Estudo químico e biológico de Genipa americana L. (Jenipapo)

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. ESTUDO QUÍMICO E BIOLÓGICO DE Genipa americana L. (JENIPAPO). AUTOR DISCENTE: Jovelina Samara Ferreira Alves ORIENTADORA: Profª. Dra. Silvana Maria Zucolotto Langassner CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Renata Mendonça Araújo. NATAL-RN 2014.

(2) 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. ESTUDO QUÍMICO E BIOLÓGICO DE Genipa americana L. (JENIPAPO). Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para a obtenção do Grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Prof. Dra. Silvana Maria Zucolotto Langassner. Coorientadora: Prof. Dra. Renata Mendonça Araújo.. NATAL-RN 2014.

(3) 2.

(4) 3.

(5) 4. Aos meus pais, pela torcida de sempre. Obrigada pela educação que me deram: maior riqueza que ganhei nessa vida..

(6) 5. AGRADECIMENTOS À minha orientadora, Profa. Dra. Silvana Maria Zucolotto Langassner, que me acolheu em seu laboratório, fazendo desse metrado um primeiro passo nos sonhos da minha vida profissional. Por ter me confiado um projeto tão gratificante. Sua confiança me fez crescer bastante, sem ela não teria adquirido o conhecimento que obtive nessa jornada. Liberdade é tudo na pesquisa científica. Obrigada por compartilhar os ensinamentos, como professora e pesquisadora. Por insistir no meu aprendizado ao direcioná-lo para área de interesse. Por confiar em minha capacidade e por entender os atropelos. Sua dedicação, confiança, paciência foram essenciais ao longo desses quase “dois” anos. Muito obrigada. A minha co-orientadora Profa. Renata Mendonça Araújo, por ter me apoiado na disciplina de espectroscopia, inicialmente, são de professores assim que precisamos. Obrigada por ter me auxiliado nos experimentos de isolamento, os quais me ajudaram a fazer o que mais queria: colocar em prática a espectroscopia. Obrigada pelos espectros de ressonância magnética nuclear. Obrigada pelo apoio, principalmente àqueles nas horas mais inapropriadas, nos auxílios em dúvidas, etc. Em especial agradeço à Profa. Dra. Raquel Giordani Brandt pelas opiniões na bancada de laboratório, pela esperança sempre estimada e pelos ensinamentos na docência. Obrigada por ser um exemplo. Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da UFRN, com os quais tive o prazer de ver um lado melhor do curso de Farmácia, e ver que realmente fiz a escolha certa. Obrigada pela convivência. Em especial ao Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa, pela parceria firmada nos experimentos de atividade anti-inflamatória e por sua atenção. Ao Prof. Dr. Túlio Flávio Accioly de Lima e Moura, por ter me confiado o seu cromatógrafo líquido de alta eficiência. Muito obrigada! Ao Prof. Flávio Reginatto, por ter me recebido em seu laboratório de Farmacognosia da USFC por dois meses, por ter passado ensinamentos preciosos de cromatografia e colaborado com os testes de atividade antimicrobiana. Obrigada às doutorandas Maíra, Mariana e Tatyane na realização dos experimentos de atividade biológica. Aos técnicos de laboratório Walteçá e Rafael, que me auxiliaram com paciência. Agradeço imensamente a todos os amigos que ganhei em Natal:.

(7) 6. Àqueles que via quase todos os dias, Bárbara, Gisely, Júlia, Rayllan, Gustavo e Érika, os quais acompanharam a minha empreitada na fitoquímica, com os quais sempre dividimos algum conhecimento, como também nos divertimos nas saídas pela cidade, e no caso de Bárbara, pelas cidades, com nossa estadia em Florianópolis. Agradeço a todos os colegas que convivi no Laboratório de Farmacognosia da UFRN. Aos colegas de Laboratório de Farmacognosia da UFSC: Obrigada pelo acolhimento tão especial, adorei conhecer vocês! Aos alunos de iniciação científica, que facilitaram meu trabalho de bancada: Alexandre, Jorge e Layane. Espero que tenha contribuído um pouco na formação de vocês, pois vocês ajudaram na minha, sem dúvidas. A todos os amigos que me ajudaram nesses últimos anos longe da família, seja com um telefonema, uma risada. Aos que me deram seu ombro em momentos ruins da vida também. Obrigada a Fernando e Neidinha. À minha família, que sempre me apoiou nessas loucuras de ir atrás dos sonhos. Obrigada por nunca terem me criticado quanto a isso. Aos meus irmãos Soraia, Júnior e Gutemberg. Em especial ao meu pai, “Seu Baiô”, e a minha mãe, “Dona Toinha”, que sempre fizeram o melhor por mim. Obrigada pela dedicação. Obrigada pela educação que me deram. Ao meu pai: o exemplo de persistência e perfeccionismo. À minha mãe: tempo dedicado a mim quase todos os dias desde que nasci, estando perto ou longe. Eu amo vocês. A Deus por não me desamparar e se fazer presente nos meus projetos sempre..

(8) 7. RESUMO Genipa americana L. (Rubiaceae), conhecida popularmente como “jenipapo”, ocorre amplamente na região Nordeste e em outras regiões do Brasil, como também em outros países. Sob o ponto de vista medicinal, a espécie é usada pela população para diferentes fins como: catártico, antidiarréico, antigonorréico, antiulceroso, analgésico, em casos de sífilis, anemia, icterícia, asma, dentre outros. Devido ao reconhecido uso popular e a escassez de estudos químicos e farmacológicos, o principal objetivo deste estudo foi caracterizar os marcadores e/ou compostos ativos e avaliar atividades farmacológicas das folhas e frutos da espécie. O estudo iniciou-se com a coleta de folhas, frutos maduros e verdes nas mediações da Praia de Barreta (Nísia Floresta-RN), dos quais as folhas foram submetidas à secagem e moagem. Posteriormente, foram preparados os extratos hidroetanólicos das folhas, pericarpo e endocarpo dos frutos e fracionados com solventes orgânicos com ordem de polaridade crescente (éter de petróleo, diclorometano, acetato de etila, e n-butanol). Para análise qualitativa do extrato das folhas e frutos foram utilizadas as técnicas de Cromatografia em Camada Delgada e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Diversos procedimentos cromatográficos (Cromatografia Líquida a Vácuo, Cromatografia em Coluna Clássica e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Semi-preparativa) foram utilizados para o isolamento de compostos. Adicionalmente, realizaram-se ensaios de atividade anti-inflamatória do extrato das folhas, no modelo de peritonite aguda em camundongos e o ensaio de atividade antimicrobiana, pelo método de difusão em disco, com extrato do endocarpo e das folhas de G. americana. Foi observada por Cromatografia em Camada Delgada e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência a presença de flavonoides e iridoides no extrato das folhas e iridoides nos extratos dos do pericarpo e endocarpo dos frutos. A partir do extrato da folha foram isolados e caracterizados dois iridoides, o tetrahidro-7(hidroximetil)1-metoxiciclo-pentapiran-4-carbaldeído, inédito para a espécie e o GF2, provavelmente inédito na literatura, os carboidratos manitol e GF7 e cinco flavonoides GF4, GF5, GF6, GF8 e GF9. Os seis últimos compostos estão em fase de elucidação estrutural. A partir do extrato do endocarpo foram isolados os compostos GE1, GE2, GE3, GE4 e GE5, os quais estão em fase de elucidação estrutural. O extrato das folhas e do endocarpo de G. americana não apresentaram atividade antimicrobiana promissora frente às cepas testadas pelo método de difusão em disco. O extrato das folhas apresentou atividade anti-inflamatória nas doses 50, 100, 200 e 300 mg/kg, observada por meio da inibição da migração de leucócitos para o local da inflamação. Análises espectroscópicas estão sendo realizadas para elucidação de todos os compostos isolados de G. americana. O estudo fitoquímico e de atividades farmacológicas desenvolvidos com as folhas da espécie são resultados inovadores, pois até o momento era registrada a presença de iridoides, monoterpenos, ácidos carboxílicos apenas nos frutos da G. americana. Para as folhas da espécie não há relatos na literatura sobre a presença flavonoides..

(9) 8. ABSTRACT Genipa americana Linnaeus (Rubiaceae) occurs largely Northeast region and others Brazillian regions, as well as in others countries. In the folk medicine, it is used for different purposes as: cathartic, antidiarrheal, antigonorréico, antiulcer, analgesic, in cases of syphilis, anemia, jaundice, asthma, among others. Due to the recognized tradicional use and the few reports about the chemical and pharmacologic studies, the aim of this study was characterized the chemical markers and/or active compounds and evaluated the pharmacological activities of this species. Leaves and fruits were collected in Barreta Beach (Nísia Floresta/RN). Leaves was dried and crushed. After, hidroetanolic extracts from leaves, pericarp and endocarp were obtained and fractionated with organics solvents in order increasing polarity (petroleum ether, dichloromethane, etil acetate and n-butanol). For the qualitative analysis, leaves and fruits extracts was analysed by Thin Layer Chromatography (TLC) and High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Several chromatography procedures (Vacuum Liquid Chromatography, Classic Column Chromatography and SemiPreparative Liquid Chromatography were used to isolation of the chemical compounds. Regarding the pharmacological studies, was evaluated the antiinflammatory activity of leaves extract , in acute peritonitis in mice and the antimicrobial activity assay by the disc diffusion method, of the endocarp and leaves extract of G. americana. It was observed by TLC and HPLC the presence of flavonoids and iridoids in leaves extract and iridoids in the pericarp and endocarp extracts. From the leaves extract were isolated and characterized two iridoids, named tetrahydro-7-(hydroxymethyl)-1-methoxycyclohexyl pentapiran- 4-carbaldehyde, described for the first time for this species and the compound named GF2, probably inedited in the literature, manitol and GF7 carbohydrates and five flavonoids GF4, FG5, GF6, GF8 and GF9. The last six compounds until this moment are not characterized. From the endocarp extract were isolated the compounds GE1, GE2, GE3, GE4 and GE5, until this moment not identified. The leaves and endocarp extracts of G. americana did not show promising antimicrobial activity. In relation to anti-inflammatory activity, leaves extract at doses of 50, 100, 200 and 300 mg/kg showed significant activity observed by inhibition of leukocytes to site of inflammation. Structural elucidation techniques are being performed to elucidate all compounds isolated from G. americana. The phytochemical study and pharmacological activity developed with the leaves of the species is so important because it was so far recorded the presence of iridoids, monoterpenes, carboxylic acids in the fruits of G. americana, but no chemical reports about leaves of this species were found..

(10) 9. LISTA DE FIGURAS Figura 1-. Genipa americana L......................................................... Figura 2-. Iridoides de G. americana................................................... 28. Figura 3-. Núcleo Iridano.................................................................... 29. Figura 4-. Núcleo fundamental dos flavonoides.................................. 30. Figura 5 -. Análise por CCD do extrato e frações das folhas de. 24. Genipa americana L........................................................... 61. Figura 6 -. Cromatograma do EHF de G. americana/ UV 340 nm....... 62. Figura 7 -. Cromatograma do EHF de G. americana/ UV 340 nm....... 63. Figura 8 -. Análise por CCD das frações da CLV da fração BuOH do EHF de G. americana....................................................... Figura 9 -. 65. Análise por CCD das frações da coluna cromatográfica da fração FLD4................................................................... Figura 10 - Análise. por. CCD. das frações. da. coluna. 65. FLD4-. E2..................................................................................... 66. Figura 11 - Cromatograma obtido por CLAE da fração semipurificada FLD4-E2b do EHF de G. americana/ UV 340 nm............... 66 Figura 12 - Cromatograma obtido por CLAE semi-preprarativa da fração FL4-E2..................................................................... Figura 13 - Espectro de. 67. 1. H RMN do carboidrato GF1: manitol. (DMSO; 300 MHz)............................................................... 69. Figura 14 - Espectro de HSQC do carboidrato GF1: manitol (DMSO; 300 MHz)............................................................................. 70. Figura 15 - Análise por CCD das frações da CLV da fração AcOEt do EHF de G. americana......................................................... 71. Figura 16 - Análise por CCD das frações da coluna cromatográfica da fração FLD3.................................................................... 72. Figura 17 - Cromatograma obtido por CLAE semi-preparativa da fração FLC3-F..................................................................... 73 Figura 18 - Cromatograma obtido por CLAE semi-preparativa da fração FLC7-E..................................................................... 74 Figura 19 - Espectro de RMN de 1H do iridoide GF2 (DMSO; 300 MHz).................................................................................... 76.

(11) 10. Figura 20 - Espectro de RMN de. 13. C do iridoide GF2 (DMSO; 75. MHz)................................................................................... 77. Figura 21 - Espectro de HSQC do iridoide GF2 (DMSO; 300 MHz)..... 79. Figura 22 - Correlações H-H observadas no espectro de correlação COSY para o iridoide GF-2................................................. 80 Figura 23 - Estrutura proposta para o iridoide GF2: (1R,4aS,7aS)-1hidroxi-7-(hidroximetil)-1H,4aH,5H,7aHcyclopenta[c]pyran-4-carbaldeido....................................... 80. Figura 24 - Espectro de COSY do iridoide GF2 (DMSO; 300 MHz)...... 81. 1. Figura 25 - Espectro de H RMN do iridoide GF3 (DMSO; 500 MHz)... 83. Figura 26 - Fórmulas estruturais de dos iridoides GF3, 1-β-metoxigardendiol, artselaenin-A.................................................... Figura 27 - Iridoide. GF3:. 85. tetrahidro-7-(hidroximetil)1-metoxiciclo-. pentapiran-4-carbaldeído.................................................... 85 Figura 28 - Espectro de RMN de. 13. C do iridoide GF3 (DMSO; 125. MHz)................................................................................... 86. Figura 29 - Análise por CCD do extratos e frações do endocarpo e do pericarpo de Genipa americana..................................... 88 Figura 30 - Análise por CCD das frações da coluna da fração clorofórmio do EHE de Genipa americana L....................... 90. Efeito do EHF de G. americana (50, 100, 200, 300 e 500 Figura 31 - mg/kg i.p.) administrado 30 minutos antes da carragenina (Cg 1%/cav.), no modelo de peritonite aguda, sobre níveis de leucócitos totais. Dexa = Animais tratados com dexametasona (0,5 mg/kg, i.p., 0,5 h)................................. 92. Figura 32 - Efeito anti-inflamatório das frações do EHF de G. americana (50 mg/kg i.p.) administradas 30 minutos antes da carragenina (Cg 1%/cav.), no modelo de peritonite aguda, sobre níveis de leucócitos totais.............. 95.

(12) 11. LISTA DE FLUXOGRAMAS Fluxograma 1-. Esquema de partição líquido-líquido do EHF................ Fluxograma 2-. Esquema de isolamento dos compostos GF1, GF7, GF8 e GF9 das folhas de G. americana....................... Fluxograma 3-. 52. Esquema de partição líquido-líquido do EHP e EHE de G. americana............................................................ Fluxograma 5-. 49. Esquema de isolamento dos compostos GF2, GF3, GF4, GF5 e GF6 das folhas de G. americana.............. Fluxograma 4-. 43. 53. : Esquema de isolamento dos compostos GE1, GF2, GF3, GF4 e GF5 do endocarpo de G. americana L..... 55.

(13) 12. LISTA DE QUADROS Quadro 1-. Substâncias isoladas de G. americana............................... 27. Quadro 2-. Sistemas cromatográficos empregados em CCD............... Quadro 3-. Condições cromatográficas de isolamento de compostos do EHF por CLAE semi-preparativa.................................. Quadro 4-. 47. Gradientes de fase móvel da CLV realizada com a fração AcOEt do EHF (150 mL para cada gradiente)................... Quadro 6-. 46. Gradientes de fase móvel da CLV realizada com a fração n-BuOH do EHF (250 mL para cada gradiente)................. Quadro 5-. 44. 50. Sistemas cromatográficos empregados para análises dos extratos e frações dos frutos de G. americana por CCD................................................................................. 55.

(14) 13. LISTA DE TABELAS Tabela 1-. Rendimento das frações da partição líquido-líquido do EHF, EHP e EHE............................................................... Tabela 2-. Rendimento das frações da CLV da fração AcOEt e BuOH do EHF................................................................... Tabela 3-. 64. Valores de deslocamento químico observados nos espectros de 1H e. 13. C RMN (300 MHz / 75 MHz) para o. carboidrato GF1 em DMSO............................................... Tabela 4-. 60. 68. Valores de deslocamento químico observados nos espectros de RMN de 1H e 13C (300 MHz / 75 MHz) para o iridoide GF2 em DMSO................................................... 78. Tabela 5-. Valores de deslocamento químico observados nos espectros de RMN de 1H e. 13. C (500 MHz / 75 MHz). para o iridoide GF3 e comparação com os valores de RMN de. 13. C (100 MHz) para o garadenal-1, ambos em. DMSO e CDCl3, respectivamente..................................... Tabela 6-. 84. Valores de deslocamento químico observados nos espectros de RMN 1H e. 13. C (500 MHz / 125 MHz) para. o iridoide GF3 em DMSO e comparação com os valores de 1H e 13C RMN (500 MHz /100 MHz) para o 1-βmetoxi-gardendiol e artselaenin-A, ambos em CDCl3....... Tabela 7-. 87. Resultados dos ensaios de atividade antimicrobiana de G. americana...................................................................... 91.

(15) 14. SUMÁRIO INTRODUÇÃO.................................................................................. 17. 1. REVISÃO DE LITERATURA............................................................. 19. 1.1. Plantas Medicinais............................................................................. 19. 1.2. A família Rubiaceae Juss. ............................................................... 21. 1.3. O Gênero Genipa L. ......................................................................... 23. 1.4. Espécie Genipa americana L ........................................................... 23. 1.5. Etnofarmacologia.............................................................................. 23. 1.6. Constituição química......................................................................... 25. 1.7. Dados farmacológicos....................................................................... 1.8. Técnicas cromatográficas para isolamento de compostos bioativos. 31. de produtos naturais..................................... ................................... 33. 1.9. Ressonância Magnética Nuclear ..................................................... 36. 2.0. Atividade anti-inflamatória..................................... ........................... 37. 2.1. Atividade antibacteriana..................................... .............................. 38. 3. OBJETIVOS...................................................................................... 40. 3.1. Objetivo geral..................................................................................... 40. 3.2. Objetivos específicos......................................................................... 40. 4. METODOLOGIA................................................................................ 41. 4.1. Coleta, secagem e moagem do material vegetal.............................. 41. 4.2. Extração e fracionamento dos extratos............................................. 42. 4.3. Estudo fitoquímico das folhas de G. americana................................ 4.3.1. Análises cromatográficas do EHF de G. americana......................... 4.3.2. Isolamento dos compostos GF1, GF7, GF8 e GF9 a partir da. 42 43. fração BuOH do EHF de G. americana............................................. 47 4.3.3. Isolamento dos compostos GF2, GF3, GF4, GF5 e GF6 a partir da fração AcOEt do EHF de G. americana............................................. 50. 4.4. Estudo fitoquímico dos frutos de G.americana................................. 53. 4.4.1. Análises cromatográficas dos extratos e frações do EHE e EHP de G. americana por CCD..................................... ............................... 4.4.2. 53. Isolamento dos compostos GE1, GE2, GE3, GE4 e GE5 do endocarpo de G. americana a partir da fração CH2Cl2 do EHE...... 54.

(16) 15. 4.5. Espectroscopia. de. Ressonância. Magnética. Nuclear. de. Hidrogênio-1 (RMN 1H) e Carbono-13 (RMN 13C)............................. 56. 4.6. Estudo biológico das folhas e dos frutos de G. americana............... 55. 4.6.1. Avaliação da atividade antimicrobiana.............................................. 57. 4.6.2. Avaliação da atividade anti-inflamatória............................................ 58. 5. RESULTADOS E DISCUSSÕES...................................................... 60. 5.1. Estudo fitoquímico das folhas de G. americana................................ 60. 5.1.1. Comparação do perfil cromatográfico das frações do EHF de G.. 60. americana por CCD............................................................................... 5.1.2. Análises cromatográficas por CLAE do EHF de G. americana......... 62. 5.1.4. Isolamento dos compostos GF1, GF7, GF8 e GF9 a partir da fração BuOH do EHF de G. americana............................................. 64. 5.1.4. Isolamento dos compostos GF2, GF3, GF4, GF5 e GF6 a partir da fração AcOEt do EHF de G. americana............................................. 75. 5.2. Estudo fitoquímico dos frutos de G.americana................................. 88. 5.2.1. Análises cromatográficas dos extratos e frações do EHE e EHP de G. americana por CCD..................................... ................................ 5.2.2. 88. Isolamento dos compostos GE1, GE2, GE3, GE4 e GE5 do endocarpo de G. americana a partir da fração CH2Cl2 do EHE........ 89. 5.3. Estudo biológico das folhas e dos frutos de G. americana................ 90. 5.3.1. Avaliação da atividade antimicrobiana.............................................. 90. 5.3.2. Avaliação da atividade anti-inflamatória............................................ 91. 6. CONCLUSÕES..................................... .......................................... REFERÊNCIAS ANEXO A – Solicitação de Depósito de Patente: Processo para obtenção de “extratos, frações, compostos isolados e composição farmacêutica inflamação”.. de. Genipa. americana. L.. no. tratamento. da. 96.

(17) 16. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 13. C RMN = Ressonância Magnética Nuclear de carbono. 1. H RMN = Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio. ACN = Acetonitrila AcOEt = Acetato de etila BuOH = Butanol CCD = Cromatografia em Camada Delgada CCC = Cromatografia em Coluna Clássica CLAE = Cromatografia Líquida de Alta Eficiência COSY= “Correlated Spectroscopy” DAD = Detecção por arranjo de diodos EM = Espectrometria de Massas EtOH = Etanol HSQC = “Heteronuclear Single Quantum Coherence” MeOH = Metanol RMN = Ressonância Magnética Nuclear UV = Ultravioleta.

(18) 17. INTRODUÇÃO A sociedade carrega consigo várias informações sobre o ambiente em que vive, desde a antiguidade. Assim, muitas dessas crenças sobreviveram às passagens de gerações e a partir delas pôde-se trocar informações diretamente com o meio, a fim de buscar a sobrevivência. Neste acervo encontra-se o conhecimento sobre o mundo vegetal, com o qual as sociedades estão em contato. Deste modo, a busca e o uso de plantas com propriedades terapêuticas é uma atividade que vem de geração em geração e são descritos com a intenção de preservar esta tradição milenar, a qual é atestada em vários tratados de fitoterapia. Cerca de 2/3 da população do planeta utilizam as plantas como único recurso terapêutico (NEWALL, 2002; ARGENTA et al., 2011). As grandes fontes de biodiversidade são as florestas tropicais localizadas em países em desenvolvimento como o Brasil, o qual detém aproximadamente um terço da flora mundial, no entanto esse país perde para outros no que concerne à manufatura e comercialização de produtos naturais, devido ao custo dessa produção (AGRA et al., 2008; KLEIN et al., 2009; MARINHO et al., 2011). Dentro desse cenário da flora brasileira, destaca-se a espécie Genipa americana Linnaeus de ocorrência em todas as regiões do país, como também em outros países. Do ponto de vista comercial, essa espécie fornece madeira de boa qualidade para a construção civil, móveis e produtos artesanais e os frutos comestíveis são usados para produção de sucos, doces e licores, entre outros (LORENZI, 2008). Sob o ponto de vista medicinal, todas as partes da planta são empregadas popularmente e em muitas regiões do país como: catártico, antidiarréico, antigonorréico, antiulceroso, analgésico, em casos de sífilis, anemia, icterícia, asma, hidropsia, problemas de fígado e baço (LORENZI, 2008). Do ponto de vista químico e farmacológico, os estudos realizados com esta espécie mostraram que o primeiro composto isolado de seus frutos no Brasil foi genipina em 1960 (DJERASSI, 1960), em seguida foram encontrados mais dois compostos: os ácidos genípicos e genipínico (TALENT, 1964)..

(19) 18. Posteriormente, surgiram outros estudos que permitiram o isolamento de outros compostos, porém até o presente momento não foram caracterizados os possíveis marcadores e/ou compostos ativos da espécie. Conforme a RDC n° 14 de 31 de março de 2010 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) é importante caracterizar os marcadores da espécie vegetal, para a obtenção do registro de um medicamento fitoterápico. A caracterização dos marcadores auxilia na padronização da matéria-prima vegetal até o produto final, garantindo a qualidade dos medicamentos fitoterápicos que são comercializados. Este controle contribui para garantir a eficácia, segurança e qualidade e a concentração dos princípios ativos no extrato (BRASIL, 2010). Devido ao reconhecido uso popular da espécie G. americana e a escassez de estudos químicos e farmacológicos, faz-se necessário conduzi-los para caracterização dos marcadores e/ou compostos ativos e comprovação de atividades farmacológicas..

(20) 19. 1. REVISÃO DE LITERATURA 1.1 Plantas Medicinais O uso de plantas para tratamento, cura e prevenção e doenças é uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade (VEIGA JÚNIOR; PINTO, 2005). O Brasil possui um grande potencial de bioprospecção devido à biodiversidade e à riqueza do conhecimento tradicional acumulado pelos habitantes locais, o qual é de grande valor, pois essas pessoas possuem acesso direto com a natureza e os produtos da sua biodiversidade. O conhecimento tradicional de plantas medicinais é a base da medicina popular no país, o qual é derivado de uma mistura de culturas indígenas brasileiras e influências europeias e africanas desde o período colonizador (CARTAXO, 2010). O uso de produtos naturais tem se mostrado como uma estratégia de sucesso em inovação tecnológica de medicamentos. Metabólitos secundários de organismos terrestres e marinhos estão sendo usados para o tratamento de várias doenças, considerando que algumas moléculas são utilizadas também como modelos para uso em química medicinal (VALLI et al., 2012). Até o momento, a investigação dos materiais de origem vegetal contribuiu grandiosamente tanto na descoberta de novos fármacos, quanto no delineamento de medicamentos de fitoterápicos (PERKS, 2011). As espécies vegetais produzem uma grande variedade de metabólitos secundários que desempenham um papel fundamental na sobrevivência da própria espécie, como também na manutenção do equilíbrio ecológico, desempenham ainda funções muito importantes na interação da planta com insetos, resistência contra pragas e doenças, atração de polinizadores e interação com microrganismos simbiontes, além de representar uma importante fonte de produtos naturais bioativos (PERKS, 2011). Apesar dos avanços recentes na química combinatória, que permitem a síntese de compostos a partir de uma biblioteca, a qual compreende uma vasta gama de produtos químicos, com propriedades diferentes, a alta diversidade estrutural e complexidade típica de produtos naturais são únicas, colocando-os em posição de superior. No entanto, alguns destes compostos ocorrem em quantidades pequenas, o que torna a sua comercialização inviável. Mesmo quando produtos naturais bioativos identificados não possuem rendimento.

(21) 20. significativo,. potência. ideal. ou. propriedades. farmacológicas. para. o. desenvolvimento de novos medicamentos, as suas estruturas químicas podem ser utilizadas como modelos para a concepção de novos análogos com propriedades biológicas otimizadas (CORBET et al., 2006; KENNEDY et al., 2008). Dentro desse contexto, o medicamento fitoterápico consiste em outra área derivada do estudo com produtos naturais, consistindo assim em um produto tecnicamente elaborado com emprego exclusivo de matérias-primas ativas vegetais, cuja eficácia, segurança, conhecimento dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade são validadas. Não se considera medicamento fitoterápico aquele que inclui na sua composição substâncias ativas isoladas, sintéticas ou naturais, nem as associações dessas com extratos vegetais (BRASIL, 2010). O produto fitoterápico registrado tem se inserido no contexto da inovação farmacêutica, devido à importância do uso popular de algumas espécies, ou a partir da descoberta de novas aplicações para extratos de plantas, ou ainda por possuir atividade mais elevada que substâncias isoladas, devido ao efeito sinérgico que pode ser apresentado pelas várias substâncias presentes em uma matriz biológica, que pode atuar em mais de um alvo terapêutico potencializando a atividade farmacológica (WAGNER; ULRICHMERZENICH, 2009). A popularidade de medicamentos fitoterápicos está aumentando progressivamente em todo o mundo, o que gera preocupação com a qualidade desses produtos, pois muitos dos eventos adversos de medicamentos à base de plantas podem ser atribuídos à má qualidade de matérias-primas ou produtos acabados. Dentre os fatores que ocasionam esses problemas têm-se os externos: a adulteração, identificação incorreta e contaminação do material vegetal, com metais tóxicos, agrotóxicos e microorganismos; e fatores internos, como a complexidade e não-uniformidade da matriz biológica vegetal. Os fatores externos podem ser controlados. Através da utilização de métodos analíticos o fator qualidade da matriz biológica tornou-se solucionável. Esses parâmetros refletem na qualidade total do produto, com a garantia de qualidade da matéria-prima vegetal até o produto acabado (ZHANG et al., 2012)..

(22) 21. No Brasil as exigências para garantia de qualidade do medicamento fitoterápico estão fixadas na Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) nº 14 de 31 de março de 2010, a qual define que a padronização do extrato utilizado na produção do medicamento fitoterápico é uns dos requisitos requeridos no processo de registro, para validar o método é necessário que a espécie vegetal tenha um marcador químico, que é definido como um composto ou classe de compostos químicos presentes na matéria prima vegetal, preferencialmente tendo correlação com o efeito terapêutico, que é utilizado como referência no controle da qualidade da matéria-prima vegetal e do medicamento fitoterápico (BRASIL, 2010). Atualmente, a cromatografia tem sido o método mais utilizado para padronização de extratos, pois oferece adequada capacidade de separação de extratos, especialmente quando combinada com métodos espectroscópicos, o que tornou-se uma prática recente. Os instrumentos acoplados melhoraram o desempenho em termos de diminuição na instrumentação, eficiência na separação, correção de desvio nos tempos de retenção, seletividade e precisão (GAD. et. al.,. 2013).. Estes. parâmetros. cromatográficos. garantem. a. conformidade de extratos e produtos acabados, o que influencia na segurança e eficácia do medicamento fitoterápico. O nosso país possui um grande potencial de bioprospecção, devido à enorme biodiversidade. da flora. brasileira. e. apesar das dificuldades. encontradas no desenvolvimento de fitoterápicos o governo tem investido nesse setor com a implantação do Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, que visa garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos, promovendo o uso sustentável da biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria (BRASIL, 2013). 1.2 A família Rubiaceae Juss. Rubiaceae apresenta-se como a quarta maior família das angiospermas, com distribuição de 650 gêneros e 13.000 espécies em todo mundo (DELPRETE, 1999; MOBOT, 2011). Encontra-se distribuída em sua maioria nas regiões mais quentes, principalmente dos trópicos. A América do Sul.

(23) 22. comporta o maior número de espécies dessa família no planeta, englobando 30% do total, muitas endêmicas no Brasil, onde atualmente ocorrem cerca de 124 gêneros e 1.396 espécies, correspondendo a uma das principais famílias da flora brasileira, distribuídas por diversas formações vegetacionais (BOLZANI et al., 2001; CHIQUIERI et al., 2004, FLORA DO BRASIL, 2013). Essas espécies são empregadas com finalidades ornamentais, complemento alimentar, na medicina popular e em pesquisas de desenvolvimento de medicamentos fitoterápicos (ERBANO; DUARTE, 2010). Conforme a classificação botânica essa família encontra-se dividida em quatro subfamílias: Ixoroideae, Cinchonoideae, Antirheoideae e Rubioideae, na qual cada subfamília apresenta um perfil fitoquímico típico, que são marcadores. quimiotaxonômicos,. para. iridoides. (Ixoroideae),. alcalóides. indólicos (Cinchonoideae) e antraquinonas (Rubioideae) (BOLZANI et al., 2001). A. família. Rubiaceae. apresenta. várias. espécies. de. interesse. farmacológico e econômico como, por exemplo, a espécie Coffea arabica L., utilizada como uma das bebidas mais famosas em todo mundo, o “café”, essa espécie é utilizada também para extração da cafeína, a qual é bastante empregada em formulações farmacêuticas (Andreeva et al., 2012). Outra espécie importante, Cephaelis ipecacuanha Rich., conhecida como “ipeca” e “ipecacuanha”, possui grande uso na medicina popular, suas raízes contêm o alcaloide emetina, que apresenta efeitos anti-helmíntico e expectorante (MORS et al., 1995). A espécie Psychotria viridis Ruiz et Pavón, conhecida popularmente como “chacrona” tem sua importância por ser usada em cerimônias e rituais religiosos, em conjunto com o cipó de Banisteriopsis caapi (Spruce) Morton (“caapi”), uma Malpighiaceae, na elaboração de uma bebida com propriedades alucinógenas, a “ayahuasca”, que significa “vinho das almas”. A mistura é utilizada em várias regiões da floresta Amazônica pelas comunidades do “Santo Daime” e “União do Vegetal” (CALLAWAY et al., 1996; GROB et al., 1996). Ainda, a espécie Uncaria tomentosa (Willd) DC., conhecida popularmente como “unha-de-gato”, possui várias propriedades medicinais tradicionalmente descritas, as quais já foram validadas por diversos estudos experimentais (LEMAIRE et al., 1999; PERAZZO, 2004; GONÇALVES et al., 2005)..

(24) 23. No ano de 1977, mais de 50 produtos à base desta planta foram introduzidos no mercado farmacêutico nos Estados Unidos, com diversas indicações farmacológicas, dentre as principais a imunoestimulante e antiinflamatória (PERAZZO, 2004; GONÇALVES et al., 2005). 1.3 O gênero Genipa L. O gênero Genipa L. apresenta-se distribuído em G. americana L. e G. infundibuliformis Zappi & Semir, a primeira espécie possui ampla distribuição, porém a segunda espécie é encontrada apenas no Brasil centro-meridional. Esse gênero apresenta uso diversificado, o fruto é comestível e utilizado na produção de sucos, geleias e licores. Tribos indígenas da América do Sul utilizam o fruto verde no tingimento de tecidos, redes, objetos de madeira e pele de humanos. A madeira é empregada na fabricação de móveis e a casca, rica em taninos, é usada em curtumes no tratamento de couro. O uso medicinal é amplo, dentre esses, as principais indicações são como diurética, antifebril, para o tratamento de feridas externas e faringites (ERBANO, 2010; FLORA DO BRASIL, 2013). 1.4 A Espécie Genipa americana L. A espécie Genipa americana L. é popularmente conhecida como “jenipapo” ou “jenipapeiro”, e apresenta-se como uma árvore de copa estreita, de 8 a 14 m de altura, com tronco liso de 40 a 60 cm de diâmetro, nativa de várzeas úmidas ou encharcadas em todo território brasileiro. As folhas são simples, subcoriáceas e glabras de 15-35 cm de comprimento. As flores são grandes, inicialmente brancas. Os frutos são bagas globosas tomentosas, de 8 a 10 cm de diâmetro, com polpa adocicada e sementes achatadas de cor creme (LORENZI, 2008) (Figura 1). 1.5 Etnofarmacologia Segundo Lorenzi (2008), G. americana fornece madeira de boa qualidade para construção civil, confecção de móveis e peças artesanais. Conforme Hansen et al. (2008) dentre as inúmeras espécies frutíferas utilizadas. pela. população. nordestina,. destaca-se. o. “jenipapeiro”. (G.. americana), cuja comercialização como fruta fresca tem-se mostrado.

(25) 24. promissora nas feiras livres, nos mercados atacadistas e supermercados. A industrialização, sob as mais diferentes formas, tem estimulado bastante o crescimento. da. demanda. dos frutos pelo. mercado. nordestino,. com. possibilidade de expansão para outras regiões brasileiras ou mercado internacional. Os frutos quando ainda verdes fornecem um suco de cor inicialmente azulada, e posteriormente, preta, muito consumido e utilizado pelos indígenas como corante do corpo. Quando maduros sua polpa é consumida in natura ou transformada em doces, geléias e licor, seu suco fermentado também é usado para fabricação de vinho e licor (LORENZI, 2008). Figura 1 – Genipa americana (Fonte: TROPICOS, 2011).. Todas as partes desta planta são empregadas na medicina popular em todas as regiões do país. O chá das raízes é considerado purgativo e antigonorréico. A casca do tronco é catártica e antidiarréica e também empregada externamente como emplastro contra úlceras, dores de várias origens, torção injúria, luxação, hematomas e nos casos de faringite. As folhas na forma de decocto são indicadas contra diarréia e sífilis, a poupa dos frutos verdes também é utilizada contra sífilis e para tratamento de ruptura de umbigo em recém-nascidos. Os frutos maduros são aromáticos, diuréticos e estomáquicos, indicados contra anemia, icterícia, asma, hidropsia, e problemas do fígado e baço, com base no conhecimento tradicional (DE ALBUQUERQUE, 2007; AGRA et al., 2008; LORENZI, 2008.; ERBANO; DUARTE, 2010; BREITBACH, 2013). O suco do fruto e o decocto da raiz e da casca possui.

(26) 25. efeito adaptógeno tônico, fortificante e afrodisíaco (MENDES;CARLINI, 2007). Em uma pesquisa realizada entre 43 ervanatários do município de Campina Grande-PB constatou-se que G. americana foi citada por 69,8% deles, como planta comercializada e indicada para uso medicinal. O estudo não mostrou quais as indicações estas pessoas fazem no comércio (DANTAS & GUIMARÃES, 2007). 1.6 Constituição química A espécie Genipa americana L. é quimicamente caracterizada pela presença de iridoides (LORENZI, 2008). O primeiro composto isolado dos frutos dessa espécie no Brasil foi a genipina (1) em 1960 (DJERASSI, 1960), a partir de frutos frescos, com os quais foi feito um extrato etanólico e o isolamento se deu por métodos cromatográficos. Em uma amostra de G. americana coletada em Porto Rico foram encontrados mais dois compostos da mesma classe, os ácidos genípico (2) e genipínico (3), oriundos de extratos de frutos frescos (TALLENT, 1964). Guarnaccia et al. (1972), a partir das folhas de G. americana, coletada no Panamá, isolaram um iridoide glicosilado, o ácido geniposídico (4), por meio do extrato metanólico das folhas, esse foi o único iridoide isolado nessa parte da planta até o momento. Posteriormente, Ueda e Iwahashi (1991), obtiveram a partir do extrato metanólico das frutas frescas de G. americana, um iridoide glicosilado inédito, o geniposídeo (5) e por meio de formação de calos e culturas de células suspensas obtiveram o tarenosídeo (6), o gardenosídeo (7) e o ácido geniposídico (4). Conforme Yang et al. (1999), foi isolado o primeiro alcaloide listado para espécie: criptolepina. Em frutos de jenipapo coletados no Brasil, a partir da fração volátil foi detectado alto teor de ácidos carboxílicos (butírico, 2metilbutírico e hexanóico), os quais são os compostos majoritários desta fração, e 2- e 3-butanoato de metila, são as substâncias que aparentam estar relacionadas ao odor forte e primário do jenipapo (BORGES; REZENDE, 2000). Em 2003 foi isolado o triterpeno genipatriol, por Hossain et al., a partir do extrato metanólico das folhas. A partir de frutos, folhas e calos de G. americana L. coletada no Peru, Ono et al. (2005) isolaram mais quatro iridoides glicosilados inéditos denominados genamesídeos A-D (8, 9, 10 e 11), juntamente com outros quatro.

(27) 26. já conhecidos: ácido geniposídico (4), geniposídeo (5), gardenosídeo (7) e genipina-gentiobiosideo (12). Em 2007, os mesmos pesquisadores isolaram a partir dos frutos da mesma espécie: genipacetal (13), genipaol (14), genipamida, gardeniol (15), éster metílico do ácido desacetilasperulosídico (16) e shanzhisídeo (17) (ONO et al.,2007). Estudos foram realizados com a polpa com a finalidade de descobrir os componentes responsáveis pelo aroma característico dos frutos da espécie. Pino et al. (2005) demonstrou, por análises de Cromatografia GasosaEspectrômetria de Massas (CG-EM), a presença de 91 compostos voláteis presentes na polpa, 81 inéditos para espécie, as classes mais representativas foram: ácidos carboxílicos (69,6%), terpenos (10,1%), aldeídos e cetonas (1%) e os maiores constituintes foram ácido hexanóico (9.35 mg/kg), ácido octadenoóico (1.34 mg/kg), ácido tetra decanóico (1.16 mg/kg), linalol (0.91 mg/kg) e limoneno (0.62 mg/kg). Pinto et al. (2006) analisou um extrato aquoso da polpa e observou a presença de 52 constituintes voláteis, 32 inéditos para espécie, dentre esses a maioria eram álcoois (24,4%, 28,2%), ésteres (21,9%, 12,8%), ácidos (17,1%, 20,5%) e compostos aromáticos (9,7%, 23,1%), na porção superior do extrato e na porção aquosa do extrato, respectivamente. Foram identificados e quantificados por cromatografia gasosa acoplada ao detector por ionização de chama, a presença de campesterol (1 mg, 0 mg), sigmasterol (8 mg, 74 mg), β-sitosterol (150 mg, 123 mg), Δ5-avanasterol conjuntamente com Δ7-sigmasterol (21 mg, 33 mg) e Δ7-avanasterol (4 mg, 3 mg), para cada 100 g de polpa e semente, respectivamente (DA COSTA et al., 2010). Outro estudo com os frutos determinou o teor de umidade (93,12%), proteínas (0,21%), lipídios (0,34%), fibras (1,15%) carboidratos (4,43%), dentre esses, açúcares (3,89%). Foram quantificados em 100 g de frutos os seguintes componentes: 0,59 mg de fósforo, 92,5 mg de potássio, 13,23 mg de cálcio, 8,17 mg de magnésio e 0,22 mg de ferro, ácido ascórbico (27 mg), compostos fenólicos (47 mg),. β-caroteno (0,93 mg) e licopeno (0,63 mg) (DE SOUZA et. al., 2012a). A Figura 2 demonstra os iridoides isolados de G. americana e no Quadro 01 estão apresentados de forma sumarizada os compostos já descritos para a espécie..

(28) 27. Quadro 1 – Substâncias isoladas de G. americana. Compostos. Farmacógeno. Autor. Iridoides Genipina. Frutos. Djerassi, 1960. Ácido genípico e ácido. Frutos. Tallent, 1964. Ácido geniposídico. Folhas. Guarnaccia et. al, 1972. Geniposídeo, tarenosídeo e. Frutos. Ueda e Iwahashi, 1991. Genamesídeo-A, genamesídeo-. Folhas, frutos e. Ono et al., 2005. B, genamesídeo-C e. calos. genipínico. gardenosídeo. genamesídeo-D Gardeniol, éster metílico do. Frutos. Ono et al., 2007. ácido desacetilasperulosídico e shanzhisídeo Flavonoides Quercetina. Polpa, pericarpo. Omena et al., 2012. e sementes Alcaloides Criptolepina. Não descrito. Yang et al., 1999. Ácidos carboxílicos Ácido butírico, metilbutírico e. Frutos. Borges e Rezende, 2000. hexanóico Monoterpenos Genipacetal, genipaol,. Frutos. Ono et al., 2007. genipamida Fitosteróis Campesterol, sigmasterol, βsitosterol, Δ5-avanasterol, Δ7sigmasterol e Δ7-avanasterol. Polpa e semente. Da Costa et al., 2010.

(29) 28. Figura 2 – Iridoides de G. americana..

(30) 29. Iridoides são compostos monoterpenoídicos constituído de oito a dez átomos de carbono. A estrutura química dessas substâncias é baseada no esqueleto ciclopentano-[C]-pirano (Figura 3). Sob o aspecto biogenético, os iridoides são biossintetizados a partir do cátion iridodial e diversificam-se em 27 vias. diferentes.. Iridoides. têm. sido. usados. como. marcadores. quimiotaxonômicos para Corniflorae, Gentianiflorae, Loasiflorae e Lamiiflorae. O número e a natureza dos iridoides encontrados no Reino Vegetal são indicativos da complexidade das vias envolvidas na sua biossíntese. Em quimiossistemática, os iridoides representam um marcador importante em classificação vegetal, filogenia e evolução (SAMPAIO-SANTOS & KAPLAN, 2001). Figura 3 – Núcleo Iridano CH3. O. H3C. Essas substâncias podem se apresentar como sólidos ou líquidos, com alto ponto de fusão, reagem facilmente com ácidos por hidrólise de ligação glicosídica, ocasionando a formação de coloração azul. Em CCD apresentamse com coloração azul a cinza em câmara de UV 365nm e marrom, vermelho, violeta,. azul. ou. cinza. ao. serem. revelados. com. vanilina. sulfúrica. (WAKSMUNDZKA-HAJNOS et al., 2008). Esses compostos tiveram importância devido à presença do primeiro iridoide originado do veneno de formigas, contribuindo para defesa desses animais,. como. também. por. serem. precursores. de. alcaloides. indolmonoterpênicos e alguns alcaloides isoquinolínicos. Os iridoides possuem diversas atividades farmacológicas comprovadas por estudos científicos, dentre elas. hipotensora,. espasmolítica,. antiarrítimica,. hepatoprotetora,. hipoglicemiante, hipolipemiante, antitumoral, antiviral, imunomoduladora, antiinflamatória, entre outras. Em geral as agliconas apresentam atividade mais pronunciada que as formas glicosídicas, o que permite afirmar que a atividade.

(31) 30. biológica. está. diretamente. relacionada. com. as. agliconas. liberadas. (GHISALBERTI, 1998). Outra classe relevante no estudo são os flavonoides, os quais são os compostos fenólicos mais importantes e diversificados de origem natural, constitui em uma classe largamente distribuída no reino vegetal, presente em frutos, vegetais, sementes, folhas, flores, talos, raízes, em produtos originados de vegetais, como chás e vinhos (HEIM et al, 2001). Essa classe metabólica deriva dos fenilpropanoides e possui esqueleto estrutural básico C6-C3-C6, constituído por dois anéis aromáticos (A e B) e um anel heterocíclico (C) (Figura 4) (GHASEMZADEH & NEDA GHASEMZADEH, 2011).. Figura 4 – Núcleo fundamental dos flavonoides. 3' 4'. 2' 8 7 6. 9. A 5 10. O 2. B 5' 6'. C O. 1'. 3 4. Os flavonoides podem ser: flavonas, flavonóis, flavononas, flavan3-ols, isoflavonas e antocianidinas. Os flavonoides podem apresentar-se na forma de aglicona ou heterosídica, através de ligação O- ou C- heterosídica, com diversos tipos de açúcares (GHASEMZADEH & NEDA GHASEMZADEH, 2011). A análise espectroscópica de Utravioleta (UV) é bastante útil na identificação de flavonoides, pois o sistema de π-elétrons é um dos absorvedores de radiação UV mais eficazes (COCKELL; KNOWLAND, 1999). Este tipo de análise apresenta duas bandas de absorção máximas, a banda II, encontra-se entre 240 e 285 nm, correspondendo à absorção do anel A. A banda I localiza-se na região de 300 e 400 nm, correspondente ao grupo cinamoil, ou seja, relacionada aos anéis B e C. O tipo de flavonoide, as oxigenações presentes na estrutura alteram a posição e intensidade dos máximos de absorção. Substituintes com grupo hidroxila não-dissociados,.

(32) 31. metoxi e metil geralmente efetuam apenas pequenas alterações na posição da absorção máxima, contudo geralmente um aumento da oxigenação promove deslocamento das bandas para maiores comprimentos de onda (MABRY; MARKHAM; THOMAS,1970). Os estudos químicos realizados até o momento promoveram apenas identificação de substâncias na espécie, em sua maioria, alguns estudos com substâncias voláteis houve quantificação. Porém, até o momento não existem marcadores químicos para nenhuma das partes da planta, a qual devido ao largo uso tradicional poderá ser utilizada no futuro para produção de medicamento fitoterápico. 1.7 Dados Farmacológicos Os ácidos genípicos e genipínico isolados dos frutos frescos de Genipa americana L. inibiram o crescimento in vitro de algumas bactérias grampositivas e gram-negativas, do fungo Trichophyton menthagrofites, da alga Chlorella vulgares, e do protozoário Tetrahymena gelleii (TALENT, 1964). No entanto, o extrato metanólico das folhas de G. americana L. não exibiu atividade antimicrobiana, pelo método de difusão em disco cepas de Escherichia coli e Staphylococcus aureus (MELÉNDEZ & CAPRILES, 2006). A partir do óleo essencial de G. americana constatou-se a presença de atividade antioxidante, como também de uma atividade extremamente forte contra todos os microrganismos testados no estudo de Barbosa (2008), possuindo um espectro. de. ação. amplo,. inclusive. sobre. amostras. bacterianas. reconhecidamente resistentes mesmo a antibióticos sintéticos, como é o caso de Staphylococcus aureus MRSA (resistente à meticilina), Eenterococcus faecium VRE (resistente à vancomicina), Klebsiella pneumoniae e Pseudomona aeruginosa. Outro estudo realizado por Ueda e Iwahashi (1991) testaram geniposídeo, tarenosídeo, gardenosídeo e o ácido geniposídico, isolados de G. americana L., os quais apresentaram atividade anticancerígena, com tumor induzido em linhagem celular Ragi por vírus Epstein-Bar. O composto genipina tem sido muito estudado nos últimos anos devido à suas propriedades farmacológicas: antiangiogênica, antiinflamatória e antioxidante, como também devido ao seu poder corante, este composto é encontrando também em.

(33) 32. Gardenia jaminoides Ellis (ALMOG et al., 2004; KOO et al., 2004; BYUNGCHUL et al.,2005). Um trabalho realizado por Hsua et al. (1997) comparou a atividade antitumoral. do ácido. intraperitoneal (i.p.). geniposídico e geniposídeo, com administração. de 100, 200 e 500 mg/Kg em ratos na presença e. ausência de radiação de raios-x, verificou-se que o ácido geniposídico mostrou uma maior inibição do crescimento tumoral que o geniposídeo, e que utilização da radiação concomitantemente com as duas substâncias aumentou resposta ao tratamento, significativamente. A partir de genipina e geniposídeo, foi investigada a proteção neurocitogênica, evitando a toxicidade de proteína β-amiloide da Doença de Alzheimer em cultura de neurônios do hipocampo, observações morfológicas mostraram a proteção dos neurônios por genipina. Enquanto, o genoposídeo demonstrou menor atividade (YAMAZAKI et al., 2001). Estudos que buscam inibidores da tirosinase vêm sendo realizadas para tentar descobrir novos antagonistas, como também auxiliar nos mecanismos patológicos de melanomas malignos. Dentro desse contexto, foi verificado que um extrato hidro-propilenoglicólico das raízes de G. americana foi capaz de inibir, in vitro, em 23% a atividade da enzima tirosinase (BAURIN et al., 2001). Em contraste, extratos etanólicos e hexânicos das folhas e dos frutos, e o hexânico das cascas de G. americana apresentaram fraca atividade inibitória da tirosinase in vitro (SOUZA et al., 2012). Um estudo com genipina e geniposídeo, demostrou a presença de atividade anti-inflamatória em edema de pata induzido por carragenina em ratos. No entanto, genipina possui maior atividade anti-inflamatória do que o geniposídeo, como demonstrados pelo edema de pata induzido por carragenina e o conteúdo de ON no exsudato (KOO et al., 2004). Um estudo in vitro sobre a atividade antiparasitária do extrato bruto hidroetanólico (70 Gl), com concentração de 0,0501 g/mL, da espécie em estudo foi e realizado e apontou que índice de inibição de desenvolvimento de ovos de trichostrongilídeos, na etapa de formação de larva, acima de 90% (FURTADO, 2006). A atividade antioxidante foi testada com extratos metanólicos dos frutos secos e moídos de G. americana obtidos por meio de maceração, soxhlet e.

(34) 33. ultrassom por Barbosa. Nesse estudo foi visto que esses extratos possuem atividade antioxidante semelhante ao padrão utilizado, Ginkgo biloba, com menor atividade para o extrato obtido por maceração (BARBOSA, 2008). Outro estudo analisou a capacidade antioxidante do extrato etanólico do pericarpo, polpa e sementes de G. americana L. avaliada por diferentes ensaios, dentre eles o método de captura de radicais livres 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH), 2,2’-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido-sulfônico) (ABTS), pelo método de redução dos íons de ferro (FRAP) e íons de ferro (CUPRAC), a capacidade antioxidante um em sistema biomimético de membranas, e em um sistema biológico constituído de fígado de rato homogeneizado, os quais confirmaram o poder antioxidante desses extratos in vitro. correlacionou. ainda,. as. atividades. antioxidantes. e. O estudo a. atividade. anticolinesterásica exibidas pelos extratos de G. americana que foi positiva para polpa apenas. A atividade citotóxica foi avaliada em células de córneas de ovelhas, a qual revelou que nenhum dos extratos levou a inibição da viabilidade celular em menos de 90% (Omena et al., 2012). A atividade inibitória sobre as enzimas α-amilase e α-glucosidase in vitro de G. americana foi avaliada com a utilização de extratos etanólicos e hexânicos das folhas e dos frutos, e hexânico da casca, o que confirmou uma alta inibição da enzima α-glucosidase em todos os extratos testados e uma fraca e inibição para enzima α-amilase apenas para o extrato etanólico das folhas, a identificação dos princípios ativos responsáveis poderão contribuir no controle do diabetes (DE SOUZA et al., 2012b). Extratos fenólicos dos frutos produzidos com acetona 80% foram avaliados com relação à atividade antiproliferativa, que por meio do ensaio ensaio de MTT [3(4,5- dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium], do ensaio de MUH (4-metilumbeliferilheptanoato) e azul de metileno, sugeriram que G. americana L. possui esta atividade in vitro (FINCO, 2013). 1.8. Técnicas. cromatográficas. na. análise. e. isolamento. de. compostos bioativos Juntamente com os métodos convencionais de extração, numerosos métodos inovadores foram estabelecidos, mas até agora nenhum método é considerado como padrão para a extração de compostos bioativos a partir de.

(35) 34. plantas. As eficiências de métodos de extração convencionais e nãoconvencionais dependem principalmente compreensão da natureza da matriz da planta e conhecimentos sobre química de compostos bioativos (AZMIR et al., 2013). Após a extração, os processos de cromatografia são iniciados a fim de se isolar substâncias, que poderão ser futuros marcadores químicos para espécie. Para um melhor entendimento do trabalho estão descritas a seguir as técnicas utilizadas no isolamento e análise de PN de G. americana no presente estudo: 1.8.1 Cromatografia em Camada Delgada (CCD) É uma técnica rápida, simples e de baixo custo, que pode ser aplicada a vários tipos de análises farmacêuticas, no monitoramento de um processo de reação, identificação de um composto em uma amostra, na detecção de impurezas de um composto, entre outras aplicações. Essa técnica pode ser utilizada de modo preliminar, anteriormente à análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Baseia-se na separação dos componentes de uma amostra através da migração diferencial sobre adsorvente numa superfície plana. Os fenômenos envolvidos podem ser adsorção, partição ou troca-iônica. Para desenvolvimento do cromatograma é necessário escolher uma Fase Móvel (FM), que em geral é selecionada conforme a polaridade da amostra e experiência do analista (POOLE, 1999; BELE & KHALE, 2010) A CCD com auxílio de reveladores gerais e específicos auxilia detecção de compostos ou classes de compostos. Amostras reveladas com vanilina sulfúrica que apresente coloração amarelo ou marrom podem tratar-se de flavonoides, cinza, roxo-escuro, vermelho ou marrom podem tratar-se de iridoides. O revelador difenilborato de aminoetanol, conhecido também por reagente Natural A, permite detecção de flavonoides ao serem expostos a luz ultravioleta (365 nm), pois esses compostos emitem fluorescência com coloração amarelo, laranja e verde por formarem um complexo derivado (WAGNER & BLADT, 2001). 1.8.2 Cromatografia Líquida à Vácuo (CLV) e Cromatografia em Coluna Clássica (CCC) A CCC com caráter preparativo, em geral, é feita com transferência de técnica CCD para CCC, para otimização da escolha de fase estacionária e fase.

(36) 35. móvel, assim a separação limitada por CCD é minimizada por fatores como comprimento da coluna e fluxo de fase móvel em CC (SCHILITT & GEISS, 1972). Os tipos de Fases Estacionárias (FE) mais utilizadas no isolamento de produtos naturais são gel de sílica, gel de exclusão molecular e fase reversa, dependendo do tipo de FE e FM podem estar envolvidos os princípios de separação por adsorção, partição, exclusão molecular, troca-iônica, entre outros, os quais podem estar combinados ou não (SCHILITT & GEISS, 1972; VAILAYA & HORVATH, 1998; HATANO et al., 2003). A CLV pode ser realizada para isolamento e purificação de amostras, possui boa resolução por poder ser utilizado uma FE com tamanho de partícula menor que os utilizados em CC, visto que é realizada com auxílio de um sistema de vácuo, que impulsiona a FM (COLL & BOWDEN, 1986). Apesar dos avanços em CCC, dependendo da complexidade da amostra, pode não ocorrer separação completa dos constituintes da amostra, principalmente quando a semelhança entre as moléculas é grande ou quando se tratam de isômeros e enantiômeros, assim se faz necessário o uso de técnicas mais refinadas a fim de se obter a separação. 1.8.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) A CLAE é uma das técnicas de análise mais populares, utilizada em todo o mundo ao longo dos últimos quarenta anos em laboratórios de ciências farmacêuticas, química clínica, síntese química, na área alimentícia e ambiental, entre outras (ZOTOU, 2011). A CLAE ganhou sua popularidade principalmente devido à sua confiabilidade e versatilidade. É uma técnica muito poderosa na separação de produtos naturais em matrizes complexas, como extratos, para a detecção e quantificação seletiva ou visualização do perfil cromatográfico. O método é muito comum e foi adaptado para a análise de uma larga variedade de produtos naturais, em geral não há necessidade de uma preparação complexa da amostra (WOLFENDER, 2009). Com o desenvolvimento das colunas com diferentes FE, especialmente a fase reversa, permitiu a separação de quase qualquer tipo de produto natural. As últimas inovações, como a introdução de FE estáveis a mudanças de pH e tamanho de partícula em torno de 2 μm melhoraram consideravelmente a performance da CLAE, em termos de resolução, velocidade e reprodutibilidade..

(37) 36. As separações são realizadas principalmente em cromatografia de fase reversa octadecilsilanica (C18) material com o sistema de solvente de ACN H2O ou MeOH - H2O em modo de gradiente de eluição. Dois tipos principais de detectores podem ser definidos: simples detectores utilizados para a análise do perfil cromatográfico ou fins de quantificação (UV, ELSD, ECD) e detectores de sistemas hifenados que geram dados multidimensionais, cromatográficos e espectroscópicos, para a identificação de substâncias (UV-DAD, MS, RMN) (WILSON & BRINKMAN, 2003; DAVID et al., 2007; WOLFENDER, 2009). A CLAE analítica é utilizada rotineiramente em fitoquímica para desenvolvimento de um método “piloto” para isolamento de produtos naturais em escala preparativa, com otimização das condições experimentais e verificação da separação dos componentes da amostra, como também para verificar a pureza final dos compostos isolados (MARSTON, 2007). Em CLAE preparativa (>20 bar) as colunas são maiores e há necessidade de vidraria para armazenamento das amostras. O objetivo é isolar ou purificar compostos, enquanto que no processo analítico o foco é obter informações sobre a amostra. Na CLAE analítica os parâmetros importantes são resolução, sensibilidade e tempo de análise rápido, enquanto que, na CLAE preparativa o parâmetro mais importante é o grau de pureza da substância isolada, a quantidade de composto que se pode conseguir em relação ao tempo (rendimento). No desenvolvimento de CLAE em escala preparativa, a transferência de método depende de parâmetros, tais como vazão do eluente e dimensões da coluna, a qual é frequentemente aumentada à custa da pureza (WELLINGS, 2006; MARSTON, 2007). Na cromatografia preparativa para isolamento de compostos puros podem envolver muitas técnicas. diferentes, como. CLAE. preparativa,. cromatografia líquida de média pressão, CCC, cromatografia em contracorrente, entre outros. A tarefa de obtenção de compostos isolados no mais curto espaço de tempo possível encontra-se na concepção de uma estratégia adequada de separação. O isolamento de produtos naturais, que anteriormente eram inconcebíveis, agora é possível por CLAE (HOSTETTMAN, 1998). 1.9 Ressonância Magnética Nuclear A espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é uma.

(38) 37. técnica muito importante para análise de produtos naturais. Nesta técnica um campo eletromagnético é aplicado ao átomo, em seguida o núcleo entra em movimento de precessão em baixa frequência, 60 MHz, por exemplo, assim é possível que absorva energia de baixa frequência e seja liberada e expressa na forma de sinais no espectro de RMN de hidrogênio ou carbono, entre outros núcleos (SILVERSTAIN, WEBSTER & KIEMLE, 2012). Rotineiramente técnicas de RMN monodimensionais (1D) e bidimensionais (2D) são utilizadas para análise de estruturas complexas. Há quase três décadas, para realização dessas análises era necessária um quantidade entre 20-50 mg de amostra, para identificar e caracterizar os produtos naturais. Atualmente esta análise é possível com menos de 1 mg de amostra. Isto ocorreu devido à modernização no equipamento de ressonância. Apesar de tantas adequações nessa técnica a sua sensibilidade é inferior à espectrometria de massas, com a qual é possível fazer a identificação de uma substância com quantidades bem inferiores (FUKUSHI, 2006; BRETON & REYNOLDS, 2013). 2.0 Atividade anti-inflamatória 2.0.1 O processo inflamatório A reação inflamatória é um processo caracterizado por uma cascata de reações celulares e vasculares, o qual ocorre como resposta a diversas injúrias: traumas no tecido, invasão de bactérias, vírus ou parasitos, presença de complexos imunes, entre outros. O objetivo deste mecanismo é o reparo tecidual ou a geração de novos tecidos (CUNHA et al., 2003; SCHMIDSCHÖBEIN, 2006). Estas respostas são iniciadas e reguladas por diferentes mediadores químicos endógenos liberados por diferentes tipos celulares, que são responsáveis pelos sinais clínicos da inflamação: dor, calor, rubor e tumor (HOFSETH, 2008). Para que ocorra a reação inflamatória, o organismo sintetiza e armazena os mediadores químicos endógenos, dentre esses: histamina, serotonina, leucotrienos, prostaglandinas, quimiocinas, fatores ativadores de plaquetas, bradicidinas e óxido nítrico (RYAN & MAJNO, 1997). Os neutrófilos são células que fagocitam o agente estranho, nessas células é encontrada a mieloperoxidase, que é uma enzima responsável pela atividade microbicida no interior dos fagossomas dos neutrófilos. Os monócitos.