Estudo do mecanismo de ação antimicrobiano do OELaII sobre

5.8.1 Detecção de ocorrência de alteração na permeabilidade da membrana celular

O ensaio do cristal violeta (Figura 8) tem como objetivo verificar alteração na permeabilidade da membrana citoplasmática (VAARA; VAARA, 1981). Suspensões de S.

aureus foram incubadas overnight em caldo brain heart infusion (BHI) a 37ºC, até atingirem

a fase de crescimento exponencial. As células foram separadas por centrifugação a 4500 x g durante 5 minutos a 4°C. O pellet bacteriano foi lavado duas vezes, resuspensos em phosphate

buffered saline – PBS (pH 7,4) e a densidade da suspensão ajustadas de forma a se obter uma

turvação correspondente ao tubo 0,5 da escala de McFarland aproximadamente 1 x 108 UFC/mL.

Figura 8 – Fluxograma do ensaio de captação do cristal violeta por cepas de S. aureus após 60, 90 e 120 min de exposição às Concentrações Inibitória e Letal Mínimas do OELaII.

Fonte: elaborado pelo autor.

À suspensão de células microbianas foram adicionadas concentrações de OELaII correspondentes a CIM ou CLM, previamente determinadas, ou antibiótico (Amicacina – 1,2 mg/mL). Após incubação a 37°C por 60, 90 e 120 min, as células foram coletadas por centrifugação a 9300 x g durante 5 minutos e resuspensas em PBS contendo cristal violeta 10 µg/mL. Após incubação a 37°C por 10 min, a suspensão foi centrifugada a 13400 x g por 15 min. O sobrenadante foi coletado e realizado a leitura da absorbância a 570nm em leitora de Elisa (Bio-Tek). Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), um agente quelante que aumenta a permeabilidade da membrana celular, foi usado como controle positivo e culturas microbianas sem tratamento foram utilizadas como controle negativo. Os ensaios foram realizados em

triplicata e os resultados das absorbâncias, foram posteriormente expressos em porcentagem de captação de cristal violeta.

O valor da absorbância da solução de cristal violeta utilizada no experimento foi considerado como 100%. A porcentagem de cristal violeta captado pelas células de S. aureus foi calculada utilizado a seguinte fórmula: Abs570 da amostra / Abs570 da solução de cristal

violeta x 100.

5.8.1.2 Liberação de ácidos nucleicos

A liberação de ácidos nucleicos DNA e RNA (ácido ribonucleico) (Figura 9) foi mensurada através da leitura de absorbância a 260nm (ZHOU et al., 2008). Suspensões de S.

aureus foram incubadas overnight em caldo brain heart infusion (BHI) a 37ºC, até atingirem

a fase de crescimento exponencial. Após esse período, as células foram coletadas por centrifugação a 4500 x g durante 15 min a 4°C. O pellet bacteriano foi lavado duas vezes, resuspensos em PBS (pH 7,4) e a densidade da suspensão ajustadas de forma a se obter uma turvação correspondente ao tubo 0,5 da escala de McFarland aproximadamente 1 x 108 UFC/mL.

Figura 9 – Fluxograma do ensaio de liberação de ácidos nucleicos por cepas de S. aureus após 60, 90 e 120 min de exposição às Concentrações Inibitória e Letal Mínimas do OELaII.

À suspensão de células microbianas foram adicionadas concentrações de OELaII correspondentes a CIM ou CLM, previamente determinadas, ou antibiótico (Amicacina – 1,2 mg/mL). Após incubação a 37°C por 60, 90 e 120 min, o sobrenadante foi coletado por centrifugação a 13400 x g por 15 minutos e realizada a leitura da absorbância a 260nm em leitora de Elisa (Bio-Tek). Culturas microbianas sem tratamento foram utilizadas como controle negativo. Os ensaios foram realizados em triplicata e os resultados expressos em absorbância.

5.8.1.3 Detecção de ocorrência de alteração no efluxo de íons potássio (K+)

A determinação do efluxo de íons potássios (Figura 10) foi realizada segundo a metodologia de Cox et al. (2000). Suspensões de S. aureus foram incubadas overnight em caldo brain heart infusion (BHI) a 37ºC, até atingirem a fase de crescimento exponencial. Após esse período, as células foram coletadas por centrifugação a 4500 x g durante 5 minutos a 4°C. O pellet bacteriano foi lavado duas vezes, resuspensos em água deionizada e a densidade da suspensão ajustadas de forma a se obter uma turvação correspondente ao tubo 0,5 da escala de McFarland aproximadamente 1 x 108 UFC/mL.

Figura 10 – Fluxograma da determinação do efluxo de íons potássio (K+_{) por cepas de S. aureus após 60, 90 e} 120 min de exposição às Concentrações Inibitória e Letal Mínimas do OELaII.

À suspensão de células microbianas foram adicionadas concentrações de OELaII correspondentes a CIM ou CLM, previamente determinadas. Após incubação a 37°C por 60, 90 e 120 minutos, o sobrenadante foi coletado por centrifugação a 13400 x g por 15 minutos e realizada a dosagem de íons potássio extracelulares, utilizando um analisador de íons seletivo 9180 Electrolyte Analyzer (Roche). Culturas microbianas sem tratamento foram utilizadas como controle negativo. Os ensaios foram realizados em triplicatas e os resultados expressos em mEq/L

5.8.1.4 Detecção de alteração na morfologia bacteriana por Microscopia de Força Atômica (MFA)

Alterações na morfologia das bactérias foram analisadas por MFA (Figura 11). Suspensões de S. aureus ATCC 6538P foram incubadas overnight em caldo brain heart

infusion (BHI) a 37ºC, até atingirem a fase de crescimento exponencial. Após esse período, as

células foram coletadas por centrifugação a 4500 x g durante 5 minutos a 4°C. O pellet bacteriano foi lavado duas vezes, resuspensos em água ultrapurificada e a densidade da suspensão ajustadas de forma a se obter uma turvação correspondente ao tubo 2,0 da escala de McFarland aproximadamente 1 x 1010 UFC/mL.

Figura 11 – Fluxograma do ensaio de microscopia de força atômica para detecção de alterações na morfologia de

S. aureus ATCC 6538P após 12 hrs de exposição à Concentração Inibitória Mínima do OELaII.

A CIM de OELaII, previamente determinada, foi adicionada a uma cultura de S.

aureus ATCC 6538P, com aproximadamente, 1 x 1010 UFC/mL. Após incubação a 37°C por

12 horas, as células foram coletas por centrifugação a 4500 x g por 5 minutos a 4°C e lavadas três vezes com água ultrapurificada. O pellet obtido foi resuspenso e cerca de 2µL de suspensão celular foram adicionados em uma lamínula de vidro limpa (Glasseyto), que foi observada em Nanoscópio Microscópico de Força Atômica III-A (Digital Instruments, Santa Bárbara) usando um cantilever de silício cristalino com uma mola constante nominal 40 nm-1 e frequência de ressonância de 242,38 kHz. Culturas microbianas sem tratamento foram utilizadas como controle (BRAGA; RICCI, 1998). As análises foram realizadas pela Dra. Luciana Magalhães Rebêlo Alencar, Departamento de Física – UFC.

5.9 Estudo do efeito de concentrações subinibitórias (CSI) do OELaII na ação de fatores