróficos e esporos de termófilos aeróbios/ flat-sour... ... 68
4.2. Proteólise ... 70
4.3. pH e Acidez ... 74
4.4. Quantificação dos sedimentos... 78
4.5. Viscosidade ... 80
4.6. Cor instrumental ... 82
4.7. Caracterização da embalagem ... 84
5. CONCLUSÕES ... 88
1. INTRODUÇÃO
Apesar de alguns autores afirmarem que o leite longa vida seja um produto rejeitado pelo consumidor devido ao seu sabor cozido (SARKAR, 1999; VATNE; CASTBERG, 1991), dados mercadológicos brasileiros demonstram o crescimento do seu consumo. No início da década de 90, o leite UHT representava 4% das vendas de leite fluido, em 1998 esta porcentagem passou para 53% e em 2009 para 76% (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DA INDÚSTRIA DE LEITE LONGA VIDA, 2009; GOMES, 1999). Tais dados mostram a tendência dos consumidores em buscarem produtos que ofereçam comodidade e conveniência (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DA INDÚSTRIA DE LEITE LONGA VIDA, 2010), incentivando assim o desenvolvimento de programas que buscam controlar a qualidade do leite UHT, como o “Programa de Monitoramento da Qualidade do Leite Longa Vida” lançado pela Associação Brasileira da Indústria de Leite Longa Vida em 2008 (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DA INDÚSTRIA DE LEITE LONGA VIDA, 2009).
O período no qual o produto ainda é aceito pelo consumidor e não apresenta risco à saúde pública é conhecido como vida de prateleira (shelf life). Dependendo do produto, o fim deste período deve-se ao desenvolvimento microbiológico e às alterações sensoriais. A utilização de tratamentos térmicos intensos, como o que ocorre no processo UHT, pode ocasionar alterações físico-químicas e sensoriais e a consequente rejeição deste produto pelos consumidores (ASIA PACIFIC FOOD INDUSTRY, 1997). Outros fatores que alteram a qualidade do leite longa vida e seu shelf life são a qualidade da matéria-prima, os parâmetros de processo, o sistema de embalagem e a estocagem (SCHMIDT; CROMIE; DOMMETT, 1989).
A ação microbiológica no leite é um dos principais fatores que ocasionam a sua deterioração. Os micro-organismos psicrotróficos, durante o seu desenvolvimento, produzem enzimas termorresistentes, as quais irão degradar o leite UHT durante o armazenamento. As espécies do gênero Pseudomonas são as mais comumente deterioradoras de produtos lácteos. Suas lípases irão provocar o aparecimento de sabor e aroma de ranço, e suas proteases irão hidrolisar as proteínas, diminuindo a estabilidade do leite (FORSYTHE, 2002; SILVA et al., 2010).
Outra deterioração relacionada ao leite UHT é a deterioração tipo flat-sour ocasionada por Geobacillus stearothermophilus, resultando na redução do pH sem estufamento. Este micro-organismo é capaz de hidrolisar a caseína, sendo seus esporos extremamente resistentes ao calor. Esta deterioração geralmente é devido ao resfriamento lento ou estocagem em altas temperaturas (SILVA et al., 2010).
Diante do exposto, os objetivos deste trabalho foram determinar a resistência térmica dos esporos de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 e Geobacillus stearothermophilus IAL2128 e avaliar a eficiência microbiológica de binômios não convencionais de tratamento térmico para leite e os efeitos destes nos parâmetros de qualidade e estabilidade de leite longa vida, bem como a viabilidade do uso de embalagem flexível em um sistema asséptico piloto.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Leite UHT
A produção leiteira tem sólida tradição no Brasil, ocupando a quarta posição entre os agronegócios de maior destaque no cenário econômico nacional. Os anos 90 recebem destaque quando se coloca em pauta o desenvolvimento do setor lácteo brasileiro, e um dos fatos em destaque, o qual colaborou com o aumento da produção, foi a inserção do leite UHT na dieta diária do brasileiro (SIQUEIRA et al., 2010). Além da implantação do Plano Real, o qual aumentou o poder de compra do consumidor, outra justificativa ao incremento nas vendas deste produto esta em sua conveniência, praticidade e possibilidade de estocagem em temperatura ambiente (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DA INDÚSTRIA DE LEITE LONGA VIDA, 2010; SIQUEIRA et al., 2010). Até 1996 as vendas de leite pasteurizado ultrapassavam as de leite longa vida, porém no ano seguinte este cenário se inverteu, e em 2011 as vendas de leite UHT representaram 78,2% das vendas de leite fluído no Brasil. Nos últimos 20 anos o leite longa vida passou de um volume anual aproximado de 450 milhões de litros para 6 bilhões de litros no ano de 2012 (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DA INDÚSTRIA DE LEITE LONGA VIDA, 2011, 2013).
O regulamento técnico de identidade e qualidade do leite UHT o define como, leite homogeneizado tratado a 130-150°C por 2-4 segundos, através de processo térmico de fluxo contínuo, resfriado logo em seguida em temperaturas abaixo de 32°C, envasado assepticamente em embalagens fechadas hermeticamente. O mesmo regulamento cita que o leite longa vida deve apresentar aspecto líquido, cor branca, odor e sabor característicos e sem sabores estranhos, acidez em ácido lático de 0,14 - 0,18 g de ácido lático/100 mL e estabilidade ao etanol 68% (v/v) (BRASIL, 1996).
Durante o teste de esterilidade comercial, após incubação a 35-37°C por 7 dias, o leite UHT não deve sofrer alterações que modifiquem a embalagem como, por exemplo, o estufamento, devendo ser estável ao etanol 68%, e sua acidez não deve variar mais que 0,02 g de ácido lático/100 mL, em relação à acidez antes da incubação, e não deve ter as características sensoriais alteradas (BRASIL, 1996).
O tratamento térmico pode ocorrer por aquecimento direto ou indireto. No sistema UHT por aquecimento direto há contato entre o meio de aquecimento e o produto a ser processado, através da injeção de vapor culinário e homogeneizado. Já no sistema UHT por aquecimento indireto as trocas térmicas ocorrem em trocadores de calor a placas ou tubulares onde não há contato com o meio de aquecimento, que pode ser água ou vapor superaquecido (LEWIS, 1986).
Comparando as alterações do leite UHT durante o seu processamento nos dois sistemas mencionados acima, verifica-se maior eficácia na conservação de parâmetros de qualidade no leite UHT produzido pelo sistema direto. No sistema direto a carga total de calor é menor que no sistema indireto, isto resulta em menos alterações nas características físico-químicas do leite e menor sabor “cozido”. Além disso, no sistema indireto a concentração de oxigênio no produto final é maior, o que reduz a estabilidade de algumas vitaminas, e intensifica as alterações de sabor ocasionadas pelos processos de oxidação durante a estocagem (TETRA PAK, 2010).
Na especificação asséptica para esterilização comercial de produtos de baixa acidez, o Codex Alimentarius (1993) recomenda que o processo térmico para produtos de baixa acidez seja estabelecido de acordo com os seguintes fatores críticos: microbiota, incluindo Clostridium botulinum e micro-organismos
deteriorantes; composição e formulação do produto; nível e tipo de conservante; pH de equilíbrio; atividade de água; provável temperatura de estocagem do produto.
2.2. Fatores que afetam a estabilidade do leite UHT
O período conhecido como vida de prateleira é aquele no qual a conservação do alimento é mantida, em determinadas condições de estocagem, com poucas alterações as quais são conhecidas, controladas e consideradas aceitáveis pela legislação, produtores e consumidores (VITALI; QUAST, 1996).
Segundo Cromie (1991), há cinco fatores principais os quais afetam este período: qualidade microbiológica do leite cru, tratamento térmico, recontaminação do produto processado, presença de micro-organismos termorresistentes, temperatura de estocagem e/ou distribuição. E de acordo com Padula (1996) o sistema de embalagem utilizado possui influencia direta na estabilidade dos alimentos.
2.2.1. Sistema de embalagem
O sistema de embalagem tem papel fundamental na manutenção da qualidade do alimento durante sua vida de prateleira. Em leite UHT a presença de oxigênio e exposição à luz ocasiona perdas nutricionais e alterações sensoriais (MANZI; PIZZOFERRATO, 2012). Portanto, faz-se necessário a aplicação de embalagens que possuam suficiente barreira para a conservação do produto.
O uso de estruturas multicamadas co-extrusadas com etileno vinil álcool (EVOH) como barreira ao oxigênio possuem ótimo desempenho, mas devido à sensibilidade do EVOH à umidade, o que ocasiona modificações em suas propriedades de barreira, costuma-se usar este copolímero como camada interna, devendo ser protegido da umidade com camadas de poliolefinas, pois estas possuem barreira a gases independente da umidade relativa (PADULA, 1996).
Outro fator crítico que altera a estabilidade do leite UHT é a oxidação ocasionada pela luz (BOSSET; SIEBER; GALLMANN; 19951 citados por WALTER, 2010, p.110), devido a isso a determinação da transmissão de luz pela embalagem torna-se de extrema importância, permitindo selecionar materiais que reduzam esta transmissão. O uso de pigmentos coloridos é uma das opções a serem adotadas para alcançar este tipo de barreira (PADULA, 1996).
2.2.2. Qualidade microbiológica do leite in natura
Segundo Burton (1986), o leite in natura apresenta, normalmente, uma microflora mista originária de diversas fontes, como a do interior do úbere, da superfície externa do animal e da superfície dos equipamentos de ordenha (ordenhadeiras, tubulações e tanques).
Para Vatne e Castberg (1991), o leite in natura deverá ter boa qualidade e apresentar contagem total de micro-organismos mesófilos aeróbios menor que 105 UFC/mL, contagem de termodúricos menor que 103 UFC/mL e contagem de esporos aeróbicos menor que 10 UFC/mL, sendo que a contagem de micro-organismos termodúricos tem influência maior se o produto for distribuído em temperaturas altas. A qualidade microbiológica do leite in natura tem influência no aumento da vida de prateleira do produto (VIANNA, 2010), uma vez que tem sido constatado que um número inicial de micro-organismos termorresistentes em leite in natura afeta a vida de prateleira do leite UHT (CROMIE, 1991). A seguir estão apresentados os aspectos microbiológicos mais críticos para o leite longa vida.
2.2.2.1. Bactérias Psicrotróficas
Micro-organismos psicrotróficos são aqueles que crescem em alimentos sob-refrigeração, porém possuem temperatura ótima acima de 20°C. Dentre os deterioradores de produtos lácteos estão as Pseudomonas spp. (as mais
1
BOSSET, J.O.; SIEBER, R.; GALLMANN, P.U. Light transmittance: influence on the shelf life of milk and milk products. Bulletin of the International Dairy Federation, n. 300, p. 19-39, 1995.
freqüentes), Flavobacterium, Alcaligenes, Acinetobacter, Klebsiella, Bacillus e Lactobacillus (SILVA et al., 2010).
A reduzida qualidade do leite cru é uma freqüente conseqüência da proliferação e atividades metabólicas de bactérias psicrotróficas. Apesar de serem efetivamente destruídas pelo tratamento térmico, algumas espécies durante seu crescimento no leite cru podem produzir enzimas lipolíticas e proteolíticas. Estas enzimas não são inativadas no processamento e degradam gradualmente as proteínas e lipídeos do leite, ocasionando o aparecimento de odores e reduzindo a vida de prateleira de produtos lácteos (ANGELIDIS, 2014). As lípases atuam sobre os triglicerídeos do leite produzindo ácidos graxos livres (AGL) de cadeias médias e curtas. O aumento no nível de AGL de cadeia curta promove o aparecimento de sabor e aroma de ranço. As proteases hidrolisam as proteínas do leite, liberando peptídeos hidrofóbicos, ocasionando o aparecimento de gosto amargo no leite (FORSYTHE, 2002).
Numerosas publicações têm enfatizado a importância da qualidade microbiológica inicial do leite cru na qualidade do produto final (ANGELIDIS, 2014). Leites produzidos a partir de matérias-primas com alta contagem de psicrotróficos são mais suscetíveis à gelificação do que aqueles produzidos com matérias-primas com baixa contagem. Law; Andrews; Sharpe (1977) verificaram que quando a contagem de Pseudomonas fluorescens no leite cru era menor que 8x106 UFC/mL, a gelificação do leite UHT iniciava-se com mais de 140 dias de estocagem, e quando a contagem era de 5x107 UFC/mL este tempo passava a ser de aproximadamente 12 dias. Segundo o mesmo autor, o uso de matéria-prima de alta qualidade é o fator mais importante para alcançar um leite UHT com longa vida de prateleira.
O fenômeno de gelificação durante o armazenamento ocorre devido aos processos físico-químicos ou devido à ação de enzimas. As proteases de psicrotróficos induzem o início do fenômeno da gelificação, devido a sua capacidade de degradar as caseínas e promover agregação das micelas. Este fenômeno é um fator crítico, o qual reduz a vida de prateleira do leite UHT, ocasionando o aumento de sua viscosidade durante a estocagem, podendo chegar a ocorrer até a formação de gel (CUNHA, 2001).
2.2.2.2. Geobacillus stearothermophilus
O gênero Bacillus é uma grande e diversificada coleção de bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas, na forma de bastonetes Gram positivos ou Gram variáveis e esporuladas (MADIGAN; MARTINKO; PARJER, 2002). Este gênero passou por considerável reclassificação decorrente dos avanços em biologia molecular que revelou uma alta heterogeneidade filogenética. O gênero Bacillus é dividido em seis grupos, o quinto grupo corresponde aos termófilos, no qual se verificou alta similaridade. Como conseqüência em 2001 as bactérias termófilas pertencentes ao grupo genético cinco foram reclassificadas como membros do novo gênero Geobacillus, com o Bacillus stearothermophilus sendo designado como uma das espécies deste gênero (MCMULLAN et al., 2004).
O Geobacillus stearothermophilus é um micro-organismo termofílico estrito, com temperatura ótima de 55-65°C, mas podem crescer à temperatura de 37-70°C, podendo tolerar pH entre 6 – 8,6 (SILVA et al., 2010; ZEIGLER, 2001). Este micro-organismo é um flat-sour típico, ou seja, é produtor de acidez plana, que consiste na formação de ácido lático a partir da glicose, mas sem formar gás, impedindo que a deterioração seja percebida pelo estufamento da embalagem, já que este fenômeno não ocorre (MASSAGUER, 2005).
Seus esporos são altamente resistentes, apresentando um valor D121,1°C
de 4 – 5 minutos e valor Z entre 7,8 – 12,2°C. O valor D corresponde ao tempo, a uma dada temperatura, necessário para reduzir um ciclo logarítmico no total de esporos, e o valor Z indica o incremento na temperatura para que ocorra a redução de um ciclo logarítmico no valor D. Estes esporos também são resistentes aos produtos químicos, tornando-se um problema durante a higienização da linha de processo (SILVA et al., 2010; ZEIGLER, 2001).
Devido à alta resistência de seus esporos, o G. stearothermophilus é utilizado como micro-organismo teste para validar a efetividade de alguns processos de esterilização (BERNARD, 1983; MASSAGUER, 2005; NELSON, 2010). A Tabela 1 mostra os micro-organismos testes para sistemas assépticos.
Tabela 1 - Micro-organismos testes para sistemas assépticos.
Meio de esterilização Micro-organismo
Vapor superaquecido G. stearothermophilus
Calor seco G. stearothermophilus
H2O2 + calor B. subtilis A
H2O2 + ultravioleta B. subtilis A
Calor de formação G. stearothermophilus
Radiação Gama B. subtilis A
Calor úmido G. stearothermophilus
Fonte: BERNARD, 1983; MASSAGUER, 2005; NELSON, 2010.
2.2.2.3. Microbiologia Preditiva
O crescimento de micro-organismos pode ser influenciado por uma série de fatores, os quais podem ser analisados através de uma importante ferramenta que são os modelos matemáticos gerados e utilizados pela microbiologia preditiva, que associam a quantificação de micro-organismo em alimentos e a tentativa de prever o seu comportamento, quando variáveis controladas de crescimento são utilizadas e/ou alteradas. O desenvolvimento de um modelo matemático passa pelos estágios de planejamento, coleta e análise de dados, descrição matemática, validação e manutenção (NAKASHIMA; ANDRÉ; FRANCO, 2000).
Em estudos de cinética microbiológica os dados são geralmente coletados em condições ambientais controladas e somente os principais fatores, como o pH do meio, concentrações de sal ou açúcar, atividade de água ou presença de compostos antimicrobianos, exercem papel de importância na cinética de crescimento (PELEG; CORRADINI, 2011). Segundo Nakashima, André e Franco (2000), durante a etapa de planejamento deverá ser decidido quais dos fatores serão considerados, bem como o tipo de cepa estudada, e qual será o sistema experimental (laboratorial ou o próprio alimento). E a coleta de dados pode ser direta (ex. contagem em placas), ou indireta (ex. turbidimetria e condutividade).
No nível primário, os modelos descrevem a mudança do número de micro-organismos em função do tempo, gerando uma curva padrão de crescimento microbiológico. O nível secundário descreve como as respostas dos modelos primários mudam quando ocorrem alterações nos fatores ambientais considerados (temperatura, pH, atividade de água, etc.) (HALDER et al., 2010).
Após a determinação do relacionamento entre a contagem de células e o tempo, os dados são ajustados em um modelo de crescimento matemático (PELEG; CORRADINI, 2011) e em seguida deve ser realizada a validação, que é uma etapa essencial, na qual o modelo gerado será avaliado com base no quanto os resultados preditos coincidem com os fenômenos observados (HALDER et al., 2010).
Na validação, é avaliada a habilidade do modelo em prever novas situações, como por exemplo, através da comparação entre dados de comportamento do micro-organismo em estudo, presente em alimentos submetidos às condições reais de estocagem e distribuição, e os valores previstos pelo modelo ajustado (NAKASHIMA; ANDRÉ; FRANCO, 2000). De acordo com os mesmos autores, a manutenção consiste na criação de um procedimento para que o modelo, depois de validado e implantado na prática, seja mantido e para que seja reconhecido quando este vier a se tornar obsoleto.
Após o desenvolvimento de um modelo preditivo, este pode ser usado para auxílio na explicação de comportamentos microbianos, desenvolvimento de novos produtos, em controle de qualidade, avaliação de risco e previsão de segurança e também no auxílio ao estabelecimento de procedimentos de higienização para o controle da formação de biofilmes (NAKASHIMA; ANDRÉ; FRANCO, 2000).
2.3. Modificações no leite UHT
2.3.1. Proteínas
São os componentes do leite mais afetados durante o processamento e na estocagem, em especial as proteínas do soro. As modificações neste constituinte provocam o aparecimento de problemas tecnológicos no leite UHT, como: off-flavor,
gelificação, sedimentação, incrustações na superfície dos equipamentos, perda de valor nutricional e escurecimento, devido à reação de Maillard (FOX; MCSWEENEY, 1998).
Abaixo segue esquema simplificado dos principais caminhos para desestabilização das proteínas no leite e produtos lácteos.
Figura 1 - Principais caminhos para desestabilização das proteínas no leite e produtos lácteos.
Legenda: A: rápido para leite (leite evaporado); B1: rápido para leite, se a atividade da plasmina estiver alta (não para leite evaporado); B2: rápido para leite, se a atividade da plasmina estiver moderada (não para leite evaporado); C: muito lento para leite UHT, rápido para leite UHT evaporado; D: Lento para todos os produtos, exceto se a esterilização produziu grandes partículas proteicas. (Fonte: FOX; MCSWEENEY, 2003).
Diversas mudanças físicas e químicas ocorrem nas proteínas do soro durante o processamento térmico do leite, e estas mudanças (desnaturação) afetam a funcionalidade e propriedades sensoriais do leite, ocasionando a formação de complexos protéicos entre a β-lactoglobulina e a k-caseína, com conseqüente modificação da estabilidade térmica. Em certas condições de concentração e pH, a β-lactoglobulina fica apta para a formação de gel (MANZI; PIZZOFERRATO, 2012). A ocorrência de sedimentação em leite longa vida está relacionada com a desestabilização das micelas de caseína, e quanto maior for o tempo e temperatura de aquecimento e/ou estocagem maior será a formação de sedimentos (KELLY; DATTA; DEETH, 2012).
Durante a estocagem de leite UHT, um dos principais problemas limitante da vida de prateleira é a ocorrência de gelatinização, a qual é ocasionada pelas modificações de micelas de caseína agregadas. O mecanismo não é completamente conhecido, mas provavelmente é devido à proteólise induzida por proteinases termoressistentes nativas (plasmina) ou de origem microbiana (KELLY; DATTA; DEETH, 2012).
2.3.2. Qualidade Sensorial
As características sensoriais do leite são influenciadas por fatores como a qualidade da matéria-prima, o tipo de processamento e as condições de estocagem, os quais irão influenciar a ocorrência de reações de degradação, ocasionando o aparecimento de odores e sabores desagradáveis (TETRA PAK, 2010; WATSON; MCEWAN, 1995).
A coloração do leite UHT é influenciada por sua composição, distribuição e tamanho de suas partículas e ocorrência da reação de Maillard. Sua coloração mais branca, quando comparado ao leite in natura, é devido à desnaturação das proteínas do soro e a agregação destas com a caseína. O atributo cor não é limitante na aceitação do leite (HOLDSWORTH; RICHARDSON, 1992), contudo, alguns consumidores conseguem perceber alterações na coloração (MENDONÇA, 20092 apud CARDOSO, 2011, p. 32).
O atributo que mais limita a aceitação do leite UHT é o sabor (DUNKLEY; STEVENSON, 1987). O leite pode ser classificado de excelente, quando não apresenta defeitos, à invendível quando apresenta sabor ácido e ranço pronunciados (NELSON; TROUT, 1964). Tais características são influenciadas pelas propriedades do leite, intensidade do tratamento térmico, tipo de equipamento, sistema de embalagem, concentração de oxigênio e tempo e temperatura de estocagem (DUNKLEY; STEVENSON, 1987).
2
3. MATERIAL E MÉTODOS
Os testes de resistência térmica dos esporos foram realizados no Laboratório de Microbiologia e os processamentos foram executados na Planta Piloto de Sistemas Assépticos do Departamento de Tecnologia de Alimentos da Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).
3.1. Produção da suspensão de esporos de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 e Geobacillus stearothermophilus IAL2128
Foram produzidos dois lotes de suspensão de esporos de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953, provenientes da Coleção de Culturas Tropicais da Fundação Tropical de Pesquisa e Tecnologia André Tosello, Campinas-SP e um lote de suspensão de esporos de Geobacillus stearothermophilus IAL2128, provenientes do Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL – Campinas, SP). Para todos os lotes, primeiramente foi efetuada uma pré-esporulação do Geobacillus stearothermophilus a fim de obter células bacterianas novas. O G. stearothermophilus foi inoculado em tubos de ensaios inclinados contendo meio Ágar nutriente com 5 mg/L de sulfato de manganês, para aumentar a resistência dos esporos ao aquecimento, e incubados a 55°C por 8 dias. Previamente os tubos, já contendo o meio, foram esterilizados em autoclave a 121°C/30min. Durante este período foram preparadas garrafas de vidro destinadas à esporulação. Garrafas de 500 mL com gargalos largos foram preenchidas com 100 mL de meio Ágar nutriente com 5 mg/L de sulfato de manganês, esterilizadas em autoclave a 121°C/30min e inclinadas até a solidificação do meio. Efetuou-se o choque de ativação dos esporos produzidos na pré-esporulação a 100°C por 5 minutos. As cepas de Geobacillus stearothermophilus foram inoculadas nas garrafas, e estas foram incubadas inclinadas a 55°C por 30 dias. Completada a esporulação, os esporos foram coletados e lavados com água estéril, filtrados em gaze estéril e centrifugados a 10.000 rpm a 4°C por 10 minutos, e após o descarte do sobrenadante o processo de centrifugação foi repetido. Este
procedimento foi efetuado três vezes. Após a purificação, efetuou-se a contagem da suspensão e armazenou-se a mesma a 2-4°C (PFLUG, 1988).
3.2. Teste de Resistência Térmica dos Esporos de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 e Geobacillus stearothermophilus IAL2128.
Os testes de resistência térmica das suspensões de G. stearothermophilus ATCC7953 e G. stearothermophilus IAL2128 seguiram o método dos tubos capilares proposto por Stumbo (1973) e Pflug (1990). O meio de aquecimento utilizado nos experimentos foi leite tipo A esterilizado a 121°C/10 min., e os binômios aplicados foram os apresentados na Tabela 2 (G. stearothermophilus ATCC7953) e na Tabela 3 (G. stearothermophilus IAL2128).
Tubos capilares estéreis (75 mm x 1 mm x 1,5 mm) eram preenchidos com o meio de aquecimento inoculado com os esporos de G. stearothermophilus. Foram utilizadas aproximadamente 20 unidades de capilares preenchidos para cada tempo de ensaio, e após o preenchimento os tubos eram selados com maçarico e colocados em banho termostático de óleo nas temperaturas e tempos apresentados nas Tabelas 2 e 3. Para a contagem da população inicial (N0) do meio de
aquecimento inoculado com os esporos seguiu-se o procedimento descrito no item 3.7.3. (Contagem de esporos de termófilos aeróbios totais e flat-sour), realizando o choque térmico de ativação (100°C/5minutos) antes da inoculação em meio Ágar Dextrose Triptona (DTA, DifcoTM, Lawrence, EUA) (OLSON; SORRELLS, 2001).
Na contagem de sobreviventes, após cada tempo e temperatura de aquecimento (Tabela 2 e 3), os tubos foram retirados do banho de óleo, resfriados em banho de gelo e higienizados com solução de etanol 70%. Os tubos foram abertos assepticamente em câmara de fluxo laminar, e após as diluições decimais seriadas, efetuou-se plaqueamento em gotas (“drop plate”) em meio Ágar Dextrose Triptona (DTA, DifcoTM, Lawrence, EUA), e incubação a 55°C por 48 horas. Os
Tabela 2 - Temperatura e tempos aplicados no teste de resistência térmica dos esporos de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953.
Temperatura Tempos
Experimento I 121°C 0; 2; 3; 4 e 5 minutos
Experimento II 125°C 0; 0,5; 1; 1,5 e 2,5 minutos Experimento III 127°C 0, 30, 45, 60 e 75 segundos
Tabela 3 - Temperatura e tempos aplicados no teste de resistência térmica dos esporos de Geobacillus stearothermophilus IAL2128.
Temperatura Tempos
Experimento I 121°C 0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 minutos
Experimento II 125°C 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 e 215 segundos Experimento III 127°C 0, 30, 45, 60, 75, 90, 115 e 120 segundos Experimento IV 130°C 0, 12, 23, 35, 46, 58, 70, 82 segundos
Experimento V 135°C 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18 segundos
3.3. Matéria-Prima
Os processamentos foram realizados com leite cru tipo A (processos 131112 e 240114) e leite pasteurizado tipo A (processos 070714 e 040315), provenientes da granja leiteira Fazenda Atibainha, Itatiba-SP. A caracterização da matéria-prima foi realizada através da determinação de sua acidez titulável, concentração de íons de hidrogênio (BRASIL, 2006), contagem total de aeróbios mesófilos em placas (LAIRD et al., 2004; MORTON, 2001), contagem de aeróbios psicrotróficos (COUSIN; JAY; VASAVADA, 2001; FRANK; YOUSEF, 2004), contagem de esporos de termófilos aeróbios totais e flat-sour (OLSON; SORRELLS, 2001), proteólise (CHURCH et al., 1983), viscosidade e cor instrumental (CIELAB).
À matéria-prima foi adicionado citrato de sódio (Na3C6H5O7) 0,1% (p/v)
(CARDOSO, 2011) e inoculada com esporos de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953, da Coleção de Culturas da Fundação André Tosello e Geobacillus stearothermophilus IAL2128, da Coleção de Culturas do Instituto de Tecnologia de
Alimentos (ITAL), como descrito no item 3.4. (Processamento), a fim de estudar os binômios de tempo e temperatura para inativação dos mesmos.
3.4. Processamento
Os estudos foram divididos em duas partes. Foram avaliados diversos binômios de tempo e temperatura para a inativação de esporos de Geobacillus stearothermophillus ATCC7953 e de Geobacillus stearothermophilus IAL2128, como descrito no item 3.2. (Teste de resistência térmica dos esporos de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 e Geobacillus stearothermphilus IAL2128). No primeiro processamento (131112) foram inoculados 5,5x105 esporos/mL de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953, e o leite foi processado a 140°C/54 segundos, sendo que neste leite não houve acompanhamento durante a estocagem. Na análise da estabilidade do leite UHT foram utilizados os seguintes binômios: 139±3°C/87,5 segundos (Processo 240114); 136±3°C/49,5 segundos (Processo 070714) e 138±1°C/51,5 segundos (Processo 040315). Nos lotes 240114 e 070714 não houve inoculação de esporos de Geobacillus stearothermophilus, no lote 040315 houve inoculação de 104 esporos/mL de Geobacillus stearothermophilus IAL2128.
As amostras coletadas na primeira fase do estudo foram avaliadas imediatamente a partir de análises físico-químicas (pH) (BRASIL, 2006) e microbiológicas (contagem de esporos de termófilos aeróbios totais e flat-sour) (OLSON; SORRELLS, 2001). No estudo da vida de prateleira foram realizados testes de esterilidade comercial (BRASIL, 2001; DEIBEL; JANTSCHKE, 2001; DENNY; PARKINSON, 2001), análises de acidez titulável, determinação da concentração de íons de hidrogênio, proteólise (CHURCH et al., 1983), sedimentação, viscosidade, cor instrumental (CIELAB). Neste período as amostras foram armazenadas à temperatura ambiente. O teste de esterilidade comercial foi realizado logo após o processo (tempo zero) e as análises físico-químicas realizadas nos tempos 0, 30, 60, 90 e 120 dias.
Os componentes da linha de processamento foram: tanque de matéria-prima (Osmec Industrial Ltda., Campinas - SP); válvulas borboleta; bomba centrífuga
(Fabo Bombas e Equipamentos Ltda., Curitiba - PR); homogeneizador de pistão com dois estágios (Alitec Comércio e Indústria Ltda., Pindamonhangaba - SP), trocador de calor a placas (Sumá Indústria e Comércio Ltda., Campinas - SP) com tubo de retenção, sensor de temperatura tipo termorresistência PT100 e válvula êmbolo de desvio de fluxo (para o tanque de matéria-prima ou para a linha asséptica); manômetro; placa com orifício e máquina de embalagem tipo forma, enche e fecha (Sumá Indústria e Comércio Ltda., Campinas – SP).
Os parâmetros utilizados nos processos são apresentados na Tabela 4 e o fluxograma do processo está apresentado na Figura 2.
Tabela 4 - Parâmetros dos processamentos.
Parâmetros
Processos
240114 070714 040315
Temperatura média (°C) 139±3 136±3 138±1
Tempo de retenção (segundos) 87,5 49,5 51,5
Vazão (L/h) 218 266 256
Pressão de Homogeneização (kgf/cm2) 200 155 205
Figura 2 - Fluxograma de produção de leite UHT em embalagens multicamadas flexível. (*As matérias-primas dos processos 131112 e 040315 foram inoculados com esporos de G. stearothermophilus. Nos processos 240114 e 070714 não houve inoculação de esporos).
3.4.1. Higienização da Linha de Processamento
A linha de processamento e envase asséptico foi preparada através de higienização CIP (Cleaning in Place). Tal sistema consistiu na limpeza e desinfecção dos equipamentos sem que houvesse a necessidade do desmonte dos equipamentos, através da circulação de soluções químicas (FORNI, 2007). Neste projeto foram utilizados os seguintes produtos: detergente alcalino forte para sistema CIP Ultralab Clean 690 (Larkin Brasil Ltda., Barueri – SP), à base de hidróxido de sódio; detergente ácido para sistema CIP Ultralab Clean 110 (Larkin Brasil Ltda., Barueri - SP), à base de ácido nítrico e ácido fosfórico; desinfetante à base de ácido peracético Ultralab Saniper 15 (Larkin Brasil Ltda., Barueri – SP), preparado a partir de ácido peracético e peróxido de hidrogênio.
Depois de realizado o pré-enxague à temperatura ambiente, foi efetuada a lavagem com o detergente alcalino a 2% (p/v) a 95°C/40 min. Após um enxague intermediário a 55°C/10 min., procedeu-se a limpeza com o detergente ácido a 1% (p/v) a 55°C/40 min., seguido de outro enxague a 55°C/20 min. A esterilização da linha (Sterilization in Place – SIP) foi através da circulação da solução do desinfetante à base de ácido peracético a 0,3% (v/v) a 30°C/30 min. Efetuou-se o enxague final em temperaturas acima de 140°C por 15 min (CARDOSO, 2011).
Figura 3 – Linha de processo e envase asséptico
1 - tanque de matéria-prima; 2 – trocador de calor; 3 – tanque de produto; 4 – bomba centrífuga; 5– válvula; 6 – embaladora (FONTE: WALTER, 2010).
3.5. Material da Embalagem
O leite processado foi acondicionado em um laminado multicamada flexível especial para leite UHT, composto por polietileno de baixa densidade (PEBD) co-extrusado com etileno vinil álcool (EVOH) e carvão ativado, além de uma camada interna pigmentada de preto (Dixie-Toga Ltda., São Paulo – SP). Neste sistema de embalagem a poliolefina possibilita a termossoldagem da embalagem, o copolímero EVOH tem como função a barreira ao oxigênio e a camada interna escura protege o leite contra radiação ultravioleta e luz visível.
A caracterização da embalagem foi feita a partir da determinação da transmitância à luz e radiação ultravioleta, segundo norma da ASTM D1003/00, em espectro de transmitância de 200 a 800 nm executada em espectrofotômetro Beckman Coulter DU 800 a 120nm/min. A medição da espessura foi segundo metodologia ASTM D4166/99, em micrômetro Mitutoyo Absolute 12,7-0, 001 mm (Mitutoyo Corp., Utsunomiya – Japão). A determinação da taxa de permeabilidade ao oxigênio foi pelo método coloumétrico ASTM D3985/05 e ASTM F1927/07, no equipamento OX-TRAN 2/61 MJ (Modern Company Inc. – MOCON).
3.5.1. Higienização da Embalagem
A esterilização das embalagens foi efetuada por imersão em solução de peróxido de hidrogênio 10% (v/v) a 60 ± 2 °C por 15 s e exposição à radiação ultravioleta de 260 µW/cm2 em 254 nm por pelo menos 5,0 s, emitida por lâmpada TUV 15W T5 (Philips do Brasil Ltda., São Paulo - SP), instalada à distância de 10 mm do filme (WALTER, 2010).
3.6. Análises Físico-químicas
3.6.1. Proteólise
O nível da atividade proteolítica da matéria-prima e dos tempos 0, 30, 60, 90 e 120 dias foi estabelecido seguindo o método descrito por Donkor et al. (2007), em triplicata, expressando a atividade proteolítica como a absorbância dos grupos aminoácidos livres a 340 nm.
Misturou-se 5 mL de amostra a 10 mL de solução de ácido tricloroacético 0,75N (TCA - Synth, Diadema, Brasil), e em seguida efetuou-se a filtragem da mistura em papel qualitativo (Whatman, Inglaterra). O filtrado ficou sob-refrigeração até o momento da análise. Neste intervalo foi preparado o reagente OPA (o-ftaldialdeído), através da pesagem direta em balão volumétrico (50 mL) de 0,9 g de tetraborato de sódio (Casa da Química, Diadema, Brasil) e 0,5g de dodecil sulfato de sódio (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil), adicionando-se aproximadamente 35 mL de água deionizada e deixando-se a mistura em banho de ultrassom por cerca de 30 minutos a fim de solubilizar os reagentes. Após a solubilização foi adicionado 40 mg de o-ftaldialdeído previamente solubilizado em 1mL de metanol e 100 µL de β-mercapetanol, completando-se o volume com água deionizada. A solução foi armazenada em frasco âmbar até o momento do uso (CHURCH et al., 1983). O procedimento foi realizado ao abrigo de luz em capela de exaustão. Anteriormente à leitura, 3 mL de reagente OPA foram adicionados em 150 µL do filtrado e deixados para reagir por 2 minutos; logo em seguida efetuou-se a leitura da absorbância em espectrofotômetro a 340 nm (Beckman, modelo DU-70). Utilizou-se a mistura de
ácido tricloroacético (150µL) e reagente OPA (3mL), isento de amostra, para calibrar o espectrofotômetro.
3.6.2. Quantificação dos sedimentos
A determinação da sedimentação seguiu os procedimentos de Ramsey e Swartzel (1984) modificado por Silva (2003), adaptado para a embalagem utilizada nesta pesquisa. A embalagem foi completamente aberta, cortando-se uma das soldas horizontais, após escoar o leite cuidadosamente, a embalagem foi invertida e mantida nesta posição por 10 minutos. Após este período, as laterais foram cortadas até a embalagem ficar plana. Após 48 horas secando em temperatura ambiente com a face interna voltada para cima, as embalagens foram pesadas e efetuou-se a raspagem dos sedimentos e lavagem com água destilada. Após mais 24 horas de secagem em temperatura ambiente as embalagens foram pesadas e a sedimentação foi obtida pela diferença entre as pesagens.
3.6.3. Viscosidade
A viscosidade durante o período de estocagem foi determinada, em triplicata, em reômetro de tensão controlada AR2000ex, TA Instruments, USA, em temperatura ambiente constante (25°C), usando um sistema Peltier e geometria do tipo cilindros concêntricos com 28 mm de diâmetro e 42 mm de comprimento.
3.6.4. pH
A medição da concentração de íons de hidrogênio foi efetuada, em triplicata, diretamente em 50 mL de amostra pelo processo eletrométrico, através de potenciômetro com duas casas decimais de precisão previamente calibrado (pHmetro Digimed modelo DM-20, Digicrom Analítica Ltda., Santo Amaro – SP) (BRASIL, 2006; ZENEBON; PASCUET; TIGLEA, 2008).
3.6.5. Acidez Titulável
Determinou-se a acidez através da titulação de 10 mL da amostra com solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0,111 N (Êxodo Científica, Hortolândia, Brasil), usando como indicador 5 gotas de solução de fenolftaleína (C20H14O4) a 1%
(m/v), até o aparecimento de coloração rósea persistente por cerca de 30 segundos expressa em graus Dornic (1°D corresponde a 0,1 g de ácido láctico/L) (BRASIL, 2006). As análises foram realizadas em triplicata.
3.6.6. Cor Instrumental
As variações na coloração das amostras foram avaliadas por refletância, a partir dos valores de b* determinado no sistema CIELAB 1976 (L*, a*, b*) em colorímetro Hunterlab ColorQuest II, com iluminante D65, e ângulo de observação de 10°. As amostras com excessiva coagulação foram medidas em espectrofotômetro CM-5 (Konica Minolta) no sistema CIELAB, por absorbância, com iluminante D65 e ângulo de observação 10°. As análises foram realizadas em triplicata.
O espaço de cores CIE 1976 (L*, a*, b*) é uma forma tridimensional de representar a cor a partir de coordenadas cartesianas. A axial L* refere-se à luminosidade, a coordenada a* varia do esverdeado ao avermelhado, enquanto que a coordenada b* varia do azulado ao amarelado (MORITZ, 2011).
3.7. Análises Microbiológicas
3.7.1. Contagem total de aeróbios mesófilos em placas
Esta análise foi realizada na matéria-prima e no leite recém processado destinado ao estudo de vida de prateleira. As embalagens foram higienizadas, homogeneizadas e abertas assepticamente em câmara de fluxo laminar. Coletou-se
1 mL de leite, o qual foi adicionado em 9 mL de diluente (solução de peptona 0,1% (p/v)) para obter a diluição 10-1, e seguiu-se com as diluições seriadas até a diluição 10-4. A contagem foi realizada através do plaqueamento em profundidade de 1 mL de cada diluição em meio Ágar Padrão para Contagem (PCA, Oxoid Brasil Ltda., São Paulo, Brasil) e incubação a 32±1°C/48±2h (LAIRD et al., 2004; MORTON, 2001). Para cada processo foram analisadas dez amostras em duplicata.
3.7.2. Contagem de aeróbios psicrotróficos
Esta análise foi realizada na matéria-prima e no leite recém processado destinado ao estudo de vida de prateleira. As embalagens foram higienizadas, homogeneizadas e abertas assepticamente em câmara de fluxo laminar. Coletou-se 1 mL de leite, o qual foi adicionado em 9 mL de diluente (solução de peptona 0,1% (p/v)) para obter a diluição 10-1, e seguiu-se com as diluições seriadas até a diluição 10-4. A contagem foi realizada através do plaqueamento em profundidade de 1 mL de cada diluição em meio Ágar Padrão para Contagem (PCA, Oxoid Brasil Ltda., São Paulo, Brasil) resfriado a 45±1°C, antes da adição sobre o inóculo e incubação a 7±1°C por 10 dias (COUSIN; JAY; VASAVADA, 2001; FRANK; YOUSEF, 2004). Para cada processo foram analisadas dez amostras em duplicata.
3.7.3. Contagem de esporos de termófilos aeróbios totais e flat–sour
A quantificação do Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 e do Geobacillus stearothermophilus IAL2128 foi efetuada, em duplicata, na matéria-prima destinada à primeira etapa do estudo, na matéria-matéria-prima inoculada com os esporos e nas amostras já processadas.
Tal análise realizou-se através de plaqueamento em profundidade em Ágar Dextrose Triptona (DTA, DifcoTM, Lawrence, EUA) e incubação a 55°C/72h.
Anteriormente à inoculação foi efetuado o choque térmico a 100°C/5 minutos na matéria-prima com e sem inóculo, a fim de ativar os esporos. O choque térmico não foi realizado nas amostras processadas, pois o processo já atuou como um choque
de ativação (OLSON; SORRELLS, 2001). Para cada processo foram analisadas dez amostras em duplicata
3.7.4. Teste de esterilidade comercial: Deterioração em alimentos de baixa acidez
Esta análise foi realizada no início do estudo de vida de prateleira. As amostras recém-processadas foram pré-incubadas a 35°C por 10 dias e a 55°C por 7 dias, antes da análise. Este procedimento visou avaliar a ocorrência de alterações (ex. estufamento) e modificações sensoriais nas amostras, como coagulação e presença de odor azedo (BRASIL, 2001; DEIBEL; JANTSCHKE, 2001; DENNY; PARKINSON, 2001).
Após o período de pré-incubação, as amostras foram abertas assepticamente e inoculadas em Meio de Carne Cozida (CMM) com Ágar Selo e em Caldo Dextrose Triptona (DTB, DifcoTM, Lawrence, EUA). A incubação ocorreu
de acordo com a Tabela 5 – Método de incubação para o teste de esterilidade comercial e determinação da causa da deterioração em alimentos de baixa acidez, e somente nos tubos com crescimento positivo efetuou-se a caracterização (DEIBEL; JANTSCHKE, 2001; DENNY; PARKINSON, 2001).
Tabela 5 - Método de incubação para o teste de esterilidade comercial e determinação da causa da deterioração em alimentos de baixa acidez.
Meio Nº de tubos Temperatura e
tempo de incubação
Atmosfera Microbiota alvo
Meio de Carne Cozida (CMM) com Ágar selo
2 tubos 35°C por 10 dias Normal Bactérias esporogênicas mesófilas anaeróbias Meio de Carne
Cozida (CMM) com Ágar selo
2 tubos 55°C por 4 dias
Normal Bactérias esporogênicas termófilas anaeróbias Caldo Dextrose
Triptona (DTB) 2 tubos 35°C por 10 dias Normal Bactérias esporogênicas mesófilas aeróbias Caldo Dextrose
Triptona (DTB) 2 tubos 55°C por 4 dias Normal Bactérias esporogênicas termófilas aeróbias Fonte: Silva et al., 2010.
3.7.4.1.Caracterização dos micro-organismos isolados em Caldo Dextrose Triptona (DTB).
Nesta etapa efetuou-se a caracterização dos tubos de Caldo Dextrose Triptona com crescimento positivo. A fim de determinar a formação de esporos e a morfologia das células, as culturas isoladas foram inoculadas em Ágar Nutriente Manganês (ANMn, DifcoTM, Lawrence, EUA) e incubadas na mesma temperatura de
incubação dos tubos, por 10 dias. Após este período efetuou-se a coloração de esporos e coloração de Gram. Nos casos em que houve a formação de esporos nas placas que foram incubadas a 55°C, foi avaliado se a cultura era termófila estrita ou facultativa, através da transferência de duas alçadas da cultura para 1mL de água
destilada estéril. Após choque térmico (100°C/10 minutos), efetuou-se nova inoculação em duas placas de Ágar Nutriente Manganês (ANMn, DifcoTM, Lawrence,
EUA). Uma foi incubada a 35°C e a outra a 55°C, por um período de 4 dias (DEIBEL; JANTSCHKE, 2001; DENNY; PARKINSON, 2001). O esquema da análise descrita está na Figura 4.
Figura 4 – Esquema de análise para o teste de esterilidade comercial ou causa da deterioração de alimentos de baixa acidez (Fonte: SILVA et al., 2010).
3.8. Análise Estatística
Utilizou-se a análise de variância (ANOVA) para determinar a diferença significativa (p<0,05) dos parâmetros estudados entre três processamentos (240114, 070714 e 040315) para o mesmo dia de estocagem, e entre os diferentes dias de estocagem (0, 30, 60, 90 e 120 dias) para um mesmo processo. Nos casos em que foi constatada a diferença significativa, aplicou-se o teste de comparação de médias de Tukey, determinando-se quais médias diferiam entre si. A análise estatística foi realizada através do programa Statistica for Windows (versão 9.2). Na quantificação de sedimentos e na análise de cor instrumental também foi realizado teste de correlação simples entre outras variáveis estudadas.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Análises microbiológicas
4.1.1. Contagem da Suspensão de esporos de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 e Geobacillus stearothermophilus IAL2128.
Após o preparo das suspensões, efetuou-se a contagem das mesmas em profundidade em meio Ágar Dextrose Triptona (DTA, DifcoTM, Lawrence, EUA), após
72 horas de incubação. No primeiro lote da suspensão (L.141012) alcançou-se 1,23x109 esporos/mL, e no segundo lote (L.081112) foi obtida uma contagem de 6,95x1010 esporos/mL de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953. O segundo lote da suspensão foi diluído até 108 esporos/mL em água destilada estéril a fim de se obter maior volume de suspensão de esporos. Foram obtidos três litros de suspensão padronizada com contagem final de 1,16x108 esporos/mL. O terceiro lote (L.110814) apresentou contagem de 2x108 esporos/mL de Geobacillus stearothermophilus IAL2128.
4.1.2. Teste de Resistência Térmica dos esporos de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953
Os experimentos de resistência térmica seguiram o método dos tubos capilares, conforme proposto por Stumbo (1973) e Pflug (1990), utilizando o leite tipo A, após esterilização a 121°C/10min, como meio de aquecimento. Na Tabela 6, 7 e 8 estão apresentadas as sobrevivências dos esporos de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 em leite tipo A estéril, pH 6,58, a 121°C, 125°C e 127°C, respectivamente.
A partir das contagens do número de sobreviventes para G. stearothermophilus ATCC7953 a 121°C, 125°C e 127°C, foram calculados os valores de D para o micro-organismo nestas temperaturas, conforme apresentado nas Figuras 5, 6 e 7, de acordo com modelo de inativação térmica linear, conforme proposto por Bigelow e Esty (1920). Os valores de D a 121°C, 125°C e 127°C, foram, respectivamente, 1,46 minutos ou 87,6 segundos (R2=0,9644), 0,51 minutos ou 30,6 segundos (R2=0,9809) e 0,33 min ou 19,96 segundos (R2=0,9899).
Tabela 6 - Resistência térmica de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 em leite tipo A estéril, pH 6,58, obtida a 121°C.
Tempo (minutos) Contagem (esporos/mL) Log contagem
0 2,0 x 106 6,30
2 5,5 x 104 4,74
3 5,0 x 104 4,70
4 2,8 x 103 3,44
Figura 5 - Curva de sobreviventes de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 a 121°C.
Tabela 7 - Resistência térmica de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 em leite tipo A estéril, pH 6,58, obtida a 125°C.
Tempo (minutos) Contagem (esporos/ml) Log contagem
0 2,0 x 106 6,30
0,5 1,1 x 106 6,04
1 5,9 x 104 4,77
1,5 4,5 x 103 3,65
Figura 6 - Curva de sobreviventes de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 a 125°C.
Tabela 8 - Resistência térmica de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 em leite tipo A estéril, pH 6,58, obtida a 127°C.
Tempo (segundos) Contagem (esporos/ml) Log contagem
0 2,0 x 106 6,30
30 4,5 x 104 4,65
45 5,5 x 103 3,74
60 1,4 x 103 3,13
Figura 7 - Curva de sobreviventes de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 a 127°C.
A partir dos valores de D a 121, 125 e 127°C, foi calculado o valor de Z, pelo método de regressão linear, utilizando o software Excel. Na Tabela 9 estão apresentados os dados utilizados neste estabelecimento. O valor de Z obtido foi de 9,25±1,25°C, com R2= 0,9976, de acordo com o apresentado na Figura 8.
Tabela 9 - Valores de D a 121, 125 e 127°C para Geobacillus stearothermophilus ATCC7953 em leite tipo A estéril, pH 6,58.
Temperatura (°C) D (min) D(s) Log D
121 1,46 87,60 1,94
125 0,51 30,60 1,49
