ESTUDO FITOQUÍMICO DE EUPHORBIA TIRUCALLI

A espécie de Euphorbia tirucalli L. utilizada para estudo fitoquímico foi coletada em maio de 2006 na localidade de Horto de Plantas Medicinais – CE por Dárdano de Andrade Lima do departamento de Química Orgânica da Universidade Federal do Ceará e identificada por Matos. A exsicata da espécie encontra-se depositada no Herbário Prisco Bezerra daquele Departamento, sob número de registro EAC 0038702.

5.3.2 Obtenção dos Extratos

O material vegetal da parte aérea fresca de Euphorbia tirucalli coletada, após completamente seco, foi triturado utilizando um moinho de facas para posterior processo de extração. Então, todo o material vegetal (974,686 g) foi submetido a

extração a frio com hexano (foram realizadas três extrações após o repouso de 48 horas entre cada extração). As soluções resultantes da extração foram filtradas e evaporadas em evaporador rotativo sob pressão reduzida, obtendo 117,77 g do extrato hexano denominado EHPAET (Extrato Hexano da Parte aérea da Euphorbia tirucalli).

5.3.3 Atividade antioxidante

A atividade antioxidante do extrato EHPAET foi averiguada por testes com DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) de acordo com o procedimento de Souza (2007) com algumas modificações. Os testes foram realizados no Laboratório de Isolamento e Síntese de Compostos Orgânicos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (LISCO).

Inicialmente, foi preparada uma solução de DPPH com concentração de 0,04 mg/ml em metanol, também foi preparada uma solução do extrato EHPAET com concentração de 500 μg/mL pela dissolução em etanol (solução estoque). Em seguida, foram preparadas diluições a partir da solução mãe, com concentrações de 0,5; 1,0; 1,5;

2,0; 2,5; e 3,0 μg/mL e volumes totais de 2,0 mL para cada (soluções filhas) conforme

observado na Tabela 1.

Tabela 1 – Dados referentes as diluições das soluções filhas.

Solução Filha do EHPAET Nº Concentração (mg/mL) Volume da Solução Filha (mL) Volume do Solvente (mL) 1 0,500 0,3 1,7 2 1,000 0,7 1,3 3 1,500 1,0 1,0 4 2,000 1,3 0,7 5 2,500 1,7 0,3 6 3,000 2,0 0,0

Em seguida tomou-se alíquotas de 0,3 mL de cada uma das soluções diluídas, bem com da solução mãe, em triplicata, e a cada uma destas foi adicionado 2,7 mL de DPPH, totalizando um volume de 3,0 mL. O branco foi preparado pela adição de 2,7 mL de metanol à 0,3 mL de cada amostra. Preparadas as soluções esperou-se 30

minutos em repouso para então iniciar as medidas de absorbância, utilizando comprimento de onda de λ=517 nm.

A capacidade de eliminar o radical DPPH (% de atividade antioxidante, AA%) foi calculada utilizando-se a Equação 1.

Equação 1 – Equação para obtenção dos resultados AA%.

AA% = 100 – {[Abs amostra – Abs branco) x 100] /Abs controle}

Onde:

Absamostra = 0,3 mL da Amostra + 2,7 mL de DPPH

Absbranco = 0,3 mL da amostra + 2,7 mL de MeOH

Abscontrole = DPPH puro (0,04 mg/mL)

5.3.4 Obtenção dos constituintes saponificáveis e insaponificáveis da fração EHPAET

5.3.4.1 Saponificação

A fração EHPAET (5,0 g) foi submetida a reação de saponificação. Assim, inicialmente, a amostra foi solubilizada na menor quantidade possível de CHCl3, e em

seguida esta foi transferida para um balão de 250 mL juntamente com 37,5 mL de uma solução alcoólica de NaOH (7,5 g/37,5 mL de etanol), conforme informações contidas na Tabela 2.

Tabela 2 – Quantidades de reagentes utilizados na saponificação.

Extrato Qtde / (g) NaOH (g) MeOH (mL)

EHPAET 5,0 7,5 37,5

Fonte: Própria.

O sistema reacional foi montado e a reação foi mantida sob agitação e refluxo a 60 °C por duas horas. Posteriormente, adicionou-se ao sistema reacional 60 mL de água destilada, e em seguida o sistema foi transferido para um funil de separação. Então, os insaponificáveis foram extraídos com CHCl3 (3 x 30 mL).

Assim, a fração contendo os insaponificáveis, foi seca com sulfato de sódio anidro (NaSO4), filtrada, concentrada por destilação do solvente sob pressão reduzida

5.3.4.2 Esterificação

Após a remoção dos insaponificáveis, a fase hidroalcoólica alcalina, contendo os ácidos graxos, foi submetida a reação de esterificação para análise dos ésteres metílicos correspondente . Assim, a mistura foi acondicionada em um balão de 150 mL juntamente com 15 mL de metanol e 1,5 mL de ácido clorídrico concentrado para manter um pH de 1-3. A mistura reacional foi mantidas sob agitação e refluxo, 60 °C, por uma hora. Após este período, foi adicionado 60 mL de uma solução saturada de NaCl. A mistura foi transferida para um funil de separação e os ésteres metílicos foram extraídos com clorofórmio (3X 60 mL) em seguida, com acetato de etila (3X 50mL). As fases orgânicas, contendo os ésteres, foram secas com Na2SO4 anidro, filtradas e

concentradas por destilação do solvente em evaporador rotativo sob pressão reduzida, resultando em 0.2687 g da fração clorofórmio (EHPAET-EM-C) e 0,0976 g a fração acetato (EHPAET-EM-A). Então os ésteres foram submetidos a análise de CG-MS para conhecimento de seus ácidos graxos correspondentes.

5.3.5 Fracionamento Cromatográfico de EHPAET-C-insap

A fração EHPAET-C-insap (1,0 g) foi submetida à cromatografia em coluna para separação de suas substâncias por diferença de polaridade. Assim, inicialmente, a fração EHPAET-C-insap (1,00 g) foi adsorvida em gel de sílica flash numa proporção 1:3 e pulverizada em gral de porcelana, sendo em seguida, acondicionada sobre 62,71 g de gel de sílica flash, numa coluna cromatográfica (Φ = 3,0 cm). A eluição foi realizada com solventes puros ou mistura binária dos solventes: hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol, sempre seguindo uma ordem crescente de polaridade. Conforme Tabela 3.

Tabela 3 – Proporções de solventes e volumes para a obtenção das frações de 1-14 a partir da fração EHPAET-C-insap. ELUENTE/PROPORÇÃO VOLUME (mL) FRAÇÕES Hexano/clorofórmio 30% 200 EHPAET-C-insap-HC-(1) Hexano/clorofórmio 50% 200 EHPAET-C-insap-HC-(2) Hexano/clorofórmio 90% 250 EHPAET-C-insap-HC-(3)

Clorofórmio /acetato de etila 20% 200 EHPAET-C-insap-CA-(4-7)

Clorofórmio /acetato de etila 30% 100 EHPAET-C-insap-CA-(8)

Clorofórmio /acetato de etila 70% 200 EHPAET-C-insap-CA-(9-11)

Acetato de etila 100% 100 EHPAET-C-insap-A-(12)

Acetato de etila/metanol 40% 100 EHPAET-C-insap-A-(13)

Acetato de etila/metanol 60% 250 EHPAET-C-insap-A-(14)

Fonte: Própria, 2017.

O fracionamento cromatográfico resultou em 14 frações as quais foram analisadas por CCD e em seguida reunidas conforme semelhança. A fração EHPAET- C-insap-HC-(3) após analisada por CCD foi lavada com hexano/clorofórmio na proporção 5:2 e identificou-se uma amostra pura, a qual foi submetida à análise de RMN 1H e 13C, e teve sua estrutura química elucidada.