Estudo fitoquímico dos frutos de G.americana

O EHP e o EHE foram fracionados por meio de partição líquido-líquido, com solventes de polaridade crescente (CH2Cl2, AcOEt e n-BuOH), resultando em quatro frações para cada extrato. O processo de partição líquido-líquido realizado com o EHP e com o EHE foi realizado da mesma forma já descrita no item 4.3 para o EHF. No entanto, para ambos os extratos partiu-se de um volume inicial de 1200 mL, com o qual foi utilizado para cada partição 400 mL do extrato e 300 mL de solvente orgânico (3× 300 mL/cada solvente), conforme apresentado no Fluxograma 4.

Todas as frações obtidas dos EHE e EHP foram concentradas com o auxílio de evaporador rotatório sob pressão reduzida, em temperatura inferior a 50°C e foram armazenadas no dessecador, para posterior obtenção dos valores dos rendimentos de cada fração.

4.4.1 Análises cromatográficas dos extratos e frações do EHE e EHP de G. americana por CCD

O EHE, o EHP e as frações obtidas da partição líquido-líquido desses extratos foram analisados preliminarmente por CCD, com uso de cromatoplacas de alumínio de sílica gel 60 F254 e diferentes sistemas de solvente e reveladores (Quadro 06).

Rota-evaporação de etanol

2000 mL de EHE e EHP 800g de endocarpo ou pericarpo fresco: 1600 mL etanol 70%

1200 mL EHE ou EHP concentrado- 3 partições líquido-líquido (3x 400mL EHF: 300mL) solvente orgânico

Fr. CH2Cl2

Fr. CH2Cl2 Fr. BuOH Fr. Residual

Aquosa

Fluxograma 4: Esquema de partição líquido-líquido do EHP e EHE de G. americana.

Quadro 06: Sistemas cromatográficos empregados para análises dos extratos e frações dos frutos de G. americana por CCD.

SISTEMA Fase Móvel Revelador

I acetato de etila: ácido fórmico: água: metanol (10:0,5:0,2:0,6, v/v/v/v).

Reagente Natural A - 1%. UV: 365 nm.

II acetato de etila: ácido fórmico: água: metanol (10:0,5:0,2:0,6; v/v/v/v)

Vanilina Sulfúrica III n-hexano: acetato de etila: ácido

fórmico (7,0:3,0:0,5; v/v/v).

Vanilina Sulfúrica

Cabe ressaltar que somente o EHE foi submetido à purificação, tendo em vista a indisponibilidade de tempo.

4.4.2 Isolamento dos compostos GE1, GE2, GE3, GE4 e GE5 do endocarpo de G. americana a partir da fração CH2Cl2 do EHE: Utilizou-se 3 g da fração CH2Cl2 do EHE para purificação por meio de uma coluna em gel de sílica, com eluição gradiente em ordem crescente de polaridade (n-hexano-clorofórmio-AcOEt), a qual resultou em duas frações importantes para dar sequência ao isolamento, a fração ELA-A (148 mg) e a fração ELA-B (97 mg). Da fração ELC-A foi possível o isolamento do composto denominado GE1 (6 mg) por meio de uma coluna em gel de sílica, conforme descrito na Fluxograma 5.

Da fração ELA-B foram isolados os compostos GE2 (Fr. 50-60) e GE3 (Fr. 220-240), e de sua fração metanólica, após evaporação do solvente, solubilizada em água destilada (10 mL) e particionada em tubo de ensaio com solventes de polaridade crescente CH2Cl2, CH2Cl2:AcOEt (50:50), AcOEt. Das frações CH2Cl2:AcOEt (50:50) e AcOEt, foi obtido o composto GE4 (32 mg) e da fração aquosa o composto GE5. Este processo de purificação está descrito no Fluxograma 5.

Fr.CH2Cl2 do EHE

3 g

Cromatografia em Coluna Clássica FE: 60 g gel de sílica 60 (0,063-0,200 mm) FM: 50 mL (50% n-hexano a 100% de CHCl3 a 100% AcOEt).

Fluxo: 3 mL/min; 20 mL/fração

FM: AcOEt: MeOH (100:0) a AcOEt: MeOH (0:100) (v/v) 250ml)

ELA-A (142 g)

Composto GE1 * Composto GE2*

Fluxograma 5: Esquema de isolamento dos compostos GE1, GF2, GF3, GF4 e GF5 do endocarpo de G. americana L.

ELA-B (97 g)

* Foi realizada a análise por LC-MS-MS e serão realizados os espectros de RMN 1H

e 13C 1D e 2D para finalizar a caracterização das moléculas.

**Amostras foram encaminhadas para análise por RMN de 1H e 13C 1D e 2D.

Cromatografia em Coluna Clássica FE: 30 g gel de sílica 60 (0,063-0,200

mm)

FM: n-hexano:AcOEt (87:13; v/v) Fluxo: 1 mL/min; 1 mL/fração

Composto GE3 * Composto GE4* Composto GE5**

Cromatografia em Coluna Clássica FE: 25 g gel de sílica 60 (0,063-0,200 mm) FM: n-hexano:AcOEt:ác. fórmico (7:3:0,5; v/v/v)

4.5 ESPECTROSCOPIA DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE HIDROGÊNIO (RMN 1H) E CARBONO-13 (RMN 13C)

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1_{H) e Carbono-13 (RMN} 13_{C), uni e bidimensionais, foram obtidos em} espectrômetros Bruker, modelo Avance DPX-300 e/ou modelo Avance DRX 500, pertencentes ao Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear da Universidade Federal do Ceará (CENAUREMN-UFC), as análises foram realizadas pela Profa. Dra Renata Mendonça Araújo.

Como algumas substâncias estão em fase de análise. O procedimento metodológico adotado é o padrão, porém algumas substâncias não necessitaram de todas as análises, que o equipamento fornece para determinação estrutural.

4.5.1 Parte Experimental

O espectrômetro Bruker Avance DRX-300®, equipado com sonda de detecção inversa de 5 mm e magneto de 7,0 T, foi operado nas freqüências de 300,13 e 75,47 MHz para hidrogênio e carbono, respectivamente. Nos experimentos realizados no aparelho Bruker Avance® DRX-500, foram aplicadas freqüências de 500,13 MHz (1H) e 125,75 MHz (13C), sob um campo magnético de 11,7 T. O tipo de sonda variou conforme o tipo de técnica: sonda dual de 5 mm com detecção direta (experimentos unidimensionais) e sonda multinuclear de 5 mm com detecção inversa (experimentos bidimensionais).

As amostras foram dissolvidas em alíquotas de 0,6 mL de solvente deuterado: clorofórmio (CDCl3), metanol (CD3OD), acetona (CD3)2CO) ou piridina (C5D5N), comercializados pelas companhias ACROS®, Cambridge Isotope Laboratories®, Merck® ou Aldrich®. Os deslocamentos químicos (d) foram expressos em partes por milhão (ppm) e referenciados, no caso dos espectros de Hidrogênio, pelos picos dos hidrogênios pertencentes às moléculas residuais não-deuteradas dos solventes deuterados utilizados: benzeno (d 7,16), clorofórmio (d 7,27), dimetil sulfóxido (d 2,50), metanol (d 3,31), piridina (d 8,74; 7,58; 7,22) e acetona (d 2,05). Nos espectros de carbono-13, os deslocamentos químicos foram referenciados pelos picos centrais dos carbonos-13 dos solventes: benzeno (d 128,39), clorofórmio (d 77,23), dimetil sulfóxido (d 39,50), metanol (d 49,17), piridina (d 150,35; 135,91;

123,87) e acetona (d 206,68 e 29,92). As multiplicidades dos sinais de hidrogênio nos espectros de RMN 1H foram indicadas segundo a convenção: s (simpleto), d (dupleto), dd (duplo dupleto), t (tripleto), q (quarteto), m (multipleto).

Os experimentos bidimensionais de correlação homonuclear (COSY, NOESY e TOCSY) e heteronuclear (HSQC-TOCSY, HSQC e HMBC), realizados no aparelho Bruker Avance DRX-500, foram efetuados em sonda multinuclear de 5 mm, com detecção inversa, empregando-se gradiente de campo, posicionado no eixo z e magnitude de 10 A. Os valores de J utilizados para os experimentos pertinentes foram 1JH,C = 145, nJH,C = 7, onde n ³ 2.

4.6 ESTUDO BIOLÓGICO DAS FOLHAS E DOS FRUTOS DE G.