Estudo bioenergético

O estudo bioenergético foi realizado no laboratório de Química da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, apenas foram analisadas amostras do grupo controlo e do grupo alimentado com 0.75% do pó da folha de oliveira.

4.5.9.1. Isolamento das mitocôndrias de fígado do murganho

Após eutanasiar os animais, uma pequena amostra de fígado foi recolhida e colocada num meio de isolamento com BSA (albumina do soro de bovino) (225 mmol/l de manitol, 75 mmol/l de sacarose, 5 mmol/l de Hepes (2-[4-(2-hidroxietil)1- piperazinil]-etanosulfónico), 1 mmol/l de EGTA (ácido tetraacético etileno glicol) e 1 mg/mL BSA [pH 7-7.4]). A amostra foi cortada em pequenas fracções com ajuda de uma tesoura e posteriormente homogeneizada. Este processo foi executado sempre em gelo.

O homogeneizado de fígado foi transferido para um tubo de centrifuga de 30 mL, onde se perfez o volume com o meio de isolamento e procedeu-se a nova centrifugação (900 rotações) durante 5 minutos. No sedimento ficaram depositados núcleos, eritrócitos e gorduras, no sobrenadante as mitocôndrias. Este último, foi transferido para um novo tubo de centrifuga de 30 mL e procedeu-se a uma nova centrifugação, a 10000 rotações, durante 10 minutos. O sobrenadante foi rejeitado (constituído por retículo endoplasmático e tecidos), as mitocôndrias ficaram na parte inferior do tubo. De seguida, adicionou-se meio de lavagem novo e procedeu-se a uma nova centrifugação a 10000 rotações durante 10 minutos. O precipitado resultante ressuspendeu-se em 300 µL de meio, sem BSA, transferiu-se para um eppendorf e conservou-se em gelo, a 4ºC.

4.5.9.2. Quantificação da proteína – Método do Biureto

A concentração da proteína da preparação mitocôndrial foi determinada pelo método do Biureto. Este método baseia-se na reacção de uma mistura de cobre e

hidróxido de sódio com um agente complexante que estabiliza o cobre em solução. O produto da reacção apresenta duas bandas de absorção, uma a 270 nm e outra a 540 nm. Apesar da banda na região de 270 nm aumentar em seis vezes a sensibilidade do método do Biureto, a banda na região de 540 nm é a mais utilizada para fins analíticos, porque diversas substâncias, normalmente presentes na maioria dos meios analisados, absorvem na região de 270 nm o que interfere nos resultados (Zaia et al., 1998).

O procedimento experimental teve início com a solubilização das amostras da suspensão mitocôndrial (20 µL), adicionou-se 100 µL de SDS (dodecilsulfato de sódio) a 10% (p/v). Posteriormente adicionou-se água destilada até perfazer o volume de 2 mL e, por fim, 2 mL de reagente alcalino de cobre [reagente do “Biureto”: CuSO4.5H2O a

0.15% (p/v), NaKC4H4O6.4H2O (tartarato de sódio e potássio) a 0.6% (p/v), NaOH

(hidróxido de sódio) a 3% (p/v) e KI (iodeto de potássio) a 0.1% (p/v)]. A preparação dos padrões de BSA (0, 0.8, 1.6 e 2.4 mg) ocorreu nas mesmas condições das outras amostras, contendo 100 µL de meio de lavagem.

As absorvâncias das amostras e dos padrões foram lidas 10 minutos após o início da reacção, a 540 nm, contra um branco que continha todos os reagentes excepto a proteína.

4.5.9.3. Consumo de oxigénio

Para determinar o consumo de oxigénio através da cadeia transportadora de electrões da mitocôndria utilizou-se o método polarográfico descrito por Estabrook (Estabrook, 1967).

Para tal, utilizou-se um eléctrodo de oxigénio do tipo Clark a 25ºC, numa câmara termostática de incubação contendo 1 mL de água (CB1-D Hansatech). Nesta etapa, as mitocôndrias estavam suspensas num tampão constituído por 100 mM de KCl (cloreto de potássio), 20 mM Tris, 3 mM de KH2PO4 (di-hidrogenofosfato de potássio)

e 3 mM de MgCl2 (cloreto de magnésio) a pH 7.2.

Dois minutos depois de fazer a mistura deu-se início à respiração mitocôndrial com a adição de succinato a uma concentração final de 5 mM.

O estado 4 foi avaliado como sendo a taxa de consumo de oxigénio na ausência de ADP.

A taxa RCR (razão entre o estado 3/estado 4) e a razão ADP/O foi calculada de acordo com Estabrook (1967). A concentração da solução de ADP adicionada foi confirmada a 260 nm por espectrofotómetro, utilizando um coeficiente de extinção molecular de 16 cm-1M-1.

4.5.9.4. Medição do potêncial membranar mitocôndrial

O potêncial membranar mitocôndrial (∆ψ) foi estimado através da monitorização da acumulação e libertação do catião lipofílico tetrafenilfosfónio (TPP+) com um eléctrodo sensível ao TPP+ preparado de acordo com o procedimento descrito por Kamo (Kamo et al., 1979). Um mini-eléctrodo foi construído com um tubo de PVC (cloreto de polivinil), o tubo foi fechado com uma membrana feita à base de PVC contendo tetrafenilboro como um permutador de catiões. Este mini-eléctrodo continha no seu interior uma solução TPP+ _{(10 mM). Como eléctrodo de referência, usou-se um}

eléctrodo saturado de prata/cloreto de prata. Ambos os eléctrodos (TPP+ e o eléctrodo de referência) foram conectados a um potenciómetro e inseridos numa câmara de vidro termostática. Os sinais foram registados por um sistema de aquisição Hansatech.

As mitocôndrias foram incubadas no meio de reacção (130 mM de sacarose, 50 mM de KCl, 2.5 mM de KH2PO4 e 5 mM de tampão Hepes a pH 7.4) suplementado

com 3 µM de TPP+. Esta concentração de TPP+ foi escolhida para conseguir uma alta sensibilidade e para evitar possíveis efeitos tóxicos na mitocôndria.

O potencial eléctrico transmembranar foi calculado a 25ºC de acordo com a seguinte equação, assumindo que a distribuição de TPP+ entre a mitocôndria e o meio segue a equação de Nernst

aonde v, V e ∆E representam o volume mitocôndrial, o volume do meio de incubação e a deflexão do potêncial do eléctrodo a partir da linha basal respectivamente.

Não foi feita nenhuma correcção para a constituição da ligação passiva do TPP+ às membranas das mitocôndrias, uma vez que o propósito deste ensaio é mostrar mudanças relativas no potêncial em vez de alterações nos valores absolutos. Os cálculos do potêncial transmembranar basearam-se num volume de 1.1 µL/mg de proteína da matriz mitocôndrial.

4.5.9.5. Ensaios enzimáticos

Todos os ensaios foram realizados a 25ºC, num espectrofotómetro Varian Cary 50. A actividade dos complexos I e IV da cadeia respiratória foi medida de acordo com o descrito por Taylor e seus colaboradores (Taylor et al., 1993) com ligeiras modificações.

As amostras de mitocôndrias foram sujeitas a três ciclos rápidos de congelamento e descongelamento numa solução hipotónica (20 mM de K3PO4 (fosfato

de potássio) a pH 7.2) antes de começarem os ensaios enzimáticos. O NADH desidrogenase foi quantificado através da taxa de oxidação do NADH obtido a 340 nm. O meio de ensaio da NADH ubiquinona oxirredutase (complexo I) continha 25 mM de K3PO4 a pH 7.2, 5 mM de MgCl2, 2.5 mg/mL BSA (fracção V), 0.13 mM de NADH e

65 µM de decilubiquinona, um análogo solúvel da cadeia da ubiquinona e suplementado com 2 µg/mL de antimicina A e 2 mM de KCN (cianeto de potássio) para bloquearem o transporte de electrões provenientes do complexo I. Um minuto depois, foi adicionado 0.25 mg de mitocôndria para iniciar a reacção e a taxa inicial de oxidação do NADH foi monitorizada a 340 nm (ε=6.81 mM-1 cm-1) durante 1 minuto. A actividade do complexo I foi inibida pela adição de 2 µg/mL de rotenona. A actividade específica do complexo IV foi determinada como a taxa de oxidação do citocromo c reduzido aos 550 nm. O ferrocitocromo c foi preparado através da redução do ferricitocromo c na presença de ditionite de sódio, seguido da realização de cromatografia por Sephadex G-25 para remover o Na2SO4 (sulfato de sódio) que não reagiu (Trounce et al., 1996). A mistura da

reacção, consistindo em 20 mM do tampão K3PO4 a pH 7.0, 0.45 mM de n-dodecil-ß-D-

maltosido e 15 µM de ferrocitocromo c foi incubada a 25ºC durante 1 minuto sendo depois as mitocôndrias (10 µg de proteína) adicionadas de modo a iniciar a reacção. A

primeira ordem foi calculada e os resultados estão apresentados como min mg-1 de proteína.

4.5.9.6. Medição da peroxidação lipídica

A peroxidação lipídica foi determinada de acordo com o método descrito por Sassa et al. (1990). O consumo de oxigénio foi medido em 1 mL de meio de reacção (175 mM de KCl e 10 mM de Tris-Cl a pH 7.4, com um suplemento de 3 µM de rotenona) contendo 0.5 mg de proteína e utilizando um eléctrodo do tipo Clark (Hansathech Oxygraph Plus Acquisition System) numa câmara de vidro fechado equipada com um eléctrodo magnético e termostatizada a 25ºC. O registo foi obtido 15 minutos após o início da incubação com 1 mM de ADP e 0.1 mM de FeSO4 (sulfato de

ferro).

4.5.9.7. Ensaio do peróxido de hidrogénio

O peróxido de hidrogénio (H2O2) libertado pela mitocôndria no meio

circundante foi determinado através de uma modificação do método descrito por Valletta e Berton (1987). Este método baseia-se na conversão do ácido homovalínico (HVA) no seu dímero fluorescente na presença de H2O2 e da peroxidase “horseradish”

(HRP). As mitocôndrias foram incubadas num meio tampão de 130 mM de sacarose, 50 mM de KCl, 2.5 mM de KH2PO4, 5 mM de tampão Hepes e pH 7.4, suplementado com

0.1 mM de HVA, 3 U/mL de HRP, 1 mM de succinato, 0.25 mM/0.25 mM de piruvato/malato, 20 µg de antimicina A e 2 µM de rotenona.

Após 15 minutos de incubação adicionou-se 0.5 mL de tampão de glicina frio (pH 12.0) para parar a reacção. As suspensões de mitocôndrias foram centrifugadas durante 10 minutos, a 850 rotações. A fluorescência do sobrenadante foi medida a 312 nm como excitação e a 420 nm como emissão de ondas. Em cada experiência, a incubação foi realizada também com uma amostra controlo que continha apenas a mistura de reagentes (isto é, sem mitocôndria) de modo a corrigir qualquer dimerização espontânea do HVA. A formação de H2O2 foi calculada usando uma curva padrão de

H2O2 e os níveis de H2O2 foram expressos em nmoles H2O2/15 minutos/mg de proteína

mitocôndrial.