CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
MANOELA TORRES DO RÊGO
OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA CONTENDO O
PEPTÍDEO TistH IDENTIFICADO NA PEÇONHA DO ESCORPIÃO Tityus stigmurus
NATAL/RN 2019
OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA CONTENDO O
PEPTÍDEO TistH IDENTIFICADO NA PEÇONHA DO ESCORPIÃO Tityus
stigmurus
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas,
Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do título de Doutora em Ciências Farmacêuticas (Área de concentração: Bioanálises e Medicamentos).
Orientador: Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa
Co-orientador: Prof. Dr. Arnóbio Antônio da Silva Júnior
NATAL/RN 2019
À Deus, ser de infinita sabedoria, por dar-me força e saúde para superar e enfrentar tantos obstáculos ao longo desses quatro anos, fazendo-me acreditar que tudo é possível, basta ter persistência, fé e vontade de vencer.
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, minha instituição de ensino, a qual me proporcionou e proporciona desenvolver todas as minhas realizações acadêmicas. Desde 2009 com o ingresso no curso de Farmácia (2009-2013), especializações em Análises Clínicas/Toxicológica (2013-2014) e Biologia Molecular (2016-2017), mestrado (2013-2015) e doutorado (2015-2019) em Ciências Farmacêuticas. Até aqui são 10 anos de ensinamentos, aprendizados e muita gratidão.
Ao meu orientador, pai científico, Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes
Pedrosa, homem de grande coração, inteligência e sabedoria. Sou inteiramente grata por
sua orientação, compreensão e amizade. Saiba que lhe admiro, respeito e acima de tudo me orgulho de ser sua aluna, uma das pessoas mais humanas que conheci e que tenho como referência pessoal e acadêmica, meu muito obrigada!
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Arnóbio Antônio da Silva Júnior por todos os ensinamentos e discussões. Por ter sido essencial no desenvolvimento deste trabalho, aprendi muito contigo, meu muito obrigada!
Às minhas companheiras e amigas de bancada Fiamma Gláucia e Karla Samara pela parceria na vida pessoal e acadêmica, tenho em vocês exemplo de companheirismo, persistência e amizade, podem ter certeza juntas somos melhores (que trio en?!). Agradeço em especial à Ariane Lacerda, Emanuell Santos, Igor Zumba e Luanda Canário, vocês foram primordiais para o desenvolvimento experimental deste trabalho. Agradeço também à Prof. Dr. Guilherme Maranhão Chaves por complementar de maneira tão satisfatória minha tese. Quando penso em organização, pontualidade, ensinamentos acadêmicos e compromisso com a docência, lembro de você, meu muito obrigada!
Em especial gostaria de agradecer a Richele Machado, Norberto Monteiro, Allanny
Furtado, Alaine Maria, Alessandra Daniele, Menilla Alves, Fabiana Yamashita, Diana Pontes, Lucas Azevedo, Maria Sarmento, Júlia Passos, Nayara Souza, Bruno Amorim, Rafael Castro, Nathália Araújo e Sarah Ferreira.
Ao meu pai, Vamberto Torres, meu espelho, minha maior referência e meu maior incentivador, tudo o que eu sou e tudo que tenho devo a você, obrigada por ser o melhor pai do mundo, por me permitir sonhar e realizar. À minha mãe, Gina Lopes, minha amiga, quem sempre me amparou e confortou com seu amor, orações e paciência, todas as palavras de incentivos foram essenciais para chegar aonde eu cheguei e com a graça de Deus você terá uma filha DOUTORA. Ao meu irmão, João Pedro, pelo companheirismo, pelo consolo e amparo em momentos de dificuldades, por me incentivar e acreditar que sempre eu seria capaz. Tenho com vocês o mais belo exemplo de união, amor e o verdadeiro significado da família. Vocês foram essenciais para que eu perseverasse diante das dificuldades. Obrigado por sonharem juntos comigo e podem ter certeza, esse título é nosso. Amo vocês!
Agradeço à CAPES pela bolsa de estudos concedida, FAPERN e CNPq pelo auxílio financeiro para realização do projeto.
Agradeço à Fábia Freire e Gibson Feitosa não só pelo apoio burocrático prestado através da secretaria do PPgCF, bem como pela amizade de vocês!
Agradeço a todos os familiares e amigos que sempre me apoiaram e incentivaram, seja por orações ou mensagens motivacionais e me desculpo pelos momentos de ausência.
Àqueles que por ventura deixei de mencionar e que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.
Matar o sonho é matarmo-nos. É mutilar a nossa alma. O sonho é o que temos de realmente nosso, de impenetravelmente e inexpugnavelmente nosso. (Fernando Pessoa)
um conjunto de toxinas (peptídeos) com elevado potencial para aplicações biotecnológicas. A análise transcriptômica da glândula da peçonha do T. stigmurus, realizada por nosso grupo de pesquisa, identificou uma variedade de peptídeos com potencial farmacológico. Dentre as moléculas apresentadas, a atividade de um peptídeo semelhante a classes das hipotensinas (TistH, Tityus stigmurus hipotensina) tem sido relatada na literatura, por ser capaz de potencializar o efeito da bradicinina, além de exercer efeito antifúngico. Sabe-se que para alcançar uma eficácia máxima, moléculas bioativas podem ser incorporadas à biomateriais ou nanocarreadores poliméricos. Com esse foco, o estudo teve como objetivo obter e caracterizar físico-quimicamente nanopartículas de quitosana contendo o peptídeo TistH obtidas pelos métodos de incorporação e adsorção, avaliar sua biocompatibilidade, bem como a capacidade de potencializar o efeito antifúngico. As nanopartículas contendo o peptídeo TistH, tanto pelo método de incorporação TistH-Inc) como adsorção (NQ-TistH-Ads), foram obtidas através da técnica de gelificação iônica. Os nanossistemas na concentração de 0,5 e 1,0%, quando avaliados através do espalhamento dinâmico de luz, apresentaram superfície de partícula catiônica, com diâmetros médios inferiores a 160 nm e índice de polidispersidade inferior 0,3. A eficiência de incorporação demonstrou ser superiores a 96,5% e o seu sucesso foi confirmado através da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida e espectroscopia na região do infravermelho. As NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0% foram analisadas através da microscopia de força atômica e microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo, onde foi possível evidenciar partículas na escala nanométrica com formas esféricas, superfícies lisas e aspectos homogêneos. A estabilidade foi avaliada através do tamanho das partículas e do índice de polidispersidade, em que foi possível evidenciar uma dispersão coloidal estável por 4 meses. Com relação ao perfil de liberação, foi observado para todas as formulações uma liberação prolongada e sustentada durante as 24 horas, seguindo o mecanismo cinético de difusão parabólica. A biocompatibilidade foi avaliada tanto em eritrócitos, como em linhagens de células normais originadas de macrófagos de murinos (RAW 264.7) e células normais originadas de rim de macaco verde africano (Vero E6), demonstrando que os nanossistemas, nas concentrações utilizadas para os ensaios antifúngicos, não evidenciaram efeitos hemolíticos e citotóxicos, respectivamente. A atividade antifúngica foi avaliada através dos ensaios de determinação concentração inibitória mínima (CIM), concentração fungicida mínima (CFM) e atividade antibiofilme, utilizando cepas do gênero Candida. As NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-ADS revelaram uma CIM de 89,2 µg/mL contra Candida albicans, 11,1 µg/mL para C. parapsilosis e C. tropicalis, resultados confirmados pelo ensaio de concentração fungicida mínimo. Além disso, as formulações reduziram significativamente a formação de biofilmes de cepas clínicas de sepses de C. tropicalis e C. krusei, bem como cepas clínicas de candidíase vulvovaginal da espécie C. albicans. Sendo assim, as nanopartículas de quitosana apresentaram ótimo desempenho no carreamento do peptídeo TistH e foram capazes de potencializar o efeito antifúngico contra leveduras do gênero Candida podendo eventualmente ser aplicada no futuro como um possível agente antifúngico.
Palavras-chave: Anti-Candida. Nanocarreadores biodegradáveis. Quitosana. Peptídeo TistH. Tityus stigmurus.
The Tityus stigmurus scorpion venom has been studied in recent years and revealed many toxins (peptides) with high potential for biotechnological applications. The transcriptomics approach from the venom glands of T. stigmurus, realized by our scientific group, identified several bioactive peptides with pharmacological potential. Among the molecules identified, the activity of peptide like-hypotensins class (TistH, Tityus stigmurus hypotensin), reported in the literature, evidenced the TistH with bradykinin-potentiating peptide, in addition exert antifungal effect. The maximum efficacy of this class of compounds can be achieved by immobilizing it in specific and suitable biomaterials or suitable carriers. This study objective to obtained and characterized physiochemically TistH-loading cross-linked chitosan nanoparticles for incorporation and adsorption, evaluate the biocompatibility as well as improve of antifungal effect. The nanossystems containing the TistH by incorporation (CN-TistH-Inc) and absorption (CN-TistH-Ads) methods at concentration of 0.5 and 1.0% were obtained by ionic gelation technique. The nanosystems at 0.5 and 1.0% were analyzed by dynamic light scattering showed positive zeta potential, with size particles less than 160 nm and polydispersity index less than 0.3. The encapsulation efficiency were greater than 96.5% and the success was confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis and Fourier transform infrared spectroscopy. The CN-TistH-Inc and CN-TistH-Ads at 0.5 and 1.0% were analyzed by atomic force microscopy and scanning electronic microscopy evidenced nanometric particles, spherical shape with smooth surface and homogeneous aspects. The stability was evaluated by particle size and polydispersity index can possible observed stable colloidal dispersions for 4 months. According in vitro release profile was observed for all formulations prolonged and sustained release for 24 hours, with kinetic parabolic diffusion mechanism. The biocompatibility was evaluated in erythrocytes, normal cells originated from murine macrophage (RAW 264.7) and kidney of African green monkeys (Vero E6) suggested biocompatibility that both nanosystems, in concentration used for antifungal assay, not demonstrated be hemolytic and cytotoxic, respectively. The antifungal activity was evaluated through of determination of the Minimum inhibitory concentration (MIC), minimum fungicidal concentration (MFC) and antibiofilm activity used yeast of genus Candida. The CN-TistH-Inc and CN-TistH-Ads showed a minimal inhibitory concentration of 89.2 µg/mL against Candida albicans, 11.1 µg/mLfor C. parapsilosis and C. tropicalis, confirmed by minimum fungicidal concentrations assay. Moreover, the TistH-loaded cross-linked chitosan nanoparticles significantly reduced the biofilm formation of clinical yeast sepsis of C. tropicalis and C. krusei, as well as clinical yeasts of vulvovaginal candidiasis of C. albicans. Thus, this study demonstrated that chitosan nanoparticles are promising for carrying and delivering the peptides TistH from Tityus stigmurus, with improve antifungal activity against genus Candida spp. may eventually be applied in the future as a possible antifungal agent.
Keywords: Anti-Candida; biodegradable nanocarrier; chitosan; nanoparticle; peptide TistH; Tityus stigmurus.
Figura 1: Escorpião Tityus stigmurus. ... 18 Figura 2: Distribuição Geográfica (em rosa) do escorpião Tityus stigmurus no Brasil. .... 19 Figura 3: Morfologia do escorpião. ... 20 Figura 4: Estrutura tridimensional do TistH por dinâmica molecular utilizando o campo de força (A) AMBER-03 e (B) GROMOS96 43a1. ... 22 Figura 5: Representação esquemática do polímero de quitosana. ... 27 Figura 6: Esquema representativo da obtenção das nanopartículas de quitosana. ... 32 Figura 7: Esquema representativo do método incorporação do TistH às nanopartículas de quitosana. ... 33 Figura 8: Esquema representativo do método adsorção do TistH às nanopartículas de quitosana. ... 34 Figura 9: Esquema representativo para o ensaio de concentração inibitória mínima. ... 41 Figura 10: Esquema representativo das interações químicas entre quitosana e tripolifosfato. ... 44 Figura 11: Formação das nanopartículas de quitosana... 45 Figura 12: Perfil eletroforético do peptídeo TistH, NQ, NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0%. ... 50 Figura 13: Espectros na região do infravermelho de NQ, peptídeo TistH, NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-Ads 1,0%. ... 51 Figura 14: Imagens de microscopia de força atômica em 2D (segunda dimensão), 3D (terceira dimensão) e microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo de nanopartículas de quitosana contendo o TistH, respectivamente. ... 54 Figura 15: Estudo de estabilidade físico-química de NQ e NQ-TistH-Inc nas concentrações de 0,5 e 1,0% no período de 8 semanas. ... 57 Figura 16: Estudo de estabilidade físico-química NQ e NQ-TistH-Inc nas concentrações de 0,5 e 1,0% no período de 4 meses... 57 Figura 17: Estudo de estabilidade físico-química de NQ e NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0% no período de 8 semanas. ... 58
Figura 19: Perfil de liberação in vitro das NQ-TistH-Inc nas concentrações de 0,5 e 1,0%.60 Figura 20: Perfil de liberação in vitro das NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0%.61 Figura 21: Efeito citotóxico das NQ, NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0% em células da linhagem RAW 264.7. ... 65 Figura 22: Efeito citotóxico NQ, NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0% em células da linhagem Vero E6. ... 67 Figura 23: Avaliação do efeito hemolítico das NQ, NQ-TistH-Inc, NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0% sobre hemácias de sangue humano. ... 68 Figura 24: Efeito das NQ, NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0% sobre a formação de biofilme de cepas clínicas. ... 73 Figura 25: Efeito das NQ, NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0% sobre a formação de biofilme de cepas clínicas. ... 74
Tabela 1: Tamanho de partículas, potencial zeta e índice de polidispersidade (IPD) de nanopartículas de quitosana (NQ) contendo o peptídeo TistH nas concentrações de 0,5 e 1,0% pelo método de incorporação (NQ-TistH-Inc) e adsorção (NQ-TistH-Ads). ... 46 Tabela 2: Porcentagem da eficiência de incorporação para as nanopartículas adsorvidas e incorporadas com TistH nas concentrações de 0,5 e 1,0%. ... 48 Tabela 3. Parâmetros de diferentes modelos cinéticos aplicados para o estudo de liberação do peptídeo TistH in vitro. k: constante média de liberação de proteína e r2: coeficiente de determinação. ... 62 Tabela 4: Concentração inibitória mínima (CIM) de NQ, NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0% contra leveduras do gênero Candida. ... 70
ANOVA Análise de variância
ATCC American Type Culture Collection
BCA Ácido bicinconínico
B16-F10 Linhagem celular de melanoma murino
CBS Netherlands Collection Centraal Bureau voor Schimmelcultures
CGEN Conselho de Gestão do Patrimônio Genético
CIM Concentração inibitória mínima
CONCEA Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal
CVV Candidíase vulvovaginal
C520 Linhagem de celular normal de fibroblastos dérmicos humano
DOc Densidade ótica média do controle positivo
DO Densidade ótima média controle negativo
DLS Espalhamento dinâmico de luz
DMEM Meio de Eagle modificado por Dulbecco
EIP Eficiência de incorporação de proteínas
HEK-293 Linhagem celular normal de células embrionárias de rim humano
HeLa Linhagem celular de adenocarcinoma cervical humano
HepG2 Linhagem celular de carcinoma hepatocelular humano
HRP Peróxido de hidrogênio oxidorredutase
IPD Índice de polidispersidade
K Constante média de liberação de proteína
KBr Brometo de potássio
LMMM Laboratório de Micologia Medica Molecular
MEVFEG Microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de
campo
MFA Microscopia de Força Atômica
MTT Brometo de 3-metil-[4-5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio
NQ-TistH-Inc Nanopartículas de quitosana contendo o peptídeo TistH obtidas pelo método de incorporação
PBS Tampão fosfato salino
PCL Policaprolactona
PLA Poli (ácido-lático)
PLGA Poli (ácido lático-co-glicólico)
PEG Polietilenoglicol
RAW 264.7 Linhagem de macrófagos de murinos
r2 Coeficiente de determinação
SBF Soro bovino fetal
SiHa Linhagem celular de carcinoma de células escamosas cervical
humana
TistH Tityus stigmurus Hipotensina
TFE 2,2,2 - trifluoretanol
TPP Tripolifosfato de sódio
VC Viabilidade celular
Vero E6 Linhagem celular normal de rim de macaco verde africano
YNB Meio Yeast Nitrogen Base
YPD Extrato de levedura-peptona-dextrose
2D Segunda dimensão
3D Terceira dimensão
3T3 Linhagem celular normal de fibroblastos de murinos
1 INTRODUÇÃO ... 15
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 18
2.1 Escorpião Tityus stigmurus ... 18
2.2 Peptídeo Tityus stigmurus hipotensina (TistH) ... 21
2.3 Fatores de resistência e virulência ... 23
2.4 Nanopartículas ... 25 2.5 Quitosana ... 26 3 OBJETIVOS ... 29 3.1 Objetivo geral ... 29 3.2 Objetivos específicos ... 29 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 31
4.1 Obtenção do peptídeo TistH ... 31
4.2 Obtenção das nanopartículas de quitosana para veiculação do peptídeo TistH .... 31
4.2.1 Incorporação do peptídeo TistH às nanopartículas de quitosana ... 32
4.2.2 Adsorção do peptídeo TistH às nanopartículas de quitosana ... 33
4.3 Caracterização físico-química ... 34
4.3.1 Potencial zeta, tamanho de partícula e índice de polidispersidade ... 34
4.3.2 Eficiência de incorporação do peptídeo TistH ... 35
4.3.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) ... 35
4.3.4 Espectroscopia na região de infravermelho ... 36
4.3.5 Microscopia de força atômica (MFA) e microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo (MEVFEG) ... 36
4.3.6 Estabilidade físico-química ... 36
4.3.7 Ensaio de liberação in vitro ... 37
4.4 Biocompatibilidade ... 37
4.4.1 Células ... 37
4.4.2 Ensaio de viabilidade celular ... 38
4.4.3 Ensaio hemolítico ... 38
4.5.3 Concentração inibitória mínima (CIM) ... 40
4.5.4 Concentração fungicida mínima (CFM) ... 41
4.5.5 Atividade antibiofilme ... 42
4.6 Análise estatística ... 43
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 44
5.1 Análise do potencial zeta, tamanho de partícula e índice de polidispersidade ... 44
5.2 Eficiência de incorporação do peptídeo TistH ... 48
5.3 Espectroscopia na região do infravermelho ... 51
5.4 Microscopia de força atômica e microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo... 53
5.6 Estudo de estabilidade físico-química ... 55
5.6 Ensaio de liberação in vitro ... 59
5.7 Ensaio de viabilidade celular ... 63
5.8 Ensaio de hemólise ... 68
5.9 Efeito antifúngico das nanopartículas de quitosana contendo o peptídeo TistH .... 69
5.9.1 Concentração inibitória mínima ... 69
5.9.2 Atividade antibiofilme ... 71 6 CONCLUSÕES ... 75 REFERÊNCIAS... 77 ANEXOS... 88 ANEXO A ... 88 ANEXO B ... 89 APÊNDICES ... 90
APÊNDICE A - Artigos publicados em periódicos internacionais como autora ... 90
APÊNDICE B - Patente e artigos publicados em periódicos internacionais como colaboradora ... 91
1 INTRODUÇÃO
O escorpionismo representa um sério problema mundial de saúde pública, com aproximadamente 1,2 milhões de acidentes e mais de 3.250 óbitos por ano (CHIPPAUX; GOYFFON, 2008; RECKZIEGEL C.; PINTO, 2014). No Brasil, o país mais populoso da América do Sul, escorpiões do gênero Tityus são os clinicamente mais relevantes, em especial as espécies: T. serrulatus, T. bahiensis e T. stigmurus (MENDES et al., 2015). O escorpião Tityus stigmurus, também conhecido como escorpião amarelo, é a espécie responsável pela maioria dos acidentes no Nordeste do Brasil (BRASIL, 2009). Além disso, na sua peçonha é possível encontrar fontes ricas de pequenas toxinas peptídicas que podem ser utilizadas como possíveis ferramentas farmacológicas (PLESSIS; ELGAR; PLESSIS, 2008; GUO et al., 2013).
A primeira análise transcriptômica da glândula da peçonha do escorpião T. stigmurus foi realizada e reportada por nosso grupo de pesquisa. Uma diversidade de peptídeos com potencial farmacológico foram identificados, tais como peptídeos antimicrobianos, hipotensinas, toxinas que atuam em canais de potássio e sódio, bem como peptídeos aniônicos, lectinas, metaloproteinases, peptídeos ricos em cisteínas e peptídeos hipoteticamente secretados (ALMEIDA et al., 2012). Dentre as moléculas deduzidas, um peptídeo semelhante a classes das hipotensinas (TistH, Tityus stigmurus hipotensina) chamou atenção devido seu potencial biotecnológico como peptídeo multifuncional. Machado et al. (2015) demonstraram, em ratos normotensos, que o peptídeo TistH foi capaz de exercer efeito hipotensor por potencializar o efeito da bradicinina e induzir efeito vasorelaxante em endotélio de artérias mesentéricas, dependente da liberação de óxido nítrico, sem inibir a ação da enzima conversora de angiotensina. Em outro estudo, eles reportaram uma promissora propriedade antifúngica para o peptídeo TistH (MACHADO et al., 2016).
Candidemia é a principal manifestação de candidíase invasiva, sendo considerado um sério e persistente problema de saúde pública, com grande impacto nos custos associados à assistência médica e elevada de taxa mortalidade (35% a 75%), apesar dos avanços alcançados no diagnóstico e tratamento. A candidíase vulvovaginal (CVV) causa grande desconforto nas relações sexuais e prejudica o desempenho no trabalho, afetando
70-75% das mulheres em idade fértil (MEDEIROS et al., 2014, 2017). Nesse sentido, o atual arsenal limitado de drogas antifúngicas disponíveis comercialmente, juntamente com o aumento da resistência antifúngica (principalmente devido às espécies emergentes de Candida) e a alta toxicidade desses compostos (BROWN et al., 2012; WRIGHT, 2014; SCORZONI et al., 2017), demonstraram a necessidade emergencial de buscar por novas drogas, favorecendo a procura por novas alternativas terapêuticas em diferentes fontes naturais, como por exemplo, peptídeos bioativos obtidos da peçonha de escorpiões (ALMAAYTAH; ALBALAS, 2014; LI et al., 2019).
Os peptídeos bioativos para exercerem seu efeito biológico específico devem preservar uma integridade estrutural, além de ser entregue ao tecido ou célula específica. Neste contexto, os nanossistemas têm recebido bastante atenção devido sua capacidade de proteção, bem como atuar como carreadores de peptídeos, proteínas, antígenos, oligonucleotídeos e genes terapêuticos (XU; DU, 2003; MESQUITA et al., 2017). Além disso, os nanocarreadores apresentam as vantagens de melhorar e potencializar a atividade farmacológica e captação intracelular, prolongar a biodisponibilidade e a meia-vida, promovendo uma liberação sustentada, consequentemente com a redução da frequência e dose de determinados fármacos e biomoléculas (DOMBU; BETBEDER, 2013; AHMED; ALJAEID, 2016; AUWAL et al., 2017; RAGUSA et al., 2018). Com isso, muitos polímeros e biomateriais têm apresentado características interessantes. A quitosana, por exemplo, tem sido investigada quanto ao seu uso como filmes, dispositivos implantáveis e outros sistemas carreadores na escala nanométrica (AHMED; ALJAEID, 2016).
A quitosana é um polissacarídeo natural produzido a partir da desacetilação parcial da quitina, um polímero extraído de exoesqueleto de artrópodes, insetos, crustáceos e alguns fungos. Este copolímero tem mostrado ser não antigênico, não irritável, biocompatível e biodegradável podendo ser aplicado como matriz para aprisionar e liberar macromoléculas (MAO et al., 2001; PAN et al., 2002; VIMAL et al., 2013; AUWAL et al., 2017). Dentre os dispositivos de quitosana, as nanopartículas tem revelado uma
variedade de aplicações como nanocarreadores de proteínas
(MOHAMMADPOURDOUNIGHI et al., 2010; ROCHA SOARES et al., 2012, 2018; VENKATESAN; VIMAL; HAMEED, 2013; MIRZAEI et al., 2017), DNA (MAO et al.,
2001; CSABA; KOPING-HOGGARD; ALONSO, 2009; RAJESHKUMAR et al., 2009) e peptídeos (AUWAL et al., 2017; WONG; AL-SALAMI; DASS, 2017).
No presente estudo, nanopartículas de quitosana foram preparadas pela técnica de gelificação iônica e dois diferentes métodos de aprisionamento do peptídeo TistH avaliados. No primeiro método, o peptídeo foi incorporado antes de ocorrer a gelificação iônica (NQ-TistH-Inc), enquanto que no segundo método o peptídeo foi adsorvido nas nanopartículas prontas (NQ-TistH-Ads). Os nanocarreadores foram avaliados quanto as suas propriedades físico-químicas, biocompatibilidade e potencialização do efeito antifúngico e antibiofilme in vitro. Este é o primeiro estudo que investiga um peptídeo identificado na peçonha do escorpião T. stigmurus incorporado à nanopartículas de quitosana como forma de potencializar a atividade farmacológica.
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Escorpião Tityus stigmurus
Os escorpiões são artrópodes quelicerados (Chelicerata), que pertencem à classe Arachnida, ordem Scorpiones que estão atualmente divididas em 6 superfamílias e 20 famílias (LOURENÇO et al., 1996), sendo a família Buthidae dividida em 4 subfamílias. À subfamília Tityinae pertencem os escorpiões do gênero Tityus, os principais causadores de acidentes graves por escorpião no Brasil (CHIPPAUX; GOYFFON, 2008), sendo de grande importância nos casos de envenenamento humanos as espécies Tityus serrulatus, Tityus bahiensis e Tityus stigmurus (BRASIL, 2001). No Nordeste, o T. stigmurus é referido como o principal agente etiológico na região (Figura 1) (LIRA-DA-SILVA et al., 2000).
Figura 1: Escorpião Tityus stigmurus.
Quanto à distribuição geográfica no Brasil, a espécie predomina principalmente no cerrado e caatinga do Nordeste brasileiro, além de surgir em ambientes antrópicos e no arquipélago de Fernando de Noronha em Pernambuco, representada pelas áreas cor de rosa no mapa (ALMEIDA, 2010) (Figura 2).
Figura 2: Distribuição Geográfica (em rosa) do escorpião Tityus stigmurus no Brasil.
Fonte: Almeida, 2010
O corpo do escorpião é dividido em prossoma, mesossoma (pré-abdômem) e metassoma (pós-abdômem), onde os dois últimos formam o opistossoma. No prossoma apresenta os segmentos fusionados e alguns apêndices, como: quelíceras, pedipalpos e pernas. As pernas divididas em sete segmentos e os pedipalpos em seis. O mesossoma possui sete segmentos, chamados de tergitos (revestimento dorsal) e esternitos (revestimento ventral), possuindo neste segmento o opérculo genital, os pentes e os espiráculos (ALMEIDA, 2010). O opistossoma é dividido em cinco segmentos e na extremidade um segmento chamado télson (Figura 3).
Figura 3: Morfologia do escorpião.
Fonte: Polis, 1990
Os escorpiões Tityus stigmurus normalmente apresentam um comprimento de 55 a 66 milímetros com uma coloração que varia do amarelo claro ao amarelo escuro. No prossoma é observada uma carapaça granulosa, com carenas bem marcadas e com manchas pigmentares negras, triângulo na porção anterior aos olhos medianos com borda anterior triangular e concavidade mediana fusionada. A quelícera tem coloração amarela uniforme. No pedipalpo, carenas bem marcadas, com espinho basal reduzido na interna, com amarelo uniforme, dedos móveis e fixos com 16-17 e 15-16 fileiras de grânulos, respectivamente. No mesossoma, tergitos com listra negra central e, em alguns casos, listras laterais interrompidas são visíveis. Possui de 23 a 24 pentes. Já o metassoma apresenta manchas escuras na porção ventral antero-dorsal moderado e em sua extremidade o télson onde fica localizada um par de glândulas contendo a peçonha (ALMEIDA, 2010; ALMEIDA, 2011).
As peçonhas escorpionicas são uma mistura de substâncias incluindo muco, sais inorgânicos, lipídeos, peptídeos antimicrobianos, hialuronidases, metaloproteinases, peptídeos sem pontes dissulfeto com atividade vascular, como hipotensinas e principalmente neurotoxinas de baixa massa molecular (COLOGNA et al., 2009; PUCCA et al., 2015). Biologicamente, a peçonha é utilizada na caça para paralisar as presas, porém representa um arsenal farmacológico bastante diversificado para o desenvolvimento de novos fármacos (FERNANDES et al., 2011). A identificação dos componentes da peçonha e seus efeitos nos seres vivos são importantes para o estabelecimento de uma conduta clínica adequada. Além disso, nos últimos anos grande destaque tem sido dado ao potencial terapêutico de toxinas isoladas de animais peçonhentos, em especial de escorpião (PUCCA et al., 2015).
Um estudo desenvolvido por nosso grupo pesquisa, realizou análise transcriptômica da glândula da peçonha do escorpião T. stigmurus e identificou uma variedade de peptídeos com possíveis potenciais farmacológicos, tais como peptídeos antimicrobianos, hipotensinas, toxinas que atuam em canais de potássio e sódio, bem como peptídeos aniônicos, lectinas, metoloproteinases, peptídeos ricos em cisteínas e peptídeos hipoteticamente secretados (ALMEIDA et al., 2012). Dentre as moléculas obtidas, um peptídeo semelhante a classes das hipotensinas (TistH, Tityus stigmurus hipotensina) apresentou potencial de uma molécula caráter multifuncional.
2.2 Peptídeo Tityus stigmurus hipotensina (TistH)
A primeira hipotensina identificada na glândula da peçonha do escorpião Tityus stigmurus foi nomeada de Tityus stigmurus hipotensina (TistH). Trata-se de um peptídeo de 25 aminoácidos (ADMDFTGIAESIIKKIKETNAKPPA), de massa molecular de 2,7 kDa, estruturalmente sem cisteínas e pontes dissulfeto, e com a presença de triplete prolina-prolina-alanina na porção C-terminal, apresentando carga superficial neutra. Com relação a estimativa do percentual do tipo de estrutura secundária foi possível evidenciar a predominância de estruturas de α-hélices, sendo representada por 65% da composição do peptídeo, seguido por 4,5% de estruturas β-folha e 30% de estrutura randômicas (em tampão TFE 50%). A estrutura tridimensional teórica deste peptídeo foi determinada por
dinâmica molecular utilizando o campo de força AMBER-03 e GROMOS96 43a1, onde os resíduos de prolina da posição 23 e 24 são destacados em azul e marrom (Figura 4) (MACHADO et al., 2015).
Figura 4: Estrutura tridimensional do TistH por dinâmica molecular utilizando o campo de força (A) AMBER-03 e (B) GROMOS96 43a1.
Fonte: Machado et al., 2015
Experimentos realizados por nosso grupo demonstraram, em ratos normotensos, que o peptídeo TistH foi capaz de exercer efeito hipotensor por potencializar a ação da bradicinina e induzir efeito vasorelaxante em endotélio de artérias mesentéricas dependente da liberação de óxido nítrico, sem inibir a ação da enzima conversora de angiotensina. Além disso, resultados obtidos em ensaio de hemólise utilizando eritrócitos de cavalos mostram que TistH apresenta baixa toxicidade (Log 10-4 - 10-10 M) (MACHADO et al., 2015).
Além de exercer efeito hipotensor através da potencialização da bradicinina, o peptídeo não causou citotoxicidade em células normais (3T3, RAW 264.7 e HEK-293) e cancerígenas (HeLa, B16-F10, 786-0, SiHa e HepG2), nem induziu inflamação no modelo de bolsa de ar in vivo. Além disso, este peptídeo possui elevada estabilidade, mantendo sua estrutura ativa em altas variações de pH (3 a 9) e temperatura (2 a 96 °C) quando analisado
por dicroísmo circular. O TistH mostrou ser um peptídeo promissor quando avaliado seu efeito antifúngico contra Candida albicans (LM-106), Candida tropicalis ATCC 13308 e Aspergillus flavus (LM-247 e LM-26), bem como contra fungo filamentoso Trichophyton rubrum (M-640) (MACHADO et al., 2016).
2.3 Fatores de resistência e virulência
Nas últimas décadas, a indústria farmacêutica vem produzindo um grande número de antimicrobianos, porém a resistência a estes fármacos por bactérias e fungos tem aumentado significativamente, devido ao uso abusivo e exacerbado de antibióticos, desencadeando uma pressão seletiva dos microrganismos. Além disso, a resistência microbiana tornou-se superior à produção de novos antimicrobianos, tornando-se um sério problema de saúde pública mundial (SPELLBERG et al., 2004; TENOVER, 2006; WRIGHT, 2014; TAMARA et al., 2018).
As espécies do gênero Candida são patógenos oportunistas que atingem principalmente indivíduos imunocomprometidos, sendo responsáveis por uma série de doenças, como candidíase oral e vulvovaginal, infecções de pele e mucosa, assim como doenças sistêmicas, incluindo a candidemia, que está relacionada com uma alta taxa de mortalidade (PEIXOTO et al., 2014).
A candidemia, infecção sistêmica causada por fungos do gênero Candida, é um sério problema em hospitais em todo mundo, responsável por uma alta taxa de morbidade e mortalidade, que está associada à estadias prologadas de pacientes em ambientes nosocomiais, principalmente em paciente expostos à antibacterianos e terapias imunossupressoras, nutrição parenteral e submetidos a procedimentos invasivos e uso prolongado de cateter (WARNOCK, 2007; BROWN et al., 2012; LACKNER; MARTIN-VICENTE; LASS-FLORL, 2015). Dentre as espécies do gênero Candida, Candida albicans é a espécie mais prevalente na candidíase disseminada e considerada mais virulenta (PRABHAKARAN; SENGODAN; RAJESWARI, 2016). No mundo, Candida tropicalis representa a terceira ou quarta mais prevalente, porém na América Latina, mais especificamente no Brasil, ela ocupa o segundo lugar como agente mais frequente na
candidemia, sendo o terceiro lugar ocupado por Candida parapsilosis (NUCCI; COLOMBO, 2007; WARNOCK, 2007).
A candidíase vulvovaginal acomete 75% das mulheres em idade reprodutiva, sendo a Candida albicans principal agente etiológico, representando de 80 a 90% dos casos, enquanto que os 10 a 20% dos demais casos são causados por outras espécies de Candida, como C. glabrata, C. tropicalis e C. parapsilosis (FIDEL; SOBEL, 1996). Trata-se de uma doença que gera um grande desconforto, prejudica as relações sexuais e o desempenho no trabalho, principalmente em mulheres que apresentam episódios recorrentes (três ou mais episódios da doença no ano) (GONÇALVES et al., 2016).
A patogenicidade das espécies do gênero Candida está relacionada com seus fatores de virulência, incluindo a capacidade de aderir às células epiteliais do hospedeiro e a superfícies abióticas, sendo essa uma etapa essencial para a colonização, infecção e formação de biofilme (MONTEIRO et al., 2014). Biofilmes são estruturas de microrganismos aderidos a superfícies bióticas ou abióticas, embebidas em uma matriz de substância polimérica extracelular, cujas células possuem taxas de crescimento e fenótipos alterados (DING et al., 2014).
Na prática clínica, a formação de biofilme é bastante preocupante pois está diretamente relacionada com o desenvolvimento de leveduras resistentes aos antifúngicos convencionais, uma vez que biofilmes apresentam concentrações inibitórias mínimas (CIM) até mil vezes maiores frente a agentes antifúngicos, quando comparada às células planctônicas (DONLAN; COSTERTON, 2002; MITCHELL et al., 2013). A resistência das leveduras que compõem os biofilmes é atribuída as limitações que o antifúngico tem de penetrar através da matriz polimérica, bem como a expressão de genes de resistências e baixa atividade metabólica, principalmente das células localizadas nas camadas mais profundas (HOLMES; CANNON; JENKINSON, 2004).
O desenvolvimento da resistência a antifúngicos convencionais demonstra a necessidade do surgimento de novos medicamentos, favorecendo a busca de novas alternativas terapêuticas em diferentes fontes naturais (SILVA, 2016). Nesse contexto, peptídeos sem pontes dissulfetos de peçonha de escorpiões apresentam amplo espectro de atividade antimicrobiana e baixa indução da resistência microbiana representando um grupo
de moléculas promissoras para aplicação terapêutica (ALMAAYTAH; ALBALAS, 2014; LI et al., 2019).
2.4 Nanopartículas
As pesquisas envolvendo os materiais na escala nanométrica e a síntese destes materiais através da manipulação controlada da sua microestrutura são campos interdisciplinares emergentes. A nanotecnologia está rapidamente convergindo com a biotecnologia e tecnologia farmacêutica para desenvolvimento de novas ferramentas para diagnóstico e tratamento de doenças, sendo as nanopartículas uma alternativa inovadora capaz de superar várias limitações apresentadas pelos medicamentos convencionais (GLEITER, 2000; SANTOS et al., 2018).
As nanopartículas são dispersões coloidais com partículas de tamanhos entre 10 e 1000 nm e podem ser classificadas em nanoesferas e em nanocápsulas, de acordo com a composição e organização estrutural (HAMIDI; AZADI; RAFIEI, 2008). Nas nanoesferas, a molécula de interesse pode estar incorporada à matriz polimérica ou adsorvida a superfície, enquanto que as nanocápsulas são sistemas do tipo reservatório, na quais as moléculas de interesse ficam encapsuladas e separadas do ambiente externo por um núcleo bem definido (KUMARI; YADAV; YADAV, 2010).
Nanopartículas utilizando biopolímeros têm sido amplamente estudadas como produtos farmacêuticos para obtenção de sistemas de liberação controlada devido as suas potencialidades terapêuticas. Estes sistemas apresentam características interessantes como o tamanho na escala nanométrica (tamanho inferior a 200 nm é o parâmetro mais requerido), capacidade de atravessar barreiras biológicas e atingir alvos específicos, além de permitir uma liberação prolongada e controlada, bem como melhoramento de moléculas ativas (SANTOS-SILVA, 2015; AHMED; ALJAEID, 2016; AUWAL et al., 2017). Além disso, nanossistemas poliméricos permitem que tanto ativos hidrofílicos como hidrofóbicos tenham aumento da meia vida na circulação, sejam protegidos da degradação e da liberação progressiva, promovendo a redução da dose administrada e redução da toxicidade do fármaco (TORCHILIN, 2007).
Uma grande variedade de materiais, tanto sintéticos como naturais, vem sendo utilizados na obtenção de sistemas nanoparticulados poliméricos, porém características como biocompatibilidade, biodegradabilidade e toxicidade devem ser levadas em consideração (CASTANHEIRA, 2012). Alguns destes polímeros veem sendo amplamente estudados para o desenvolvimento de formulações, tais como poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA), Poli (ácido-lático) (PLA), policaprolactona (PCL), gelatina, quitosana e polietilenoglicol (PEG) (TARIQ et al., 2015; MESQUITA et al., 2017; HOUSEHOLDER et al., 2018; QUIÑONES; PENICHE; PENICHE, 2018).
2.5 Quitosana
A quitina é um polímero natural extraído de parede celular de fungos e do exoesqueleto de artrópodes. É composto pelas unidades monoméricas de β-(1,4)-2-acetamida-2-desoxi-D-glicose (N-acetil-D-glucosamina). Este polímero natural, de baixa reatividade química, possui uma estrutura cristalina altamente organizada, insolúvel em meio aquoso e na maioria dos solventes orgânicos (HEIN et al., 2008; QUIÑONES; PENICHE; PENICHE, 2018). A insolubilidade da quitina é o fator limitante da sua utilização, por isso, a quitosana é obtida pela reação de desacetilação da quitina em meio alcalino, podendo facilmente se dissolver em soluções de ácidos fracos diluídos, devido à protonação de seus grupos amino, para isso, o solvente mais empregado é o ácido acético (ROCHA SOARES et al., 2017). A quitosana é um co-polímero formada por moléculas de N-acetil-D-glicosamina e D-glicosamina, unidas por ligações β-1,4, formando uma longa cadeia linear composta de três grupos funcionais reativos, um grupo amino e dois grupos hidroxilas primário e secundário nas posições dos carbonos C-2, C-3 e C-6 respectivamente (Figura 5) (LARANJEIRA; FÁVERE, 2009; QUIÑONES; PENICHE; PENICHE, 2018).
Figura 5: Representação esquemática do polímero de quitosana.
Fonte: Castanheira, 2012
A quitosana demonstrou ser bastante promissora na inibição de crescimento de bactérias, fungos e leveduras (BENHABILES et al., 2012; MUXIKA et al., 2017). Quando testada frente a vários microrganismos patogênicos, demostrou ter atividade bacteriostática, bactericida e candidicida (MUZZARELLI et al., 1990; TAMARA et al., 2018). Além disso, vem sendo amplamente utilizada na indústria farmacêutica por suas propriedades biológicas, dentre as quais pode-se destacar a biocompatibilidade, biodegradabilidade, baixo custo de produção, baixa toxicidade, não-irritante e aprovação regulamentada (AUWAL et al., 2017). A estrutura química da quitosana apresenta características especiais do ponto de vista biotecnológico devido à sua elevada densidade de cargas positivas em solução ácida, estabelecendo uma forte interação eletrostática entre os grupamentos amino, permitindo assim atuar como um importante transporte de ativos ao se adsorver em superfícies carregadas negativamente (BAO; LI; ZHANG, 2008). Macromoléculas com carga negativa, tais como, peptídeos, proteínas, oligonucleotídeos, DNA e RNA podem ser eficientemente encapsulados às nanopartículas de quitosana, devido ao seu caráter catiônico (PAN et al., 2002; GAN et al., 2005; ROCHA SOARES et al., 2017; MA; WANG; YANG, 2019; RAI; ALWANI; ILDIKO, 2019).
Quando o sistema nanoparticulado é desenvolvido para carreamento de fármacos/proteínas, é primordial controlar as características físico-químicas, tais como tamanho do diâmetro da partícula e distribuição de tamanho e carga de superfície, uma vez que estes fatores podem influenciar na liberação do ativo (KOPPOLU; ZAHAROFF, 2013; KOPPOLU et al., 2014). Esses nanossistemas formados a partir de quitosana apresentam alguns aspectos que os tornam mais interessantes para a encapsulação e liberação de
macromoléculas, tais como: obter partículas de tamanho homogêneo e ajustável, em condições brandas, com carga de superficial positiva que pode ser facilmente modulada (JANES; CALVO; ALONSO, 2001; ABRUZZO et al., 2019).
Existem vários métodos descritos na literatura para o desenvolvimento de nanopartículas poliméricas, entre eles: spray-drying, gelificação iônica, complexação de polieletrólito, coacervação/precipitação, dessolvatação, coalescência e emulsão com evaporação de solvente (AGNIHOTRI; MALLIKARJUNA; AMINABHAVI, 2004; VAUTHIER; BOUCHEMAL, 2009; CRUCHO; BARROS, 2017). Muitos destes utilizam solventes orgânicos, alteram a conformação dos ativos, outros podem oferecer rendimento de associação do ativo baixo, outros requerem temperaturas ou pH muito altos ou baixos, os quais podem inativar as moléculas incorporadas (SILVA et al., 2003). Então, a escolha por um método que além de simples e de custo baixo, seja mais eficaz e garanta a estabilidade do ativo sem causar toxidade é sempre desejada. Dentre os principais métodos, a gelificação iônica é a técnica que mais apresenta vantagens, pois não necessita de solventes orgânicos, é de simples execução, não dispendiosa e é compatível para a incorporação de macromoléculas como peptídeos, DNA, RNA, oligonucleótideos e proteínas (RAMPINO et al., 2013). Trata-se de uma gelificação que se dá pela formação de ligações cruzadas por poliânions que se comportam como agente reticulantes, sendo o sal TPP (tripolifosfato de sódio) um dos mais utilizados (ROCHA SOARES et al., 2012, 2017; GLÁUCIA-SILVA et al., 2018).
3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral
Obter e caracterizar fisico-quimicamente nanopartículas de quitosana contendo o peptídeo TistH, avaliar a biocompatibilidade, bem como a potencialização do efeito antifúngico dos sistemas nanoparticulados in vitro.
3.2 Objetivos específicos
- Obter as nanopartículas de quitosana reticuladas com TPP e aprisionar o TistH às nanopartículas utilizando diferentes métodos, incorporação e adsorção, nas concentrações de 0,5 e 1,0 % (m/v);
- Determinar o diâmetro médio das partículas, índice de polidispersidade e potencial zeta, para ambos métodos de obtenção;
- Calcular a eficiência de incorporação e o perfil de liberação do peptídeo tanto para o método de incorporação, como de adsorção;
- Confirmar a incorporação do peptídeo aos nanossistemas de quitosana, para ambos os métodos;
- Verificar as interações químicas entre os grupamentos funcionais das nanopartículas com o TistH, em ambos métodos de obtenção;
- Avaliar a morfologia das nanopartículas através de imagens obtidas por microscopia em ambos métodos;
- Avaliar a estabilidade físico-química dos nanossistemas (tamanho e índice de polidispersidade) por 4 meses de todas as formulações;
- Avaliar a biocompatibilidade dos nanossistemas em eritrócitos humanos, células Vero E6 e RAW 246.7 de todas as formulações;
- Avaliar a potencialização do efeito antifúngico frente a cepas do gênero Candida em todas as formulações;
- Avaliar a interferência dos nanocarreadores contendo peptídeo, em ambos os métodos de obtenção, frente a formação de biofilme produzido por cepas clínicas do gênero Candida obtidas de hemocultura e candidíase vulvovaginal.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Obtenção do peptídeo TistH
A sequência do peptídeo TistH foi deduzida a partir do cluster TSTI0006C proveniente do repertório molecular do transcriptoma da glândula da peçonha do escorpião T. stigmurus (ALMEIDA et al., 2012). Trata-se de um peptídeo com 25 aminoácidos (ADMDFTGIAESIIKKIKETNAKPPA) com massa molecular de 2,7 kDa pertencente à classe das hipotensinas (MACHADO et al., 2016). A partir da sequência de aminoácidos, o peptídeo foi sintetizado e obtido da empresa Invitrogen Life Technologies® (Califórnia, Estados Unidos da América) com grau de pureza superior a 98%. A empresa forneceu as análises por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (ANEXO A) e Espectrometria de Massa (ANEXO B) para confirmação da pureza. O uso científico deste material biológico foi previamente aprovado pelo Conselho de Gestão do Patrimônio Genético (CGEN) (Número do processo 010844/2013-9, 25/10/2013).
4.2 Obtenção das nanopartículas de quitosana para veiculação do peptídeo TistH
As nanopartículas de quitosana (NQ) foram obtidas através da técnica de gelificação iônica. No primeiro momento foi preparado 5 mL de quitosana 0,1% (m/v) (85% desacetilada
com massa molecular de 90-190 kDa, Sigma-Aldrich®, Saint Louis, Missouri, Estados Unidos da América) em uma solução de ácido acético 0,175% (v/v) (pH 4,0), posteriormente
a solução foi filtrada utilizando membranas de 0,45 μm. Em paralelo, foi preparada uma solução de 2 mL de tripolifosfato de sódio (TPP, Sigma-Aldrich®) 0,1% (m/v) em água
destilada (pH 9,0). A solução de TPP foi vertida na solução de quitosana, por gotejamento (agulha 0,45 x 13 mm), sob agitação constante de 300 rpm a temperatura ambiente de 25 °C por 30 minutos, até se observar a formação de uma dispersão opalescente (pH 5,0) com um volume final de nanopartículas produzidas de 7 mL (Figura 6) (GAN; WANG, 2007; ROCHA SOARES et al., 2012, 2017, 2018).
Figura 6: Esquema representativo da obtenção das nanopartículas de quitosana.
Fonte: Autoria própria
4.2.1 Incorporação do peptídeo TistH às nanopartículas de quitosana
As nanopartículas de quitosana contendo o TistH foram produzidas por dois diferentes métodos. No método de incorporação (NQ-TistH-Inc) o peptídeo TistH foi previamente dissolvido em água estéril na concentração de 1 mg/mL. Volumes pré-determinados desta solução foram adicionados a solução de TPP 0,1% (m/v) de modo a obter concentrações de 0,5 e 1,0% (m/v) deste peptídeo em relação a massa da quitosana presente na solução a 0,1% (m/v). As concentrações de 0,5 e 1,0% de peptídeo TistH foram estabelecidas a partir de estudos prévios realizados por nosso grupo de pesquisa. A solução de TPP/peptídeo foi gotejada na solução de quitosana e mantida sob as mesmas condições da metodologia de obtenção de nanopartículas do item 4.2 (Figura 7) (ROCHA SOARES et al., 2012, 2017, 2018).
Figura 7: Esquema representativo do método incorporação do TistH às nanopartículas de quitosana.
Fonte: Autoria própria
4.2.2 Adsorção do peptídeo TistH às nanopartículas de quitosana
Para o método de adsorção (NQ-TistH-Ads), as nanopartículas foram produzidas conforme o item 4.2. Após a formação, volumes pré-determinados do TistH foram adicionados de modo a obter concentrações de 0,5 e 1,0% (m/v) deste peptídeo em relação a massa da quitosana presente na solução a 0,1% (m/v). Posteriormente os sistemas foram submetidos a agitação constante de 300 rpm sob a temperatura ambiente de 25 °C por 1 hora (Figura 8) (GLÁUCIA-SILVA et al., 2018).
Figura 8: Esquema representativo do método adsorção do TistH às nanopartículas de quitosana.
Fonte: Autoria própria
4.3 Caracterização físico-química
4.3.1 Potencial zeta, tamanho de partícula e índice de polidispersidade
O potencial zeta das nanopartícula foi determinado utilizando um analisador de tamanho de partículas (Zeta Plus-Brookhaven Instruments) através do aparato ZetaPALS, com a aplicação de um campo de força de 5,9 V/cm. Neste equipamento também está acoplado um aparato 90 Plus/BI-MAS, que determina o diâmetro médio das partículas e o índice de polidispersidade através de uma análise de espalhamento de luz dinâmico. As análises foram realizadas a 25 ºC em 659 nm, com ângulo de espalhamento 90º. O software Zeta Plus® Particle Sizing versão 3.95 foi utilizado e a polidispersidade menor que 0,5 foi o score estabelecido para todas as análises (ROCHA SOARES et al., 2012; SANTOS-SILVA et al., 2017). Amostras em triplicata foram analisadas e os dados expressos em média ± desvio padrão.
4.3.2 Eficiência de incorporação do peptídeo TistH
Amostras de 1 mL de NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0 % foram colocadas em microtubos de 1,5 mL e centrifugadas a 20000 x g, 4 °C durante 30 minutos. A concentração protéica do sobrenadante das amostras foi determinada pelo método do ácido bicinconínico utilizando Kit de BCA Protein Assay de acordo com as recomendações do fabricante (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos da América). A eficiência de incorporação de proteínas (EIP) foi calculada usando a Equação 1 e expressa em porcentagem (GAN et al., 2005; VENKATESAN; VIMAL; HAMEED, 2013).
EIP =(𝑝𝑒𝑝𝑡í𝑑𝑒𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 − 𝑝𝑒𝑝𝑡í𝑑𝑒𝑜 𝑞𝑢𝑎𝑛𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜 𝑛𝑜 𝑠𝑜𝑏𝑟𝑒𝑛𝑎𝑑𝑎𝑛𝑡𝑒)
𝑝𝑒𝑝𝑡í𝑑𝑒𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑥 100 Eq. (1)
4.3.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)
A eletroforese em gel de poliacrilamida 15% em presença de SDS foi realizada para confirmar a incorporação do peptídeo às nanopartículas de quitosana em ambos os métodos de obtenção, utilizando o sistema de minigel (Mini-ProteanTM II). As amostras foram misturadas ao tampão de amostra com redução (Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 contendo glicerol 10 %, β-mercaptoetanol 10 %, dodecil sulfato de sódio 2 % e azul de bromofenol 0,05 %) seguida por fervura a 100 °C durante 5 minutos. O marcador de massa molecular foi obtido comercialmente (Gibco-BRL Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, Estados Unidos da América). A eletroforese foi desenvolvida verticalmente, em placas de dimensão 10,0 x 8,0 x 0,8 cm, à 150 V, 50 mA, durante 3 horas (LAEMMLI, 1970). O gel foi corado com solução de Coomassie Brilliant Blue R-250 concentrada (Coomassie Brilliant Blue 0,5 %, metanol 40 % e ácido acético 10 %).
4.3.4 Espectroscopia na região de infravermelho
Os espectros de absorção no infravermelho foram obtidos através do espectrofotómetro, Prestige 21 (Shimadzu, Tóquio, Japão), a fim verificar a ocorrência das ligações intermoleculares entre os grupos fosfato do TPP e amina da quitosana, comprovando a reticulação por gelificação iônica, bem como a ocorrência de ligações do peptídeo TistH à nanopartículas de quitosana, por ambos os métodos de obtenção. As amostras foram secas em concentrador a vácuo (Centrivap Labconco, Kansas, Estados Unidos da América), em seguida misturadas com brometo de potássio (KBr) e comprimidas em prensa hidráulica. A proporção em peso entre o pó das amostras e o KBr foi de 1: 200 (p/p) (ROCHA SOARES et al., 2012; GLÁUCIA-SILVA et al., 2018).
4.3.5 Microscopia de força atômica (MFA) e microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo (MEVFEG)
A forma e a superfície das nanopartículas foram analisadas por Microscopia de Força Atômica (SPM-9700, Shimadzu, Tóquio, Japão) e Microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo (Zeiss, Auriga, Jena, Alemanha). Para obtenção das imagens por MFA, as amostras foram preparadas espalhando-se uma gota da dispersão de nanopartículas na lâmina de microscópio, mantidas em dessecador por 24 horas. As imagens foram obtidas com microscópio de força atômica com ponteira (tip) de silício, operando na região atrativa em modo de não-contato do cantilever, numa frequência de 1 Hz (MESQUITA et al., 2017; ROCHA SOARES et al., 2018). Para obtenção das imagens por MEVFEG, as amostras foram preparadas espalhando-se uma gota da dispersão de nanopartículas na lâmina de fita de carbono do microscópio, mantidas em dessecador por 24 horas.
4.3.6 Estabilidade físico-química
NQ, NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0 % foram hermeticamente fechadas, armazenadas (4 ± 2 °C) e analisadas semanalmente por dois
meses, e depois dos dois meses passaram a ser analisadas mensalmente até completar 4 meses de análise. As amostras foram analisadas e o tamanho das partículas e índice de polidispersidade determinados. Amostras em triplicata foram analisadas e os dados expressos em média ± desvio padrão. As análises foram realizadas usando os parâmetros descritos na seção 4.3.1.
4.3.7 Ensaio de liberação in vitro
Para determinar o perfil de liberação in vitro do peptídeo, 1 mL de NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0% foram colocadas em microtubos de 1,5 mL, incubadas em solução tampão fosfato pH = 7,4 (KH2PO4 0,05 mol/L) e mantidas em
banho termostatizado à 37 ºC, em condição sink. Em intervalos de tempo pré-determinados, os nanossistemas foram centrifugadas a 16000 g a 4 ºC por 30 minutos e o meio de dissolução (800 µL do sobrenadante) retirado para a dosagem de proteínas totais até 24 horas. Um novo volume de solução tampão foi adicionado (800 µL) aos tubos de dissolução, os quais foram mantidos no banho termostatizado até o próximo tempo de coleta. A concentração de proteína foi determinada pelo método do ácido bicinconínico utilizando o Kit de BCA Protein Assay. A massa percentual acumulada de proteínas foi plotada versus o tempo e diferentes modelos matemáticos foram utilizados para linearizar os dados experimentais. Os modelos matemáticos aplicados para cinética de liberação foram: Primeira ordem, Bhaskar, Freundlich modificado e difusão parabólica (MESQUITA et al., 2017; ROCHA SOARES et al., 2017).
4.4 Biocompatibilidade
4.4.1 Células
Células Vero E6 (ATCC CRL-1586, linhagem de células normais de rim de macaco verde africano) e RAW 246.7 (ATCC TIB-71, linhagem de macrófagos de murinos) foram gentilmente cedidas pelo Laboratório de Biotecnologia de Biopolímeros Naturais, Centro de Biociências, Campus Universitário, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. As células foram mantidas em Meio DMEM (Meio de Eagle modificado por Dulbecco),
suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF), 1% penicilina-estreptomicina, sob condições estéreis à 37 ºC e atmosfera umidificada.
4.4.2 Ensaio de viabilidade celular
A citotoxicidade das NQ, NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0% foi avaliada utilizando o ensaio de MTT (brometo de 3-metil-[4-5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio) (MOSMANN, 1983). Resumidamente, cada cultura de célula foi plaqueada em microplacas de 96 poços com densidade de 5 × 103 células/poço (Vero E6) e 7 × 103 células/poço (RAW 264.7) e mantidos em meio DMEM a 37 °C com 5% CO2 e
atmosfera umidificada, overnight. Monocamadas de células confluentes contidas na placa foram incubadas com 100 μL de nanopartículas de NQ em diferentes concentrações (357 - 11 μg/mL) e 357, 178 e 89 μg/mL de NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-Ads (0,5 e 1,0%) por 24 horas a 37 °C. Posteriormente 100 μL de meio de crescimento foram aspirados e incubado em uma placa com 100 μL da solução de MTT (1 mg/mL) por 4 horas. Os cristais violeta de formazan foram dissolvidos em 100 μL de etanol 96% e a absorbância medida a 570 nm utilizando um leitor de microplacas (Epoch, BioTek®, Winooski, Vermont, Estados Unidos da América). A viabilidade celular (VC) foi analisada em triplicata, calculada usando a Equação 2 e expressa em porcentagem.
%VC = (𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑎𝑠 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑑𝑎𝑠 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎𝑠)
(𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑎𝑠 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑑𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜) 𝑥 100 Eq. (2)
4.4.3 Ensaio hemolítico
A toxicidade das NQ, NQ-TistH-Inc e NQ-TistH-Ads nas concentrações 0,5 e 1,0% foi avaliada através do ensaio hemolítico utilizando sangue de doador humano saudável de acordo com a metodologia descrita por Menezes et al. (2014) com algumas modificações. A suspensão de eritrócitos 2% (v/v) foi lavada 3 vezes em de tampão fosfato salino (PBS, pH
7,4) e centrifugada a 200 g por 10 minutos. Os glóbulos vermelhos foram incubados durante 60 minutos a 37 °C com as amostras em diferentes concentrações (357, 178 e 89,
44 e 22 μg/mL) e centrifugados a 200 g por 10 minutos. O teor de hemoglobina presente no sobrenadante foi quantificado a 540 nm em um leitor de microplacas (Epoch-Biotek, Winooski, Vermont, Estados Unidos da América), indicando a lise das hemácias. Como controle positivo do ensaio foi utilizado água ultrapura (100% de lise celular) e como controle negativo PBS (0% de lise celular). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Onofre Lopes) sob número de protocolo 3127063. A hemólise foi analisada em triplicata, calculada usando a Equação 3 e expressa em porcentagem.
% Hemólise = (𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑎 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎)
(𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜) 𝑥 100 Eq. (3)
4.5 Atividade antifúngica 4.5.1 Microrganismos
Para a o ensaio de concentração inibitória mínima (CIM), utilizando o método de microdiluição em caldo Mueller Hinton, as seguintes cepas de referência de Candida foram providenciadas da American Type Culture Collection (ATCC) e da Netherlands Collection Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS): Candida albicans ATCC 90028, C. tropicalis ATCC 13803, C. dubliniensis CBS 7987, C. parapsilosis ATCC 22019, C. glabrata ATCC 2001, C. krusei ATCC 6258 e C. rugosa ATCC 10571. Para avaliar a formação do biofilme, isolados clínicos de C. tropicalis LMMM195, C. tropicalis LMMM447, C. albicans LMMM112, C. albicans LMMM238, C. krusei LMMM249, C. glabrata LMMM704, C. parapsilosis LMMM83 e C. parapsilosis LMMM85 obtidos de hemoculturas de pacientes com candidíases sistêmicas, bem como C. albicans LMMM74, LMMM92 e LMMM100 obtidas de secreção vaginal de pacientes com candidíase vulvovaginal foram utilizados. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (Comitê de Ética em Pesquisa da Liga Norte Riograndense Contra o Câncer) sob número de protocolo 042/042/2012. As cepas foram estocadas a -80 ºC em meio de extrato de levedura-peptona-dextrose (YPD) (10 g/L extrato de leveduras, 20 g/L glicose e 20 g/L
peptona micológica), contendo 20% (v/v) de glicerol, pertencentes a coleção de cultura do
Laboratório de Micologia Médica e Molecular do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Brasil.
Para confirmação da identidade das leveduras foram semeadas com o auxílio de alças de níquel-cromo pela técnica de esgotamento, em placas de petri (90 x 15 mm) contendo meio CHROMagar Candida® (CHROMagarTM Candida, Difco, Estados Unidos da América), meio cromogênico seletivo, que permite a identificação de culturas mistas de leveduras. As placas foram incubadas a 37 °C de 24 a 72 horas, onde foi verificada a coloração apresentada por cada levedura (BAUMGARTNER; FREYDIERE; GILLE, 1996).
4.5.2 Preparo do inóculo
As culturas de leveduras foram reativadas com duas passagens subsequentes em Agar Sabouraud Dextrose (Difco, Interlab, São Paulo, Brasil) por 48 horas a 35 °C. Em seguida, foi preparada uma suspensão em solução salina estéril 0,85%, agitando em vórtex, e ajustada de acordo como tubo 0,5 da escala de McFarland, que equivale à concentração de 1 a 5x106 UFC/mL. Depois da suspensão preparada, foram realizadas duas diluições: 1:50 em solução salina estéril e uma nova diluição de 1:20 em caldo Mueller Hinton (HiMedia, Mumbai, Índia) (CLSI, 2008; DALBEN-DOTA et al., 2010).
4.5.3 Concentração inibitória mínima (CIM)
O caldo Mueller Hinton (HiMedia) foi preparado de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, foram adicionados 100 μL de meio nos poços das colunas de 2 à 11 e 200 μL na coluna 12 (controle de esterilidade), em placas de microtitulação de 96 poços. Posteriormente, foram adicionados 100 μL de peptídeo TistH, NQ, TistH-Inc e NQ-TistH-Ads nas concentrações de 0,5 e 1,0 % nos poços das colunas 1 e 2. Com o auxílio de uma micropipeta multicanal, foi realizada uma diluição seriada partindo da coluna 2, homogeneizando e retirando-se 100 μL da mistura (meio e nanopartículas) e adicionando ao poço da coluna seguinte (3), repetindo o procedimento da mesma maneira até a coluna
10, desprezando os 100 μL restantes. Após a montagem das placas, foram adicionados 100 μL do inóculo contendo as células de Candida spp. em cada poço, exceto na coluna 12 (apenas o meio) (Figura 9). Logo após, as placas foram incubadas a 35 °C por 48 horas. As leituras foram realizadas após o período de incubação (48 horas), observando-se o crescimento nas respectivas diluições através de comparação visual. A CIM foi considerada como a menor concentração dos nanossistemas capaz de inibir 100% ou 50% do crescimento de cada cepa, tomando como referência o respectivo controle positivo (controle de crescimento) (CLSI, 2008; DALBEN-DOTA et al., 2010; SOUZA et al., 2018).
Figura 9: Esquema representativo para o ensaio de concentração inibitória mínima.
4.5.4 Concentração fungicida mínima (CFM)
Após a CIM, verificou-se inibição total do crescimento das leveduras em relação ao poço controle de crescimento para Candida albicans, C. tropicalis e C. parapsilosis. Para isso, a concentração fungicida mínima foi determinada. Uma alíquota de 100 μL de cada poço, onde o crescimento visual não pôde ser detectado foi aliquotada, assim como o crescimento positivo e negativo dos controles e semeado em meio de cultura Sabouraud Dextrose Agar (Sigma-Aldrich) na forma de spot incubadas a 37 ºC por 48 horas. Para
