CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA INSTITUTO DE QUÍMICA
Maria de Fátima Rocha de Lima
Estudo fitoquímico e avaliação da atividade antioxidante de um extrato apolar de Euphorbia tirucalli
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Lima, Maria de Fátima Rocha de.
Estudo fitoquímico e avaliação da atividade antioxidante de um extrato apolar de Euphorbia tirucalli / Maria de Fátima Rocha de Lima. - Natal, 2018.
62 f.: il.
Monografia (graduação) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências Exatas e da Terra, Instituto de
Química. Natal, RN, 2017.
Orientadora: Profa. Dra. Renata Mendoça de Araújo. 1. Atividade antioxidante - Monografia. 2. Euphorbia tirucalli - Monografia. 3. Terpenos - Monografia. I. Araújo, Renata Mendoça de. II. Título.
Maria de Fátima Rocha de Lima
Estudo Fitoquímico e Avaliação da Atividade de um extrato apolar de Euphorbia Tirucalli
Trabalho de conclusão de curso apresentada ao curso de Química Bacharelado da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de bacharel.
Orientadora: Profa. Dra. Renata Mendonça de Araújo
Maria de Fátima Rocha de Lima
Estudo Fitoquímico e Avaliação da Atividade Antioxidante de um extrato apolar de Euphorbia Tirucalli
Monografia apresentada ao curso de Química Bacharelado da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito obrigatório à obtenção do título de Bacharel.
Orientadora: Profa. Dra. Renata Mendonça de Araújo
Monografia aprovada em: ___/___/___
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dra. Renata Mendonça Araújo
Universidade Federal do Rio grande do Norte – UFRN Orientadora
Prof. Dr. Fabiano do Espírito Santo gomes Universidade Federal do Rio grande do Norte – UFRN
Membro
Prof. Ms. Rusceli Diego de Araújo
Universidade Federal do Rio grande do Norte – UFRN Membro
Dedico este trabalho a minha filha, Analice Rocha de Lima, por ser motivação dos meus esforços.
AGRADECIMENTOS
A Deus, o responsável por minha existência, e pelas oportunidades permitidas em minha vida.
À minha filha Analice, meu amor maior, que mudou minha vida, minhas atitudes e me fez amar de forma incondicional.
Aos meus pais por serem eternos em minha vida.
À minha orientadora, Renata Mendonça, pela construção de conhecimentos.
Aos meus amigos, pelo companheirismo de sempre, por toda paciência, compreensão e amizade.
E a todos que de alguma forma participaram da construção deste trabalho e que não foram citados aqui, meu muito obrigado!
“As raízes da educação são amargas, mas seus frutos são doces.”
RESUMO
As plantas do gênero Euphorbia, pertencentes à família Euphorbiaceae, são tradicionalmente empregadas na medicina popular no tratamento de tumores, doenças infecciosas e inflamatórias. Euphorbia tirucalli L., popularmente conhecida como Avelós, é uma espécie de origem Africana e foi trazida para o Brasil por volta do ano de 1982. Essa possui um considerável número de usos medicinais e seu látex é usado para tratamento de reumatismo, verrugas, tosse, asma, dor de ouvido e de dente doenças de pele entre outros. Os quais estar relacionados à presença de seus constituintes bioativos, incluindo o álcool eufol, α-euforbol, taraxasterol, tirucallol etc. Em virtude dos diversos usos dessa espécie pela medicina popular o presente trabalho foi destinado ao estudo da fração hexano de E.
tirucalli, que possibilitou a identificação de um triterpeno, β-amirina, a partir de técnicas
espectroscópicas. Também foi realizada a avaliação da atividade antioxidante a partir do extrato hexano da parte aérea de E. tirucalli como continuação do estudo fitoquímico desta espécie. A caracterização e a elucidação estrutural dos compostos foram realizadas através da análise dos dados de espectrometria de massa e Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio-1 e Carbono-13, atravém se seguências de pulsos unidimencional e comparação com dados da literatura.
ABSTRACT
Plants of the genus Euforbia, belonging to the Euforbiaceae family, are traditionally employed in folk medicine in the treatment of tumors, infectious and inflammatory diseases.
Euphorbia tirucalli L., popularly known as Aveloz, is a species of African origin and was
brought to Brazil around the year 1982. It has a considerable number of medicinal uses and its latex is used for treatment of rheumatism, warts, cough, asthma, ear and toothache, skin diseases, among others. These may be related to the presence of its bioactive constituents, including euphol, α-euphorbol, taraxasterol, tirucallol, etc. Due to the diverse uses of the species by popular medicine in the present work proposed to the study of an apolar fraction of E. tirucalli, that allowed the identification of a triterpene, β-amyrin, from spectroscopic techniques. The evaluation of the antioxidant activity from hexane extract of the E. tirucalli aerial part was also carried aut as a continuation of the phytochemical study of this species. The caracterization and structural elucidation of the compounds were performed through mass spectrometry and spectrometric (NMR 1H and 13C, mass) and comparison with leterature data.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Constituintes isolados do gênero Euphorbia. ... 14
Figura 2 – Constituintes isolados na espécie Euphorbia tirucalli. ... 16
Figura 3 – Espécie Euphorbia tirucalli. ... 17
Figura 4 – Exemplos de alguns terpenos e sua classificação quanto à quantidade de carbonos ... 18
Figura 5 – Proposta da biossínteses para formação de diferentes terpenos. ... 19
Figura 6 – Continuação da proposta da Biossínteses para formação de diferentes terpenos. ... 20
Figura 7 – Formação β-amirina através da biossíntese do esqualeno. ... 21
Figura 8 – Estrutura da molécula de DPPH ... 22
Figura 9 – Redução do DPPH pelo flavonóide antioxidante a Quercetina por via radicalar. ... 23
Figura 10 – Redução do DPPH pelos antioxidantes do extrato EHPAET nas concentrações de 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3,0 μg/mL, respectivamente. ... 35
Figura 11 – Espectro de RMN 1H da ET-1, CDCl3, 300 MHz. ... 41
Figura 12 – Espectro de RMN 13C da ET-1, CDCl 3, 125 MHz. ... 41
Figura 13Estrutura do β-amirina (C30H50O). ... 42
Figura 14 – Cromatograma (CG-EM) da fração EHPAET-C-insap. ... 43
Figura 15 – Cromatograma (CG-EM) da fração EHPAET-EM C... 46
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Dados referentes as diluições das soluções filhas. ... 31 Tabela 2 – Quantidades de reagentes utilizados na saponificação. ... 32 Tabela 3 – Proporções de solventes e volumes para a obtenção das frações de 1-14 a partir da fração EHPAET-C-insap. ... 34
Tabela 4 – Quantidades de material botânico seco utilizado e rendimento obtido. ... 35 Tabela 5 – Dados das concentrações, absorbâncias e atividades antioxidantes. ... 36 Tabela 6 – Massa obtida dos insaponificáveis a partir da reação de saponificação da fração EHPAET. ... 37
Tabela 7 – Rendimento dos ésteres metílicos da reação de esterificação fração EHPAET. ... 38
Tabela 8 – Frações, massa e análise das CCD das frações de 1-14. ... 38 Tabela 9 – Dados de RMN de 1 H e 13C (CDCL3, 300 MHz) do β-amirina e
comparação com os dados da literatura (CDCL3, 500 MHz). ... 40
Tabela 10 – Tempo de retenção e suas respectivas estruturas dos constituintes identificados na fração EHPAET-insap. ... 43
Tabela 11 – Espectros de massa referente ao cromatograma da fração EHPAET-C-insap e suas respectivas moléculas para os seguintes tempos de retenção: 9,72; 22,67; e 33,40 respectivamente. ... 44
Tabela 12 – Tempo de retenção e suas respectivas estruturas e o redimento da fração EHPAET-EM-C. ... 46
Tabela 13 – Espectros de massa referente ao cromatograma da fração EHPAET-EM-C e suas respectivas moléculas para os seguintes tempos de retenção: 8,22; 19,99; e 23,46 respectivamente. ... 47
Tabela 14 – Tempo de retenção e suas respectivas estruturas e o redimento da fração EHPAET-EM-A. ... 49
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CC – Cromatografia em Coluna
CCD – Cromatografia em Camada Delgada %AA – Porcentagem de atividade antioxidante
CENAUREMN – Centro Nordestino da Aplicação e Uso da ressonância magnética Nuclear
DEPT – Distortionlss liquid Cromatography DMSO – Dimetil sulfóxido
EHPAET – Extrato Hexano da Parte Aérea de Euphorbia tirucalli FPP – farnesil pirofosfato
HMBC – Heteronuclear Multiple Band Correlation HSQC – Heteronuclear Single Quantum Correlation Hz – Hertz
LISCO – Laboratório de Isolamento e Síntese de Compostos Orgânicos ppm – Partes por milhão
RMN 1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN 13C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13
CHCl3 – Clorofórmio
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 12 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 13 2.1 CONSIDERAÇÕESBOTÂNICAS ... 13 2.1.1 Família Euphorbiaceae ... 13 2.1.2 Gênero Euphorbia ... 13
2.1.3 Espécie Euphorbia tirucalli ... 15
2.2 METABÓLITOSSECUNDÁRIOS ... 17
2.2.1 Terpenos/Terpenóides ... 18
2.2.1.1 Triterpenos ... 20
2.3 ENSAIOSBIOLÓGICOS ... 21
2.3.1 Atividade Antioxidante ... 21
2.3.1.1 Atividade Antioxidante com DPPH ... 22
3 JUSTIFICATIVA E RELEVÂNIA ... 25 4 OBJETIVOS ... 27 4.1 OBJETIVOGERAL ... 27 4.2 OBJETIVOSESPECÍFICOS ... 27 5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ... 28 5.1 MÉTODOSCROMATOGRÁFICOS ... 28
5.1.1 Cromatografia de Absorção em Coluna (CC) ... 28
5.1.2 Cromatografia em Camada delgada (CCD) ... 28
5.2 MÉTODOSESPECTROSCÓPICOS ... 29
5.2.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) ... 29
5.2.2 Cromatografia Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massa (CG/EM) .... 30
5.3 ESTUDOFITOQUÍMICODE EUPHORBIATIRUCALLI ... 30
5.3.1 Material Vegetal ... 30
5.3.2 Obtenção dos Extratos ... 30
5.3.3 Atividade antioxidante ... 31 5.3.4 Obtenção dos constituintes saponificáveis e insaponificáveis da fração
5.3.4.2 Esterificação ... 33
5.3.5 Fracionamento Cromatográfico de EHPAET-C-insap ... 33
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 35
6.1 RENDIMENTODOEXTRATOEHPAET ... 35
6.2 AVALIAÇÃODAATIVIDADEANTIOXIDANTEPELACAPTURADO RADICALLIVREDPPH ... 35
6.3 ESTUDODASFRAÇÕESSAPONIFICÁVEISEINSAPONIFICÁVEIS ... 37
6.3.1 Rendimento ... 37
6.3.2 Fracionamento da fração EHPAET-C-insap ... 38
6.3.3 Caracterização química de ET-1 ... 38
6.3.4 Análise dos constituintes das frações EHPAET-C-insap, EHPAET-ME-C e EHPAET-EM-A por CG/EM ... 42
6.3.4.1 Constituintes da fração EHPAET-C-insap ... 42
6.3.4.2 Constituintes da fração EHPAET-EM-C ... 45
6.3.4.3 Constituintes da fração EHPAET-A ... 48
7 PERSPECTIVAS FUTURAS ... 52
8 CONCLUSÃO ... 53
1 INTRODUÇÃO
As plantas têm significante papel para a vida da humanidade, tanto como fonte de alimento, bem como de recursos terapêuticos. Desta forma, elas representam a principal matéria prima dos medicamentos utilizados na medicina popular (SIMÕES et al., 2004). As plantas com fins terapêuticos têm sido utilizadas, especialmente, pela população de baixa renda, devido a facilidade de obtenção e o baixo custo, as quais são empregadas no tratamento de várias doenças (LIMA et al., 2013).
O uso de plantas na medicina é justificado por estas apresentarem ampla diversidade de metabólitos secundários com atividades biológicas diferenciadas, o que leva a cada ano, a busca por conhecimentos das principais propriedades farmacológicas das espécies vegetais e suas possíveis aplicações para o desenvolvimento de novos medicamentos (OLIVEIRA et al., 2008).
As plantas pertencentes à família Euphorbiaceae são amplamente utilizadas na cultura tradicional popular para fins terapêuticos e algumas espécies identificadas, contêm compostos bioativos que conferem a essas plantas o potencial para o tratamento de varias doenças (PUSZTAI et al., 2007; LAGE et al., 2009). Estudos mostram que plantas do gênero Euphorbia (Euphorbiaceae) apresentam a capacidade de alterar alguns parâmetros celulares e moleculares do sistema imunológico (AMIRGHOFRAN
et al., 2006). Dentre as espécies do gênero, podemos citar aqui a espécie Euphorbia tirucalli, conhecida popularmente como “avelós” é um arbusto originário da África, mas
que foi adaptado no Brasil por volta de 1982 com fins ornamentais e é classificada como uma planta suculenta e produtora de um látex branco (MACHADO, 2007).
Na literatura, são descritos diversos usos populares de Euphorbia Tirucalli. Ela é comumente usada na medicina popular para tratar doenças como sífilis, asma, cólica, parasitas intestinais, doenças de pele, hanseníase, tumores e infecções virais (BENJAMIN, M. et al., 2015; EMILY, P. W. et al., 2015).
Assim, tendo em vista a utilização popular desta espécie no tratamento de algumas doenças, e uma vez que as plantas deste gênero apresentam em sua composição química uma grande diversidade de metabólitos secundários, o presente trabalho realizou o estudo fitoquímico da fração hexano da parte aérea de espécie Euphorbia
tirucalli, a fim de isolar possíveis metabólitos e assim contribuir para o conhecimento
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 2.1 CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS 2.1.1 Família Euphorbiaceae
A família Euphobiaceae, está incluída na ordem Malpighiales, pertencente à classe Magnoliopsida, e constitui uma das famílias mais complexas sobre o ponto de vista taxonômico, com larga variedade morfológica. Além de apresentar hábito bastante diversificado, representado por ervas, arbustos, lianas, latescentes e espinascentes (RODRIGUES, 2007). As espécies pertencentes a esta família possuem um porte herbáceo, por vezes, arbustivo, altura bastante variada dependendo da espécie, podendo atingir alturas superiores a 9 metros ou inferiores a 10 centímetros. Os elementos da família Euphorbiaceae apresentam folhas verdes simples e alternada ou raramente compostas, podendo as vezes apresentar espinhos. As suas flores são bastante distintas, simétricas, apresentando cores claras como amarela ou branca. Os frutos podem surgir como cápsulas, drupas, bagas ou sâmaras, dependendo das espécies observadas. E suas sementes são normalmente lisas e escuras (CRONQUIST, 1988).
Esta família compreende cerca de 7500 espécies distribuída por 300 gêneros. Já no Brasil encontra-se 72 gêneros e cerca de 1.100 espécies, de habitat diferentes, espalhadas em todos os tipos de vegetação (RODRIGUES, 2007; CRONQUIST, 1981).
2.1.2 Gênero Euphorbia
O gênero Euphorbia é o maior gênero da família Euphorbiaceae, com mais de 2000 espécies com grande variedade morfológica. Inclui plantas bastante conhecidas pelo látex leitoso e abundante, com flores nuas dispostas em um pseudanto denominado ciátio, e algumas espécies do gênero são encontradas como ervas daninhas ou como elementos decorativos. (ERNST, et al., 2015). Este genêro está destribuido nos continentes africanos, asiáticos e na América do sul, sendo, entretanto, pouco comum em lugares de clima frio, devido sua predileção por regiões áridas (RAVIKANTH et al., 2003).
Por possuir vários compostos bioativos em sua constituição, tais como alcalóides, flavonóides, taninos e terpenos,
Figura 1, as plantas do gênero Euphorbia são tradicionalmente utilizadas pela
podemos aqui citar a espécie E. hirta utilizada em doenças respiratórias (SINGH et al., 2006), e a E. tirucalli comumente utilizada no tratamento de doenças virais (BENTACUR-GALVIS et al., 2002). Assim, muitos estudos têm sido conduzidos no sentido de comprovar as atividades de plantas do gênero Euphorbia e desta forma validar seu uso.
HO OH Nyasol (E. ficheriana) Derivado fenólico HO Beta-sitosterol (E. ficheriana) Triterpeno HO Taraxerol (E. hirta) Triterpeno O HO O Umbeliferona (E. hirta) Cumarina O O OCH3 H3C HO CH3 7-Hydroxi-5-metoxi-6,8-dimetilflavanona (E. kansui) Flavonóide HO Eufol (E. kansui) Triterpeno HO Beta-amirina (E. kansui) triterpeno O HO H3CO O O O O Dafnoretina (E. hirta) cumarina CH3 O HO HO HO Gálico metil (E. stracheyi) Derivado fenólico O HO HO HO Macrorilone A (E. macrorrhiza) diterpeno Fonte: Própria, 2017.
2.1.3 Espécie Euphorbia tirucalli
Euphorbia tirucalli é popularmente conhecida como Aveloz, árvore-lápis, mata-verruga, árvore de São Sebastião, cega-olho, dedo do diabo, figueira do diabo, labirinto, cassoneira, cabelo-do-diabo, cachorro-pelado, coroa-de-cristo, entre outros (CRUZ, 1964; DANTAS, 2007). É uma espécie de origem Africana e de ampla ocorrência nos
países tropicais. É uma planta bastante usada na medicina popular para o tratamento da sífilis, asma, reumatismo, câncer e tumores de pele. Contudo, a exposição à Euphorbia tirucalli tem sido sugerida como um importante fator de risco, o que chama a atenção para os efeitos tóxicos desta espécie (RAFAEL, et al., 2016).
A espécie apresenta uma grande diversidade de constituintes bioativos, como, terpenos e esterois, incluindo o álcool eufol, α-euforbol, taraxasterol, tirucallol entre outros. Já os principais constituintes do látex obtido da E. tirucalli são: água, tigliane e ingenane. Figura 2 apresentar alguns dos constituintes desta espécie.
O O H3CO H3CO O O OCH3 O O OH OH OH O O OH OH OH H3C
ácido 3,3',4-tri-O-metil-4'-O-rutinosil elágico Dericado de ácido elágico
OH HO HO OH OH OH Forbol Diterpeno O HO OH HO HO Ingenol Diterpeno HO Beta-amirina Triterpeno OH O Ácido linoleico Ácido OH Euforginol Triterpeno O OAc OH AcO H3CO OAc Tirucalicino Diterpeno HO Lupeol Terpeno HO Ciclotirucanenol Esteróide HO Taraxerol Triterpeno HO Beta-sitosterol Triterpeno O OH HO HO OH Ácido gálico Triterpeno Fonte: própria, 2017.
Quanto às características morfológicas, esta espécie consiste em um arbusto semilenhoso com aspecto de cacto, de cor verde; caule ereto e ramificado; ramos cilíndricos verticilados; folhas pequenas, esparsas e rudimentares aparecendo apenas nas extremidades dos ramos jovens; flores pequenas e seiva leitosa e muito tóxica, Error! Reference source not found..
Figura 3 – Espécie Euphorbia tirucalli.
Fonte: Própria, 2017.
2.2 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
Há muito tempo, as plantas têm se apresentado como recurso terapêutico, característica a qual está relacionada ao fato de que as plantas produzem uma larga e diversa ordem de componentes orgânicos, os metabólitos primários e secundários, produzidos como mecanismo de defesa contra condições de estresse biótico e abiótico (ARCEO-MEDINA et al., 2016).
Os metabólitos primários fazem parte da atividade celular de praticamente todos os seres vivos, desde os organismos unicelulares até o homem. Eles possuem função estrutural, plásticas e de armazenamento de energia. Trata-se de carboidratos, lipídeos, proteínas, ácidos nucleicos ou clorofilas. Já os metabólitos secundários não estão envolvidos com as funções vitais das plantas, não fazem parte do metabolismo básico e possuem características químicas muito variadas e às vezes complexas. São metabólitos específicos a uma espécie vegetal ou a um grupo de espécies relacionadas. Estes são produzidos em um órgão ou tecidos específicos e armazenados em outra parte da planta, havendo variações em suas concentrações. Estudos realizados desde o final dos anos noventa mostraram que os metabólitos secundários de diferentes plantas podem apresentar diferentes mecanismos de ação. (SARDÁ et al., 2007, 2008; ALVES, 2009; SILVA et al., 2011). As principais classes desses metabólitos são: flavonóides, alcalóides, cumarinas, agliconas, antraquinônicas, terpenóides, saponinas, polifenóis e taninos.
2.2.1 Terpenos/Terpenóides
Os terpenos constituem uma das maiores classe de metabólitos secudários. Do ponto de vista químico, os terpenos apresentam uma dupla ligação carbono-carbono que o caracteriza como hiodrocabonetos insaturados, no entanto, os terpenos podem apresentar diferentes funções orgânicas em sua estrutura, como: ácidos, álcoois, aldeídos, cetonas, éteres, fenóis ou epóxidos terpênicos. Entretanto, apesar se suas diferenças estruturais, todos os terpenos/terpenóides são formados basicamente por unidades de cinco carbonos, o isopreno (C5H8), ligadas entre si pela ordem
“cabeça-cauda”, ou pela ordem “cauda-cauda” que caracteriza os chamados terpenos irregulares. Ainda, podem ser formados pela ligação “cruzada”, resultante de sua origem bioquímia, que leva à derivação de terpenos cíclicos (LOOMIS e CROTEAU, 2014; KITAOKA et al., 2015).
Dependendo de sua origem bioquímica proveniente (3-isopentenil-pirofosfato ou dimetilalil pirofosfato), os tepenos podem se apresentar de diferentes formas. Assim, os terpenos podem ser classificados de acordo com a quantidade de resíduos de isopreno de sua estrutura, como: hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), triterpenos (C30), tetraterpenos (C40) e politerpenos (>C40). Figura 4.
Figura 4 – Exemplos de alguns terpenos e sua classificação quanto à quantidade de carbonos
Fonte: Própria, 2017.
Além desta classificação, os terpenos podem ainda ser subclassificados em termos do grau de ciclização da molécula, ou seja, como acíclicos (moléculas abertas), monocíclicos ou bicíclicos. (KRIVORUCHKO e NIELSEN, 2014; HANSON, 2013, DEWICK, 2002). As Error! Reference source not found. e Figura 6 apresentam, resumidamente, a biossíntese dos precusores para formação de vários terpenos.
Figura 5 – Proposta da biossínteses para formação de diferentes terpenos. S-CoA O Acetil-CoA H HO S-CoA O S-CoA O Carbânion Enolato S_CoA O H2O S_CoA OH Enol S_CoA O S_CoA O O Aceto-acetil-CoA Esquema 1:Formação do ânion enolato.
Esquema 2: Reação de condensação para a formação aceto-acetil-CoA.
Esquema 3: Reação para formação 3-isopentenil-pirofosfato (IPP).
S_CoA O O S_CoA O CoA_S S_CoA O O O NADPH NADP+ O S_CoA O OHO (S)-3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA O S_CoA O OHO
Esquema 4: Reação de isomerização.
2NADPH 2NADP+ O OH OH (R)-Mevalonato (MVA) 2ATP 2ADP O OPP OH O OPP OH ATP ADP O OPP OP O O O O O CO2 PI OPP 3-isopentenil-pirofosfato (IPP) OPP 3-isopentenil-pirofosfato (IPP) OPP Dimetillalil-pirofosfato (DMAPP) ISOMERIZAÇÃO Fonte: Própria, 2017.
Figura 6 – Continuação da proposta da Biossínteses para formação de diferentes terpenos.
OPP OPP
Esquema 5: Reação de adiçao eletrofílica para a formação do Geranil-pirofosfato (GPP).
(DMAPP)
+ OPP
Geranil-pirofosfato (GPP)
Esquema 6: Reação de adiçao eletrofílica para a formação do Farnesil pirofosfato (FPP).
OPP + OPP
(IPP)
(GPP) Farnesil pirofosfato OPP
(FPP) (IPP)
Fonte: Própria, 2017.
Quanto às suas funções biológicas, muitos terpenos apresentam atividades biológicas comprovadas cientificamente. Dentre elas temos atividade preventiva contra câncer, anti-inflamatória, bactericida, fungicida, antimicrobiana entre outras (DE MARTINO et al., 2015; LUTFI e ROQUE, 2014).
2.2.1.1 Triterpenos
Os triterpenos são uma classe de isoprenóides derivados de um precursor de 30 carbonos, o esqualeno. O esqualeno, por sua vez, é derivado a partir de duas moléculas de farnesil pirofosfato (FPP). Por fim, a reação com uma enzima conhecida como esqualeno epoxidase converte o esqualeno em oxidosqualeno. Por causa da presença de um epóxido no oxidosqualeno, todos os triterpenos cíclicos derivados desse percussor possuem oxigênio na posição C-3 (carbono carbinólico).
Quase 100 diferentes tipos de esqueletos estruturais de triterpenos cíclicos são conhecidos na natureza, os quais podem ser classificados de acordo com o mecanismo de ciclização (XU, et al., 2004). Contudo, a maioria dos triterpenos vegetais são formados através do oxidosqualeno. Como exemplo dos triterpenos, pose-se citar aqui o β-amirina, de fórmula química C30H50O e que constitui um composto químico natural
Figura 7 – Formação β-amirina através da biossíntese do esqualeno.
Fonte: Própia, 2017.
2.3 ENSAIOS BIOLÓGICOS 2.3.1 Atividade Antioxidante
Atualmente, há um grande acervo de métodos científicos para mensurar a capacidade antioxidante de muitas substâncias. Essas medidas podem ser realizadas pela aplicação dos métodos diretos: ensaio de redução do β-caroteno, quimioluminescência do luminol e ensaio ORAC ou pela aplicação dos indiretos: ensaio com reagente folin-Ciocalteu, redução do radical DPPH e ensaio TEAC (VICENTINO e MENEZES, 2007; RODRÍGUEZ et al.,2008; FONSECA et al., 2009; Mosquera et al., 2009).
O interesse sobre o desenvolvimento de substâncias antioxidantes, principalmente a partir de produtos naturais como plantas, tem ocupado um lugar de destaque dentro da indústria farmacêutica. A realização de pesquisa sistematizada desses compostos e de suas capacidades de neutralizar agentes nocivos a sistemas biológicos. Os radicais livres e outros oxidantes vem sendo consideradas como causadores de várias doenças como câncer, doenças cardiovasculares entre outras, tornando-se assim, relevante a busca por antioxidantes com a capacidade de proteger os organismos dos danos causados pelos radicais livres (SOUSA et al., 2007).
Evidencias indicam que diversos componentes antioxidantes contribuem na proteção oferecida por frutas e vegetais ao dano oxidativo. Contudo, a capacidade antioxidante total de extratos vegetais nem sempre traduz precisamente o que ocorre in
vivo nas células vegetais, já que nestas há uma atividade dinâmica de um sistema
antioxidante formado por enzimas (superóxido dismutase, catalase, ascorbato redutase, etc) e compostos de baixo peso molecular, tais como flavonóides, taninos, acido ascórbico, entre outros (NEILL et al; KUBOLA et al, 2011).
Mesmo assim, estudos apontam a importância de avaliar as atividades antioxidantes de derivados vegetais (NEGRI et al., 2009). Dentre os métodos para estas
dos antioxidantes em neutralizar radicais como DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazila) ou ABTS (sal de amônio do acido 2,2’-azinobis-3-etilbenzenotiazolina-6-sulfonico).
Os radicais livres são instáveis e bastante reativos por apresentarem um elétron desemparelhado em sua estrutura. No entanto, no caso do DPPH, o efeito ressonante, causado pelos anéis benzênicos presentes na estrutura, possibilita a estabilização da carga eletrônica, dispersando-a por toda molécula. Ademais, os grupos nitro (NO2),
conhecidos por serem retiradores de elétrons, auxiliam na estabilização do elétron desemparelhado .
Figura 8, sendo assim, esta espécie radicalar (DPPH) se torna relativamente
estável e menos reativa.
Figura 8 – Estrutura da molécula de DPPH
NO2 NO2 O2N N N Fonte: Própria, 2017. 2.3.1.1 Atividade Antioxidante com DPPH
O teste de DPPH consiste em uma das técnicas atualmente mais utilizada para detectar a capacidade antioxidande de compostos, a qual consiste em um dos métodos indiretos mais antigos para se determinar a referida atividade, sendo sugerido originalmente em 1950 para se descobrir os doadores de hidrogênio em matérias naturais. Mais tarde, este método foi empregado para determinar o potencial antioxidante de compostos fenólicos isolados, bem como, amostras biologicamente relevantes (ROGINSKY e LISSI, 2005).
Uma importante característica deste método está relacionada ao fato deste não envolver condições drásticas de temperatura e oxigenação, uma vez que a molécula de DPPH é bastante conhecida por caracterizar-se como radical orgânico livre estável, além de ser considerado um método de ampla aplicabilidade, simplicidade e viabilidade (DENG; CHENG; YANG, 2011).
O método com DPPH pode ser empregado para se determinar a atividade antioxidante tanto em extratos como em substâncias isoladas, como por exemplo, os
compostos fenolicos, flavonóis e cumarinas. A Figura 9 apresenta a reação do radical livre DPPH com a Quercetina, um flavonóide que pode ser usado como antioxidante por estabilizar bem o radical por ressonância. A metodologia empregada neste teste consiste na geração de radical e na capacidade da amostra em eliminar ou neutralizar o radical, a qual é monitorada através de um espectrofotômetro na região do ultravioleta (UV/visível) (LEJA et al, 2007; VOGEL et al, 2005; ARNAO, 2000).
Figura 9 – Redução do DPPH pelo flavonóide antioxidante a Quercetina por via radicalar.
O2N O2N NO2 N N + O O OH OH HO O OH H O2N O2N NO2 NH N O O OH OH HO O OH +
1 DPPH Quercetina 2 DPPH Quercetina oxidada
O O O O HO O O H H Quercetina oxidada estabilizada por ressonância Fonte: Própria, 2017.
Inicialmente, os radicais livres de DPPH apresentam coloração púrpura, devido os mesmos possuírem elétrons livres, e absorvem em um comprimento de onda máximo de aproximadamente entre 515-517 nm. Então, ao sofrerem ação de um antioxidante (AH) ou de uma espécie radicalar (R), o DPPH é reduzido a difenil-picril-hidrazina, de coloração amarela, por está em ressonância com um radical hidrogênio doado por uma molécula antioxidade, diminui a absorbância. A partir dos resultados obtidos determina-se a porcentagem de atividade antioxidante (%AA) ou determina-sequestradora de radicais livres e/ou porcentagem de DPPH remanescente no meio reacional (BORGES. L. L, 2011). Por ser um radical estável, o DPPH apresenta baixa taxa de deterioração e reatividade com a maioria dos compostos, reagindo apenas com agentes redutores fortes (SANTOS et al, 2007).
A porcentagem de atividade antioxidante (%AA) corresponde a quantidade de DPPH consumida pelo antioxidante, sendo que a quantidade de antioxidante necessária para decrescer a concentração inicial de DPPH em 50% é denominada concentração eficiente (CE50), também chamada de concentração inibitória (CI50). Desta forma,
quanto maior o consumo de DPPH por uma amostra, menor sua CE50 e
3 JUSTIFICATIVA E RELEVÂNIA
A utilização de plantas como medicamento é tão antiga quanto a própria existência do homem, porém, a necessidade de investigação sobre o uso plantas medicinais de espécies desconhecidas ainda é muito relevante. A espécie Euphorbia
tirucalli é uma planta originária da África e adaptou facilmente em países tropicais,
incluindo o Brasil, onde é encontrado no estado do Amazonas, em Minas Gerais, na região Nordeste e também na costa do Estado de São Paulo (CORREIA, 1984). É uma planta amplamente conhecida por possuir propriedades anti-helmínticas, cicatrizante, anti-inflamatória entre outras. A mesma também tem seu uso popular bastante difundido para fins terapêuticos contra infecções virais e doenças tumorais, além do uso no tratamento de verrugas. Algumas dessas propriedades têm sido estudadas por diversos pesquisadores, no entanto, pouco se sabe a respeito das ações desempenhadas pelos princípios ativos das plantas, se eles agem de maneira direta sobre os mecanismos envolvidos nos processos patológicos, anteriormente citados, ou se tais princípios ativos poderiam alterar a resposta imune do hospedeiro frente ao estímulo, seja ele de natureza infecciosa ou tumoral (AVILAR, 2010).
As plantas do gênero Euphorbia são conhecidas por possuírem altos níveis de compostos bioativos, e é provável que algumas espécies possam realmente apresentar atividades biológicas capazes de promover uma melhora clínica em algumas situações patológicas (LAGE et al., 2010; PUSZTAI et al., 2007). Assim, considerando a importância da produção de citocinas no desenvolvimento de uma resposta imune eficaz contra os processos patológicos associados à infecção, a tumores e a processos inflamatórios, é possível que muitas das funções terapêuticas atribuídas às Euphorbiáceaes possam ser consequência da ação dos princípios ativos das plantas sobre o sistema imune.
Além do mais, várias patologias incluindo o câncer, doenças cardiovasculares, doença de Alzheimer e de Parkinson, seguidas de doenças inflamatórias e imunológicas como artrite, asma, alergia entre outras apresentam em sua etiologia os efeitos danosos da produção de radicais livres em conseqüência do estresse oxidativo, o que torna relevante a avaliação da atividade antioxidante em produtos naturais frente a influência benéfica desses produtos na saúde humana, associados ao decréscimo da atividade oxidante (BARREIROS, et al., 2006).
Portanto, em face ao aqui exposto, o presente trabalho abordará o estudo fitoquímico e a avaliação da atividade antioxidante do extrato hexano da parte aeréa de
Euphorbia tirucalli com o intuito de constatar a presença de compostos antioxidante
presente no extrato, bem como isolar compostos que possam ser biologicamente ativos (AMIRGHOFRAN et al., 2006; KUO et al., 2006).
4 OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GERAL
Contribuir para o conhecimento químico e farmacológico da espécie Euphorbia
tirucalli.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Preparar extratos orgânicos da parte aérea de Euphorbia tirucalli por maceração;
Testar a atividade antioxidande do extrato obtido;
Isolar compostos através de técnicas cromatográficas em coluna (adsorção e/ou exclusão molecular);
Analisar os compostos presentes nas frações por CCD;
Elucidar os compostos isolados por meio de técnicas espectroscópicas de RMN
5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 5.1 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
O método físico-químico de separação empregado (cromatografia) consiste na migração diferencial dos componentes da mistura por diferença de interação entre a fase móvel (gás, líquido ou um fluido) e a fase estacionária fixa (material a ser colocado na coluna ou numa superfície sólida). A técnica foi empregada para purificação dos compostos da mistura (extrato).
5.1.1 Cromatografia de Absorção em Coluna (CC)
As cromatografias de absorção em coluna foram realizadas utilizando-se gel de sílica 60 para cromatografia “flash” (Φ μm 40-63) da marca Merck. O comprimento da coluna foi de 22 cm e seu diâmetro de 3.0 cm. A coluna utilizada na cromatografia de adsorção sob pressão média (cromatografia flash) foi de vidro resistente à pressão e continha um bulbo no ápice, para armazenamento do solvente. Foi empregada, nesta técnica, bomba de ar comprimido modelo Inalar Compact.
Os eluentes utilizados foram: hexano, diclometano, clorofórmio, acetato de etila, e metanol, puros ou misturas binárias, em ordem crescente de polaridade.
5.1.2 Cromatografia em Camada delgada (CCD)
Nas cromatografias de camada delgada (CCD) foi utilizado cromatofolhas de alumínio Al TLC de gel de sílica F254, da Silicycle.
As análises foram feitas através da exposição das cromatoplacas à radiação de luz ultravioleta (UV) em dois comprimentos de onda (254 e 365 nm), emitidos por lâmpada modelo VL-4. LC da Vilber Lourmat e /ou por imersão em solução de vanilina (C8H8O3) 3 g/100 ml de etanol e ácido Sulfúrico (H2SO4) 10% em água, seguido de
aquecimento à aproximadamente 150°C por alguns minutos.
Os eluentes utilizados foram: hexano, diclorometano, clorofórmio, acetato de etila e metanol, puros ou em misturas binárias.
5.2 MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS
5.2.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H) e
Carbono-13 (RMN 13C) uni e bidimensionais, foram obtidos em espectrômetro Bruker, modelo avance DPX-300 e/ou modelo avance DRX-500, no Centro Nordestino de Aplicação de Uso da Ressonância Magnética Nuclear da Universidade federal do Ceará (CENAUREMN). O espectrômetro Bruker Avance DRX-300 foi operado nas frequências de 300,13 e 75,47 MHz RMN de 1H e 13C, respectivamente, sob campo magnético de 7,0 T. Enquanto nos experimentos realizados no aparelho Bruker Avance DRX-500, foram aplicadas frequências de 500,13 MHz para RMN de 1H e 125,75 MHz para RMN de 13C, sob um campo magnético de 11,7 T.
Os solventes utilizados na dissolução das amostras foram solventes deuterados: clorofórmio (CDCl3), metanol (CD3OD) ou piridina (C5D5N), comercializados pelas
companhias ACROS, Cambridge Isotope Laboratories, Merck ou Aldrich.
Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm) e foram referenciados para RMN 1H pelos picos referentes à fração não deuterada dos solventes: benzeno (δ 7,16), clorofórmio (δ 7,27), dimetil sulfóxido (δ 2,71), metanol (δ 3,31) e piridina (δ 7,19; 7,55 e 8, 71). Para RMN 13C pelos picos centrais dos carbonos-13 dos solventes: benzeno (δ 128,39), clorofórmio (δ 77,23), dimetil sulfóxido (δ 39,50), metanol (δ 49,17) e piridina (δ 123,5; 135,5 e 149,9).
As multiplicidades das absorções foram indicadas segundo a convenção: sinpleto (s), dupleto (d), duplodupleto (dd), tripleto (t), quarteto (q) e multipleto (m).
Nos experimentos unidimensionais de 1H e de 13C foram estabelecidos os seguintes valores para os parâmetros de aquisição, respectivamente: larguras espectrais de 24 e 260 ppm, intervalo para relaxação de 1s e largura de pulso de 90o de 9,60 μs (0 dB) e 10,90 μs (-3 dB) para 1H e 13C, respectivamente. Para todos os experimentos unidimensionais foram utilizados 65356 pontos para a aquisição e 32768 para o processamento, enquanto para os experimentos bidimensionais foram utilizados 2048 x 256 pontos para a matriz de dados de aquisição e 2048 x 1024 pontos para o processamento. Predição linear para o processamento 2D, utilizando 80 coeficientes, foi usada quando necessária. O número de transientes variou de 8, para 1H, a 16384, para 13C, para os experimentos unidimensionais, e 2n (n≥2) para bidimensionais,
Os micros programas utilizados para a aquisição dos dados foram: 1H (zg), 13
C-CPD (zgpg), 13C-DEPT 135° (dept135), gs-COSY (cosygp), gs-NOESY (noesygpph),
gs-HSQC (hsqcgpph), gs-HMBC (hmbclpndqf) e gs-TOCSY (tocsygp). A técnica DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer), com ângulos de mutação de 135°, CH e CH3 com amplitudes em oposição aos CH2, e 90°, somente CH, foi
utilizada na determinação do padrão de hidrogenação dos carbonos em RMN 13C, descrito segundo a convenção: C (carbono não hidrogenado), CH (carbono metínico), CH2 (carbono metilênico) e CH3 (carbono metílico). Os carbonos não hidrogenados
foram caracterizados pela subtração do espectro DEPT 135 do espectro BB.
5.2.2 Cromatografia Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massa (CG/EM)
As análises de CG/EM foram realizadas em cromatógrafo a gás da marca Shimadzu modelo GC-2010 acoplado a um espectrômetro de massa Shimadzu e modelo GC-MS-QP2010 Plus, com injetor Split a temperatura de 220 °C, gás de arraste hélio a fluxo contínuo de 1 mL/min e a coluna utilizada foi RTx-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 micrômetros) operando a 60-240 °C a 3 °C/min. A fonte de íons foi mantida a 240 °C e a interface a 240 °C. A identificação dos compostos foi realizada através de comparação dos espectros de massa obtidos com aqueles existentes no banco de dados do aparelho, NIST08s.LIB.
5.3 ESTUDO FITOQUÍMICO DE EUPHORBIA TIRUCALLI 5.3.1 Material Vegetal
A espécie de Euphorbia tirucalli L. utilizada para estudo fitoquímico foi coletada em maio de 2006 na localidade de Horto de Plantas Medicinais – CE por Dárdano de Andrade Lima do departamento de Química Orgânica da Universidade Federal do Ceará e identificada por Matos. A exsicata da espécie encontra-se depositada no Herbário Prisco Bezerra daquele Departamento, sob número de registro EAC 0038702.
5.3.2 Obtenção dos Extratos
O material vegetal da parte aérea fresca de Euphorbia tirucalli coletada, após completamente seco, foi triturado utilizando um moinho de facas para posterior processo de extração. Então, todo o material vegetal (974,686 g) foi submetido a
extração a frio com hexano (foram realizadas três extrações após o repouso de 48 horas entre cada extração). As soluções resultantes da extração foram filtradas e evaporadas em evaporador rotativo sob pressão reduzida, obtendo 117,77 g do extrato hexano denominado EHPAET (Extrato Hexano da Parte aérea da Euphorbia tirucalli).
5.3.3 Atividade antioxidante
A atividade antioxidante do extrato EHPAET foi averiguada por testes com DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) de acordo com o procedimento de Souza (2007) com algumas modificações. Os testes foram realizados no Laboratório de Isolamento e Síntese de Compostos Orgânicos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (LISCO).
Inicialmente, foi preparada uma solução de DPPH com concentração de 0,04 mg/ml em metanol, também foi preparada uma solução do extrato EHPAET com concentração de 500 μg/mL pela dissolução em etanol (solução estoque). Em seguida, foram preparadas diluições a partir da solução mãe, com concentrações de 0,5; 1,0; 1,5;
2,0; 2,5; e 3,0 μg/mL e volumes totais de 2,0 mL para cada (soluções filhas) conforme
observado na Tabela 1.
Tabela 1 – Dados referentes as diluições das soluções filhas.
Solução Filha do EHPAET Nº Concentração (mg/mL) Volume da Solução Filha (mL) Volume do Solvente (mL) 1 0,500 0,3 1,7 2 1,000 0,7 1,3 3 1,500 1,0 1,0 4 2,000 1,3 0,7 5 2,500 1,7 0,3 6 3,000 2,0 0,0
Em seguida tomou-se alíquotas de 0,3 mL de cada uma das soluções diluídas, bem com da solução mãe, em triplicata, e a cada uma destas foi adicionado 2,7 mL de DPPH, totalizando um volume de 3,0 mL. O branco foi preparado pela adição de 2,7 mL de metanol à 0,3 mL de cada amostra. Preparadas as soluções esperou-se 30
minutos em repouso para então iniciar as medidas de absorbância, utilizando comprimento de onda de λ=517 nm.
A capacidade de eliminar o radical DPPH (% de atividade antioxidante, AA%) foi calculada utilizando-se a Equação 1.
Equação 1 – Equação para obtenção dos resultados AA%.
AA% = 100 – {[Abs amostra – Abs branco) x 100] /Abs controle}
Onde:
Absamostra = 0,3 mL da Amostra + 2,7 mL de DPPH
Absbranco = 0,3 mL da amostra + 2,7 mL de MeOH
Abscontrole = DPPH puro (0,04 mg/mL)
5.3.4 Obtenção dos constituintes saponificáveis e insaponificáveis da fração EHPAET
5.3.4.1 Saponificação
A fração EHPAET (5,0 g) foi submetida a reação de saponificação. Assim, inicialmente, a amostra foi solubilizada na menor quantidade possível de CHCl3, e em
seguida esta foi transferida para um balão de 250 mL juntamente com 37,5 mL de uma solução alcoólica de NaOH (7,5 g/37,5 mL de etanol), conforme informações contidas na Tabela 2.
Tabela 2 – Quantidades de reagentes utilizados na saponificação.
Extrato Qtde / (g) NaOH (g) MeOH (mL)
EHPAET 5,0 7,5 37,5
Fonte: Própria.
O sistema reacional foi montado e a reação foi mantida sob agitação e refluxo a 60 °C por duas horas. Posteriormente, adicionou-se ao sistema reacional 60 mL de água destilada, e em seguida o sistema foi transferido para um funil de separação. Então, os insaponificáveis foram extraídos com CHCl3 (3 x 30 mL).
Assim, a fração contendo os insaponificáveis, foi seca com sulfato de sódio anidro (NaSO4), filtrada, concentrada por destilação do solvente sob pressão reduzida
5.3.4.2 Esterificação
Após a remoção dos insaponificáveis, a fase hidroalcoólica alcalina, contendo os ácidos graxos, foi submetida a reação de esterificação para análise dos ésteres metílicos correspondente . Assim, a mistura foi acondicionada em um balão de 150 mL juntamente com 15 mL de metanol e 1,5 mL de ácido clorídrico concentrado para manter um pH de 1-3. A mistura reacional foi mantidas sob agitação e refluxo, 60 °C, por uma hora. Após este período, foi adicionado 60 mL de uma solução saturada de NaCl. A mistura foi transferida para um funil de separação e os ésteres metílicos foram extraídos com clorofórmio (3X 60 mL) em seguida, com acetato de etila (3X 50mL). As fases orgânicas, contendo os ésteres, foram secas com Na2SO4 anidro, filtradas e
concentradas por destilação do solvente em evaporador rotativo sob pressão reduzida, resultando em 0.2687 g da fração clorofórmio (EHPAET-EM-C) e 0,0976 g a fração acetato (EHPAET-EM-A). Então os ésteres foram submetidos a análise de CG-MS para conhecimento de seus ácidos graxos correspondentes.
5.3.5 Fracionamento Cromatográfico de EHPAET-C-insap
A fração EHPAET-C-insap (1,0 g) foi submetida à cromatografia em coluna para separação de suas substâncias por diferença de polaridade. Assim, inicialmente, a fração EHPAET-C-insap (1,00 g) foi adsorvida em gel de sílica flash numa proporção 1:3 e pulverizada em gral de porcelana, sendo em seguida, acondicionada sobre 62,71 g de gel de sílica flash, numa coluna cromatográfica (Φ = 3,0 cm). A eluição foi realizada com solventes puros ou mistura binária dos solventes: hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol, sempre seguindo uma ordem crescente de polaridade. Conforme Tabela 3.
Tabela 3 – Proporções de solventes e volumes para a obtenção das frações de 1-14 a partir da fração EHPAET-C-insap. ELUENTE/PROPORÇÃO VOLUME (mL) FRAÇÕES Hexano/clorofórmio 30% 200 EHPAET-C-insap-HC-(1) Hexano/clorofórmio 50% 200 EHPAET-C-insap-HC-(2) Hexano/clorofórmio 90% 250 EHPAET-C-insap-HC-(3)
Clorofórmio /acetato de etila 20% 200 EHPAET-C-insap-CA-(4-7)
Clorofórmio /acetato de etila 30% 100 EHPAET-C-insap-CA-(8)
Clorofórmio /acetato de etila 70% 200 EHPAET-C-insap-CA-(9-11)
Acetato de etila 100% 100 EHPAET-C-insap-A-(12)
Acetato de etila/metanol 40% 100 EHPAET-C-insap-A-(13)
Acetato de etila/metanol 60% 250 EHPAET-C-insap-A-(14)
Fonte: Própria, 2017.
O fracionamento cromatográfico resultou em 14 frações as quais foram analisadas por CCD e em seguida reunidas conforme semelhança. A fração EHPAET-C-insap-HC-(3) após analisada por CCD foi lavada com hexano/clorofórmio na proporção 5:2 e identificou-se uma amostra pura, a qual foi submetida à análise de RMN 1H e 13C, e teve sua estrutura química elucidada.
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 RENDIMENTO DO EXTRATO EHPAET
A quantidade de material utilizado e extrato obtido, bem como o valor de rendimento encontram-se listado na Tabela 4.
Tabela 4 – Quantidades de material botânico seco utilizado e rendimento obtido.
Qtde de Material Botânico / (g)
Denominação Qtde de Extrato / (g) Rendimento (%)
974,686 g EHPAET 117,77 g 12,08
EHPAET – extrato hexano da parte aérea da Euphorbia. Fonte: Própria, 2017.
A partir dos dados observados na tabela acima, percebeu-se que o extrato hexano da parte aérea apresentou um rendimento de apenas 12,08 %.
6.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE PELA CAPTURA DO RADICAL LIVRE DPPH
O DPPH inicialmente apresentava coloração púrpura e, após ação dos antioxidantes ou espécies radicalares presentes no extrato, o radical foi reduzido à difenil-picril-hidrazina de coloração amarela, de acordo com as respectivas concentrações: de 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3,0 mg/mL. Figura 10.
Figura 10 – Redução do DPPH pelos antioxidantes do extrato EHPAET nas
concentrações de 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3,0 μg/mL, respectivamente.
A partir dos resultados obtidos das medidas de absorbância, Tabela 5, foi possível, também, determinar a porcentagem de atividade antioxidante (AA%), que corresponde à quantidade de DPPH consumida pelos constituintes antioxidantes presentes no extrato hexano de Euphorbia tirucalli.
Tabela 5 – Dados das concentrações, absorbâncias e atividades antioxidantes.
EEPAE EEPAET Concentração
(g/mL) Branco Controle (-) ABS1 ABS2 ABS3 AA%1 AA%2 AA%3 1 0,5 0,004 1,051 0,205 0,196 0,250 80,8753 81,7316 76,5937 2 1,0 0,006 1,051 0,050 0,050 0,052 95,8135 95,8135 95,6232 3 1,5 0,008 1,051 0,050 0,050 0,050 96,0038 96,0038 96,0038 4 2,0 0,009 1,051 0,050 0,051 0,050 96,0989 96,0038 96,0989 5 2,5 0,011 1,051 0,051 0,051 0,051 96,1941 96,1941 96,1941 6 3,0 0,011 1,051 0,054 0,052 0,051 95,9086 96,0989 96,1941 Fonte: Própria.
É importante destacar que para o cálculo da atividade antioxidante foi necessária a utilização da leitura da absorbância do controle negativo (DPPH + solvente). Sendo assim, foi observado que todas as amostras apresentaram capacidade de consumo de DPPH, visto que as absorbâncias após reação de DPPH com as diferentes concentrações das amostras testadas foram significativamente menores se comparado com as absorbâncias obtidas para o controle negativo, o que pode demostrar, preliminarmente, a atividade antioxidante para o extrato EHPAET de Euphorbia tirucalli. Contudo, observando os valores das absorbâncias, percebeu-se que estas não apresentaram uma variação significativa, fato que pode está relacionado com as altas concentrações das soluções, necessitando assim, refazer o teste.
O Gráfico 1 refere-se à curva analítica empregada para o experimento de DPPH e foi avaliada quanto à linearidade.
Gráfico 1 – Curva analítica da atividade antioxidante versus a
concentração do extrato.
Fonte: Própria.
Assim, de acordo com o gráfico acima foi possível observar que porcentagem de sua atividade antioxidante (AA%) a partir da segunda concentração não variou com o aumento concentração da amostra e, consequentemente, e este resultado implicou no consumo de DPPH pela amostra. Ainda, analisando a correlação entre a atividade antioxidante (AA%) e a concentração do extrato, no Gráfico 1, observou-se que o R2 = 0,6456 é um valor muito pouco representativo.
Com base nos resultados aqui obtidos, pode-se assim, contatar a possível presença de compostos que atuam como antioxidante na amostra, uma vez que foi possível constatar a mudança de coloração referente a captura do radical livre, DPPH. Entretanto, há a necessidade de repetir os testes para melhorar as análises.
Atualmente, o interesse no estudo dos compostos antioxidante tem aumentado muito, devido principalmente à habilidade destas substâncias em sequestrar radicais livres, os quais são prejudiciais a saúde humana (ALVES et al., 2007; NEVES et al., 2008).
6.3 ESTUDO DAS FRAÇÕES SAPONIFICÁVEIS E INSAPONIFICÁVEIS 6.3.1 Rendimento
Os dados referentes ao rendimento dos saponificáveis e dos ésteres metílicos estão listados nas Tabela 6 e Tabela 7.
Tabela 6 – Massa obtida dos insaponificáveis a partir da reação de saponificação da fração EHPAET.
Extrato/Quantidade/(g) Insaponificáveis Quantidade/(g)
EHPAET (5 g) EHPAET-C-insap 3,0317 y = 9,1457ln(x) + 88,86 R² = 0,6456 IC50=0,014 60 70 80 90 100 110 120 0 2 4 % AA Concentração (mg/mL)
Atividade Antioxidante do EHPAET
AA%3 Log. (AA%3)
Fonte: Própria.
Tabela 7 – Rendimento dos ésteres metílicos da reação de esterificação fração EHPAET.
Extrato/Quantidade/(g) Frações Quantidade/(g)
EHPAET (5 g) EHPAET-EM-C 0,2687
EHPAET-EM-A 0,0976
Fonte: Própria, 2017.
De acordo com o observado nas tabelas acima, percebeu-se que a fração EHPAET-C-insap apresentou o melhor rendimento, com uma massa de 3,0317 g, e a fração EHPAET-EM-A apresentou a menor massa, 0,0976.
6.3.2 Fracionamento da fração EHPAET-C-insap
O tratamento cromatográfico a fração EHPAET-C-insap, conforme descrito na Tabela 8 permitiu o isolamento de uma substância. O composto apresentou-se como um sólido amorfo de coloração branca, na fração EHPAET-C-insap-HC-(3), a qual foi extraida com uma mistura binária de Hexano/clorofórmio 90%. O sólido obtido era solúvel em clorofórmio foi denominado de ET-1. Então, a substância foi analisada por ressonância magnética nuclear de hidrogênio-1 e carbono-13.
Tabela 8 – Frações, massa e análise das CCD das frações de 1-14.
FRAÇÕES MASSA (g) CCD (Hexano/clorofórmio 90%)
EHPAET-C-insap-HC-(1) 200 EHPAET-C-insap-HC-(2) 200 EHPAET-C-insap-HC-(3) 250 EHPAET-C-insap-CA-(4-7) 200 EHPAET-C-insap-CA-(8) 100 EHPAET-C-insap-CA-(9-11) 200 EHPAET-C-insap-A-(12) 100 EHPAET-C-insap-A-(13) 100 EHPAET-C-insap-A-(14) 250 Fonte: Própria, 2017.
6.3.3 Caracterização química de ET-1
No espectro de RMN 1H, Figura 11, verificou-se sinais característicos de hidrogênios de terpenos na região entre δ 0,5 e 2,25 ppm, caracterizando hidrogênios ligados a carbono metílicos, metilênicos e metinos. Também, foi observado um tripleto
em δ 5,24 ppm (J = 11,4 Hz), relativo ao hidrogênio olefínico (H-12) e ainda um dubleto de dubleto em δ 3,25 ppm (j = 4,2; 9,0 Hz), correspondendo ao hidrogênio carbinólico (H-3).
No espectro de RMN 13C, Figura 12, foram observados trinta sinais de carbono que pode caracterizar o composto como um triterpeno. O sinal δ 145,41 ppm corresponde a um carbono olefínico não hidrogenado (C-13), bem como um sinal em δ 121,96 ppm que corresponde ao carbono (C-12) característicos de esqueleto triterpenos pentacíclicos do tipo oleonano. Portanto, a partir dos dados de RMN 1H e 13C, bem como por comparação destes com a literatura,
Tabela 9, foi confirmada a estrutura do composto isolado.
Tabela 9 – Dados de RMN de 1 H e 13C (CDCL
3, 300 MHz) do β-amirina e comparação com os dados da literatura (CDCL3, 500 MHz). δC(ppm) δH (ppm) (mult., J em Hz) C ET-1 Literatura (DIAS, 2011) ET-1 Literatura (DIAS, 2011) 1 38,8 38,7 -- -- 2 27,4 27,2 -- -- 3 79,2 79,3 3,25 (dd, j=4,2; 9,0) 3,15 (dd, j=4,4;10,8)
4 39,0 38,5 -- -- 5 55,4 55,1 0,79 (d, j=11,4) 0,68 (d, j=11,0) 6 18,6 18,6 -- -- 7 32,7 32,4 -- -- 8 28,9 39,8 -- -- 9 47,5 47,6 -- -- 10 37,3 36,9 -- -- 11 23,7 23,6 -- -- 12 121,9 121,7 5,24 (t, j=3,0) 5,12 (t, j=3,2) 13 145,4 145,2 -- -- 14 41,9 41,7 -- -- 15 27,1 26,2 -- -- 16 26,3 26,1 -- -- 17 32,9 32,6 -- -- 18 47,8 47,2 -- -- 19 47,0 46,8 2,10 (dd, j=4,5; 13,5) 1,93 (dd, j=4,0; 13,7) 20 31,2 31,0 -- -- 21 34,9 34,7 -- -- 22 37,1 37,1 2,00 (m) 1,80 (m) 23 28,3 28,0 0.88 (s) 0,77 (s) 24 15,7 15,4 1,02 (s) 0,90 (s) 25 15,7 15,4 0,84 (s) 0,73 (s) 26 17,0 16,8 1,04 (s) 0,93 (s) 27 26,1 25,9 1,30 (s) 1,19 (s) 28 28,6 28,4 1,18 (s) 1,07 (s) 29 33,5 33,8 0.99 (s) 0,87 (s) 30 23,9 23,7 0,92 (s) 0,80 (s) Fonte: Própria, 2017.
Figura 11 – Espectro de RMN 1H da ET-1, CDCl
3, 300 MHz.
Fonte: Própria, 2017.
Figura 12 – Espectro de RMN 13C da ET-1, CDCl
3, 125 MHz.
Fonte: Própria, 2017.
O composto isolado é triterpeno pentacíclico conhecido como β-amirina, amplamente encontrado na literatura no gênero Euphorbia, e também já foi relatado na espécie Euphorbia tirucalli, Figura 13. Este terpeno é comumente encontrado em forma
de mistura, α e β-amirina, que se diferem apenas pela posição de um grupo metila na posição C-19 e C-20, respectivamente. Assim, o triterpeno α-amirina faz parte da classe dos ursanos enquanto o β-amirina pertence a classe dos oleonanos.
Figura 13Estrutura do β-amirina (C30H50O).
2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 21 20 19 HO 30 29 23 24 25 26 27 28 Fonte: Própria, 2017.
6.3.4 Análise dos constituintes das frações EHPAET-C-insap, EHPAET-ME-C e EHPAET-EM-A por CG/EM
A identificação dos constituintes apolares presentes nas frações EHPAET-C-insap, EHPAET-ME -C e EHPAET-EM-A foi realizada por comparação do espectro de massa referente aos picos mais intensos do cromatograma com os espectros de massas e moléculas contidas no banco NIST08s.LIB do aparelho de CG/EM. A partir destes dados foi possível identificar os compostos presentes em cada fração.
6.3.4.1 Constituintes da fração EHPAET-C-insap
O cromatograma, Figura 14, indica os compostos que compõe a fração EHPAET-C-insap. Cada pico representa um composto diferente e cada composto tem um tempo de retenção associado. Através da comparação com o banco de dados os compostos correspondentes aos picos mais intensos foram identificados. A Tabela 10
relaciona os tempos de retenção para os picos do cromatograma da fração EHPAE-C-insap e as respectivas estruturas, bem como os o nome dos constituintes correspondente. Enquanto na Tabela 11 estão relatados os espectros de massa para cada composto identificado e sua estrutura para os seguintes tempos de retenção: 9,72; 22,67e 33,40
Figura 14 – Cromatograma (CG-EM) da fração EHPAET-C-insap.
Fonte: Própria, 2017.
Tabela 10 – Tempo de retenção e suas respectivas estruturas dos constituintes identificados na fração
EHPAET-insap. TR Estruturas Constituintes 9,72 OH 1-hexanol-2-etil 22,67 1-nonadeceno 33,40 O OH OH HO
O Isso alocholato de etila
Fonte: Própria, 2017. RT:0.00 - 34.04 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 Time (min) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 30.95 4.04 27.93 33.40 29.31 4.19 4.58 9.72 32.66 4.84 22.67 5.45 6.05 6.807.65 25.4027.69 8.13 10.0111.22 22.51 19.09 13.21 18.12 NL: 2.57E7 TIC MS CA_INSAP 2
Tabela 11 – Espectros de massa referente ao cromatograma da fração EHPAET-C-insap e suas
Fonte: própria, 2017.
De acordo com o observado acima, os possíveis compostos identificados para esta amostra foram: 1-hexanol-2-etil 1-nonadeceno e alocolato de etila.
6.3.4.2 Constituintes da fração EHPAET-EM-C
O cromatograma, Figura 15, indica os compostos que compõe a fração EHPAET-EM-C. Cada pico representa um composto diferente e cada composto tem um tempo de retenção associado. Através da comparação com o banco de dados NIST08s.LIB os compostos correspondente a cada pico foram identificado. A Tabela 12 relaciona os tempos de retenção para os picos do cromatograma da fração EHPAET-EM-C e as respectivas estruturas, bem como o rendimento. Enquanto na Tabela 13 estão relatados os espectros de massa para cada composto identificado e sua estrutura para os seguintes tempos de retenção: 8,22; 19,99; e 23,46 respectivamente, que corresponde aos picos mais intensos presentes no cromatograma.
Figura 15 – Cromatograma (CG-EM) da fração EHPAET-EM C.
Tabela 12 – Tempo de retenção e suas respectivas estruturas e o redimento da fração EHPAET-EM-C.
TR Estruturas Constituintes 8,22 OH O Ácido 2-metil pentanóico 19,99 O O 9-Oxabiciclo- [3.3.1]-nonan-2-ona-5-hidroxi 23,46 OH Heptatriacotanol 1-RT:0.00 - 34.03 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 Time (min) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 30.95 4.04 30.47 30.27 31.39 8.22 32.03 28.81 4.38 23.46 28.47 33.41 4.60 4.98 27.45 5.52 19.99 24.21 23.16 26.39 11.22 8.54 19.66 9.15 13.68 15.02 16.68 NL: 2.54E7 TIC MS EM_C2_2
Tabela 13 – Espectros de massa referente ao cromatograma da fração EHPAET-EM-C e suas
Fonte: Própria, 2017.
Os possíveis compostos identificados para esta amostra foram: ácido 2-metil-pentanóico, 9-oxabiciclo-[3.3.1]-nonan-2ona-5hidroxi e triacontanol. Nesta fração não foi possível identificar os ésteres metílicos esperados, o que pode está associado ao fato da reação de esterificação não ter sido bem sucedida.
6.3.4.3 Constituintes da fração EHPAET-A
O cromatograma, Figura 15, indica os possíveis compostos que compõe a fração EHPAET-EM-A. Cada pico representa um composto diferente e cada composto tem um tempo de retenção associado. Através da comparação com o banco de dados NIST08s.LIB os compostos correspondente a cada pico foram identificado. A Tabela 14 relaciona os tempos de retenção para os picos do cromatograma da fração EHPAET-EM-A e as respectivas estruturas, bem como o rendimento. Enquanto na Tabela 15 estão relatados os espectros de massa para cada composto identificado e sua estrutura para os seguintes tempos de retenção: 11,20; 13,57 e 30,96 respectivamente, que corresponde aos picos mais intensos presentes no cromatograma.
Figura 16 – Cromatograma (CG-EM) da fração EHPAET-EM-A.
Fonte: Própria, 2017.
Tabela 14 – Tempo de retenção e suas respectivas estruturas e o redimento da fração
EHPAET-EM-A. TR Estruturas Constituintes 11,20 OH 2-Metil-1-nonen-3ona 13,57 H2N O 2-Petanona-4-amino-4-metil 30,96 O OH OH HO
O Isso alocholato de etila
RT:0.00 - 34.03 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 Time (min) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 4.03 16.67 3.10 30.96 4.22 4.39 33.40 30.46 4.90 31.61 29.73 29.14 5.11 5.60 28.50 11.22 6.46 27.77 7.10 13.57 27.16 7.65 14.98 8.63 26.28 23.18 18.20 12.09 18.94 NL: 1.75E7 TIC MS EM_A2_17 120619145 0
Tabela 15 – Espectros de massa referente ao cromatograma da fração EHPAET-EM-A e suas
Fonte: Própria, 2017.
Os possíveis compostos identificados para esta amostra foram: 2-metil-1-nonen-3ona, 2-pentanona-4-amino-metil e isso alocolato de etila. Nesta fração também não foi possível identificar os ésteres metílicos esperados, o que pode está associado ao fato da reação de esterificação não ter sido bem sucedida, necessitando assim, refazer as reações de esterificação.
7 PERSPECTIVAS FUTURAS
Dentro do objetivo aqui proposto, pode-se destacar ainda, a avaliação da atividade antioxidante do extrato hexano da parte aérea, visto que esse tipo de investigação tem sido evidenciado por um aumento significativo nos últimos anos, uma vez que várias patologias incluindo o câncer apresentam efeitos danosos na produção de radicais livres em consequência do estresse oxidativo. Assim, torna-se relevante a necessidade de refazer os testes da atividade antioxidante, visto que os mesmos não apresentaram resultados significativos, o que pode está relacionado com a metodologia que foi empregada.
Também, será realizada as análises e discursões dos espectros de massas para a identificação dos possíveis compostos apolares da fração hexano e assim ter um panorama geral da composição química desta fração e os possíveis compostos a serem isolados.
8 CONCLUSÃO
Através do estudo realizado foi possível avaliar a atividade antioxidante do extrato hexano da parte aérea de espécie Euphorbia tirucalli e assim constatar, com base nos resultados obtidos, a possível presença de compostos uma vez que foi observado mudança de coloração em todas as concentrações testada. Contudo, há a necessidade de refazer o teste da atividade antioxidante em concentrações menores.
O estudo Também permitiu, a partir de técnicas cromatográficas clássicas, o isolamento de um metabólito secundário denominado ET-1, que corresponde ao triperpeno β-amirina, muito comum em plantas do gênero Euphorbia, bem como da espécie em estudo.
Foram identificados ainda na fração apolar 1-hexanol-2-etil, 1-nonadeceno e alocolato de etila como constituintes dos insaponificáveis. E ácido 2-metil-pentanóico, 9-oxabiciclo-[3.3.1]-nonan-2ona-5hidroxi e triacontanol, metil-1-nonen-3ona, 2-pentanona-4-amino-metil e isso alocolato de etila presentes na fração contendo os saponificáveis. Contudo, não foi possível identificar os ésteres metílicos presentes, o que pode está associado ao fato da reação de esterificação não ter sido efetiva.
Portanto, os resultados obtidos motivam a continuação do estudo químico da espécie em questão, bem como a investigação de novas atividades farmacológicas do constituinte isolado, uma vez que os triterpenóides são constituintes que têm despertado um grande interesse nos últimos anos em razão da descoberta do seu potencial farmacológico, com inúmeras atividades terapêuticas (BARBOSA-FILHO et al., 2007).
