Para avaliar a estabilidade físico-química das nanopartículas de quitosana e as nanopartículas contendo o TistH, por ambos métodos de obtenção, nas concentrações de 0,5 e 1,0% foram avaliados os tamanhos de partículas e índice de polidispersidade (IPD) semanalmente (8 semanas) e mensalmente (4 meses). As amostras foram armazenadas à
temperatura de 4 ± 2 °C, porém a análise era realizada apenas quando as amostras atingiam temperatura ambiente (25 °C). O tempo 0 corresponde o dia em que as nanopartículas foram produzidas. Os resultados demonstraram que tanto as NQ como as nanopartículas de quitosana associadas ao peptídeo se mantiveram estáveis durante as oito semanas, tanto aquelas produzidas pelo método de incorporação (Figura 15) como adsorção (Figura 17), apresentando pequenas variações no seu tamanho de partículas e uma faixa estreita de IPD de 0,28 a 0,33 (distribuição monomodal) ao longo da análise, porém não significativas estatisticamente. Os mesmos parâmetros foram avaliados durante 4 meses, tanto para método de incorporação (Figura 16) como adsorção (Figura 18) e nenhuma diferença estatística foi observada entre as formulações, sugerindo homogeneidade no tamanho das partículas dos sistemas.
A estabilidade física de uma dispersão coloidal depende da composição da partícula, concentração e especialmente do monitoramento pH do meio. Uma ampla faixa de distribuição no tamanho, momento hidrofóbico da superfície ou forma irregular das partículas tendem a induzir um fenômeno de floculação, devido à alta energia superficial fornecida aos nanossistemas (ROCHA SOARES et al., 2017). Uma excelente estabilidade coloidal foi alcançada por todas as amostras obtidas pela técnica de gelificação iônica. Mesmo sem surfactante, foi possível obter partículas na escala manométrica, de forma esférica com aspectos homogêneos que mantiveram estáveis devido as fortes ligações eletrostáticas e hidrofóbicas que são formadas nas nanopartículas, mesmo após adição do peptídeo, induzindo uma estabilização por vários meses. Essa manutenção da estabilidade é primordial para sua aplicação terapêutica, uma vez que suspensões coloidais estão sujeitas a fenômenos de instabilidades e com o tempo, podem aglomerar, flocular, cremar as partículas e consequente sedimentar, perdendo suas características físico-químicas ideais (GAN et al., 2005; SHEKUNOV et al., 2007).
Figura 15: Estudo de estabilidade físico-química de NQ e NQ-TistH-Inc nas concentrações de 0,5 e 1,0% no período de 8 semanas.
Valores são médias ± desvio padrão, n = 3.
Figura 16: Estudo de estabilidade físico-química NQ e NQ-TistH-Inc nas concentrações de 0,5 e 1,0% no período de 4 meses.
Valores são médias ± desvio padrão, n = 3. Fonte: Autoria própria
Figura 17: Estudo de estabilidade físico-química de NQ e NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0% no período de 8 semanas.
Valores são médias ± desvio padrão, n = 3.
Figura 18: Estudo de estabilidade físico-química NQ e NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0% no período de 4 meses.
Valores são médias ± desvio padrão, n = 3. Fonte: Autoria própria
5.6 Ensaio de liberação in vitro
Nanopartículas poliméricas são consideradas sistemas de liberação modificada, desenvolvidas com o objetivo de favorecer a condução, retenção e liberação de fármacos ou biomoléculas, no local de ação em doses adequadas, e por um período prolongado (LANGER, 1990; SANTOS-SILVA, 2018). A análise do perfil de liberação in vitro fornece informações a respeito dos efeitos físico-químicos da composição e dos mecanismos que influenciam a taxa de liberação de substâncias (MESQUITA et al., 2015).
O perfil de liberação in vitro de proteínas a partir das nanopartículas de quitosana foi avaliado analisando as nanopartículas contendo o TistH identificado na peçonha do escorpião T. stigmurus. É importante considerar que o TistH é um pequeno peptídeo solúvel em água prontamente dissolvido e liberado em meio aquoso. A Figura 19 exibe o perfil in vitro da liberação do peptídeo TistH nas concentrações de 0,5 e 1,0% das nanopartículas de quitosana pelo método de incorporação, enquanto que a Figura 20 exibe o perfil de liberação pelo método de adsorção.
Apesar das concentrações dos peptídeos utilizados muito pequenas (0,5 e 1,0%), as formulações apresentaram uma liberação controlada ao longo das 24 horas de análise. O perfil de liberação das nanopartículas contendo o peptídeo pelo método de incorporação apresentou características de sistemas com liberação prolongada em ambas concentrações avaliadas. Na formulação de nanopartículas de quitosana contendo o TistH 0,5% (NQ- TistH-Inc 0,5%) foi observado um “efeito burst” (liberação imediata das proteínas na superfície das nanopartículas) em 2 horas, liberando 36% da massa total do peptídeo incorporado, atingindo seu estágio estacionário após 8 horas de análise com uma liberação acumulativa de 85% em 24 horas. Entretanto, a formulação de nanopartículas de quitosana contendo o TistH 1,0% (NQ-TisTH-Inc 1,0%) demonstrou um perfil de liberação mais lento. Após 2 horas, a formulação apresentou uma liberação prolongada, sustentada e crescente atingindo cerca de 64% da massa liberada ao final das 24 horas de análise (Figura 19).
Figura 19: Perfil de liberação in vitro das NQ-TistH-Inc nas concentrações de 0,5 e 1,0%.
Valores são médias ± desvio padrão, n = 3.
Com relação ao perfil de liberação das nanopartículas contendo o TistH pelo método de adsorção, este apresentou uma liberação controlada de maneira semelhante ao método de incorporação. Para as nanopartículas de quitosana contendo o TistH 1,0% (NQ- TistH-Ads 1,0%) o “efeito burst” foi observado no intervalo de tempo de 1 hora, com uma liberação de 42% massa total. Após 12 horas atingiu seu estado estacionário com uma liberação acumulativa de peptídeo de 83%. Já a formulação de nanopartículas de quitosana contendo o TistH 1,0% (NQ-TistH-Ads 1,0%) também diminuiu a taxa de liberação do peptídeo, onde foi observado após 4 hora uma liberação de massa total acumulada de 40%. Após 12 horas o sistema atingiu seu estado estacionário e ao final das 24 horas, 61% do peptídeo havia sido liberado (Figura 20).
Figura 20: Perfil de liberação in vitro das NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0%.
Valores são médias ± desvio padrão, n = 3.
O polímero quitosana tem características hidrofílicas e, quando em contato com a água, a difusão para o interior da matriz ocorre de maneira rápida, anterior a sua degradação. Com isso, sistemas particulados de quitosana ao absorver água se intumescem, alterando a liberação do ativo (REN et al., 2005). A liberação de moléculas a partir de sistemas de quitosana pode ocorrer através da superfície das partículas (efeito burst), por difusão através da matriz intumescida e através da erosão superficial da matriz. O mecanismo de liberação de moléculas numa matriz polimérica ocorre quando a água difunde e penetra na nanopartícula, tornando a matriz emborrachada e intumescida havendo a difusão da molécula. Trata-se de um tipo de liberação lenta, mas que se torna rápida quando a molécula se dissolve na matriz (DASH; KONKIMALLA, 2012). Na maioria das vezes, a liberação ocorre envolvendo mais de um mecanismo.
Para propor o possível mecanismo cinético envolvido na liberação dos peptídeos incorporados às nanopartículas de quitosana, foi necessário utilizar a aplicação de diferentes modelos matemáticos como: “primeira ordem”, “Bhaskar”, “Freundlich modificado” e “difusão parabólica” (Tabela 3). A escolha do mecanismo cinético de liberação dos sistemas, se dá pela análise do coeficiente de determinação (r2) obtido através
da regressão linear dos dados provenientes da aplicação dos modelos matemáticos. O modelo é escolhido quando possui o r2 próximo de 1.
Tabela 3. Parâmetros de diferentes modelos cinéticos aplicados para o estudo de liberação
do peptídeo TistH in vitro. k: constante média de liberação de proteína e r2: coeficiente de
determinação.
Modelos Cinéticos k (r2)
Formulações Primeira Ordem Freundlich
modificado Difusão Parabólica Bhaskar NQ-TistH-Inc 0,5% 0,0011 h-1 (0,46) 0,5458 h (0,88) 0,0199 h-0,5 (0,92) 0,3548 h 0,65 (0,88) NQ-TistH-Inc 1,0% 0,0008 h-1 (0,52) 0,3705 h (0,82) 0,0419 h-0,5 (0,99) 0,2408 h 0,65 (0,82) NQ-TistH-Ads 0,5% 0,0005 h-1 (0,73) 0,5269 h (0,87) 0,0619 h-0,5 (0,96) 0,1670 h 0,65 (0,87) NQ-TistH-Ads 1,0% 0,0012 h-1 (0,62) 0,9513 h (0,93) 0,0083 h-0,5 (0,94) 0,4234h 0,65 (0,93)
Dentre os modelos usados, o modelo de difusão parabólico foi o que mais se adequou aos dados experimentais e exibiu um coeficiente de determinação (r2) superior a 0,92, demonstrando que todas as formulações apresentam perfil de liberação semelhantes. Esses dados propõem que a liberação das proteínas podem ocorrer através de difusão intra- partícula ou difusão de proteínas adsorvidas na superfície das partículas (ROCHA SOARES et al., 2017; GLÁUCIA-SILVA et al., 2018).
Os dados experimentais dos ensaios de liberação in vitro corroboraram com os estudos de espectroscopia na região do infravermelho, que demonstraram diferentes interações entre nanopartículas e o peptídeo para cada método de obtenção. Esses fatos contribuem para entender o melhor desempenho da NQ-TistH-Ads em fornecer uma liberação mais lenta do peptídeo. No método de adsorção, não ocorre uma competição entre o peptídeo e o TPP, preservando a gelificação iônica (GLÁUCIA-SILVA et al., 2018). Outro importante aspecto com relação aos nanossistemas obtidos pelo método de adsorção
é que estes são facilmente controlados, de simples e rápida execução, provando ser um eficiente método de aprisionamento de peptídeos capazes de oferecer uma liberação lenta quando desejada. Para o método de incorporação, ocorreu uma mudança de potencial zeta entre as nanopartículas de quitosana com diferentes concentrações de peptídeos, sendo +30 mV para NQ-TistH-Inc 0,5% e +15 mV em NQ-TistH-Inc 1,0%, reforçando a hipótese de que o TistH tem a capacidade de gerar uma perturbação na gelificação iônica de modo apresentar o perfil de libração um pouco diferente do método de adsorção (Tabela 1).
Vários estudos utilizando nanopartículas de quitosana para a entrega de proteínas e peptídeos demonstraram um perfil de liberação semelhante. Um estudo demonstrou a liberação in vitro de um biopeptídeo hipotensor incorporado a nanopartículas de quitosana, em que foi possível observar na fase inicial um “efeito burst”, seguido por uma liberação mais lenta e sustentável num tempo de 12 horas de análise, apresentando uma concentração acumulativa de 58% (AUWAL et al., 2017). Em outro estudo nessa linha, realizado por nosso grupo de pesquisa, Rocha Soares et al. (2017) demonstraram que a liberação de proteínas (BSA e da peçonha bruta do escorpião T. serrulatus) apresentaram um “efeito burst” seguida por uma liberação lenta e prolongada nas primeiras 24 horas, apresentando em massa menos de 40% da proteína total incorporada. Os resultados demonstram que o que o peptídeo TistH para ambos os métodos de obtenção apresentou ao final da análise de 12 horas, em um curto intervalo de tempo, uma concentração acumulativa superior aos estudos apresentados, enfatizando a capacidade de nanopartículas de quitosana modular a liberação de proteínas.
5.7 Ensaio de viabilidade celular
Testes de citotoxicidade in vitro permitem avaliar a capacidade das células sobreviver na presença de biomateriais e várias técnicas estão disponíveis para avaliar a citotoxicidade de nanopartículas de quitosana (SANTOS-SILVA et al., 2017; LIMA et al., 2018). Neste estudo, o ensaio de viabilidade celular foi escolhido e realizado em cultura de células de linhagem celular normal de rim de macaco verde africano (Vero E6) e macrófagos de murinos (RAW 264.7) para avaliar o possível efeito citotóxico desenvolvido por nanopartículas de quitosana (NQ), nanopartículas de quitosana contendo o TistH pelo
método de incorporação (NQ-TistH-Inc) e adsorção (NQ-TistH-Ads) nas concentrações de 0,5 e 1,0% através do ensaio de MTT.
As nanopartículas de quitosana foram biocompatíveis no ensaio utilizando a cultura de células da linhagem RAW 264.7, entretanto, as NQ apresentaram efeitos citotóxicos na concentração mais alta (357 µg/mL) (Figura 21A). Loh et al. (2010) demonstraram que nanopartículas de quitosana podem exibir diferentes perfis de citotoxicidade dependendo das propriedades do material usado para sintetizar as nanopartículas, tamanho das partículas e interação com as células, bem como a concentração selecionada. Este fato corrobora com nossos resultados, demostrando um padrão concentração-dependente. Nas células da linhagem RAW 264.7, tanto o método de incorporação como o método de adsorção, exibiram uma viabilidade celular superior a 60% nas concentrações de 178 e 89 µg/mL, evidenciando que o aumento na concentração de nanopartículas de quitosana e peptídeo diminui ligeiramente a viabilidade celular (Figura 21B).
Figura 21: Efeito citotóxico das NQ, NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0% em células da linhagem RAW 264.7.
(A) NQ em células de linhagem RAW 264.7 em diferentes concentrações (357-11 µg/mL). (B) NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0% em células de linhagem RAW 264.7 nas diferentes concentrações 357, 178 e 89 µg/mL. Valores são médias ± desvio padrão, n = 3. ###p < 0.001 comparado com NQ na concentração de 357
As nanopartículas de quitosana foram biocompatíveis no ensaio utilizando a cultura de células da linhagem Vero E6 em todas as concentrações avaliadas (Figura 22A). O mesmo foi observado quando o peptídeo foi adicionado as NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-Ads, indicando ser biocompatíveis em todas as concentrações testadas, exibindo uma viabilidade celular superior a 80% para os dois métodos de obtenção de nanocarreadores (Figura 22B). Curiosamente, as NQ induziram um aumento na viabilidade de células Vero E6 exibindo um crescimento celular até 160% (Figura 22A). Este fenômeno pode ser atribuído ao grau de desacetilação e variação na massa molecular da quitosana (BERGER et al., 2004; CHO et al., 2006; ELGADIR et al., 2015). Howling et al. (2001) demonstraram que altos níveis de desacetilação de quitosana (grau de desacetilação 89%) aumentaram a viabilidade de células normais originadas de fibroblastos dérmicos humanos (células C520) em todas as concentrações avaliadas. Chen et al. (2002) evidenciaram que a carboximetilquitosana promoveu significativamente um aumento na viabilidade de células de fibroblastos normais da pele. Além disso, as nanopartículas de quitosana, juntamente com o soro presente no meio de cultura, podem estar interagindo com fatores de crescimento, potencializando seu efeito estimulatório (ROLIM et al., 2018).
Resultados semelhantes foram observados por nosso grupo de pesquisa ao avaliar o peptídeo TistH, que apresentou ausência de toxicidade celular frente células de linhagem normais 3T3, RAW 264.7 e HEK (MACHADO et al., 2016). Os resultados apresentados nesse estudo corroboram com a alta biocompatibilidade apresentada por trabalhos que descrevem nanopartículas de quitosana biocompatíveis e seguras (LOH et al., 2010; FRAGA et al., 2011). Sendo assim, com base nos resultados de viabilidade celular obtidos, que serviu de base para os ensaio antifúngicos, verificou-se que a partir de 178 µg/mL as nanopartículas de quitosana contendo o TistH não foram tóxicas para as células Vero E6 e RAW 264.7.
Figura 22: Efeito citotóxico NQ, NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0% em células da linhagem Vero E6.
(A) NQ em células de linhagem Vero E6 em diferentes concentrações (357-11 µg/mL). (B) NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0% em células de linhagem Vero E6 nas diferentes concentrações 357, 178 e 89 µg/mL. Valores são médias ± desvio padrão, n = 3. ###p<0.001 comparado com NQ na concentração de 357 µg/mL. ***p < 0,001, **p < 0,01 e *p < 0,05 comparado com NQ.