Alguns estudos apontam a pigmentação do cabelo como um fator importante na taxa de incorporação de fármacos. A melanina é um polímero aniônico no pH fisiológico do cabelo (pH 5). Devido a essa característica, as drogas de caráter básico, como a cetamina, interagem fortemente com o pigmento, o que facilita a sua fixação no cabelo, o que explica por que as concentrações de CET são maiores em amostras autênticas na ordem: cabelo branco < castanho < preto (XIANG et al., 2006 apud HARUN et al., 2010).
Com o objetivo de mimetizar uma amostra autêntica, já que não se dispunha, neste trabalho, de grandes quantidades desse tipo de amostra, foi realizado um estudo de incorporação da cetamina em cabelo, ou seja, a produção de uma amostra onde o analito estivesse realmente incorporado, e não simplesmente adsorvido na superfície externa. Todos os procedimentos dos testes de incorporação foram realizados com uma determinada quantidade de um único cabelo, castanho escuro e que não havia passado por tratamento cosmético. O cabelo escolhido
CET e NCET
A
PI: CET-D4e NCET-D4 Tampão PO4-3 pH6 secoB
C
secoD
Tampão PO4-3 pH6 CET e NCET PI: CET-D4e NCET-D4 CET e NCET PI: CET-D4 e NCET-D4 CET e NCET PI: CET-D4e NCET-D4 CET e NCET PI: CET-D4e NCET-D4E
passou pelo pré-tratamento de lavagem e secagem já descrito no item 4.5.1, antes do estudo.
4.10.1 Procedimento de incorporação
A partir do medicamento Clortamina® na concentração de 50 mg mL-1 foram realizados quatro testes de incorporação. Os testes 1 e 2 foram feitos de acordo com metodologias sugeridas pela literatura citadas abaixo. Em todos os testes, o cabelo foi colocado em 200 mL de soluções distintas para cada teste em uma concentração final de 10 µg mL-1 de cetamina.
Teste 1: A metodologia sugerida por Welch e colaboradores (2003) foi testada. A um béquer de 250 mL contendo 100 mL de HCl 0,02 mol L-1 em DMSO, foram adicionados, aos poucos, 100 mL de água ultrapura em banho de gelo. Com a solução à temperatura ambiente, foram adicionados com seringa analítica, 40 µL do medicamento e a solução foi homogeneizada. Após o preparo da solução de incorporação, 3 g do cabelo íntegro foram totalmente mergulhados e ficaram de molho por até 16 dias, em temperatura ambiente resfriada não controlada (≈25°C). Durante esse período foram retiradas 4 porções para tratamento e avaliação. O teste, portanto, se dividiu nos tempos T1= 2 dias, T2= 6 dias, T3= 12 dias e T4= 16 dias.
Teste 2: A metodologia sugerida por Turfus e colaboradores (2013) foi testada. Com auxílio de proveta, 200 mL de MeOH foram colocados em um béquer de 250 mL e 40 µL do medicamento foram adicionados com seringa analítica e a solução foi homogeneizada. Após o preparo da solução de incorporação, 3 g do cabelo íntegro foram totalmente mergulhados e ficaram de molho por até 5 dias, em temperatura ambiente resfriada não controlada (≈25°C), sob agitação durante o dia e em repouso durante a noite. Durante esse período foram retiradas 2 porções para tratamento e avaliação. O teste, portanto, se dividiu nos tempos T1= 2 dias e T2= 5 dias.
O terceiro e quarto teste, descritos abaixo, foram propostos com base na hipótese do cabelo atuar como uma fibra de SPME na solução, capaz de adsorver a cetamina tanto por interação hidrofóbica quanto iônica, dependendo do pH da solução. Para tal, parâmetros importantes da SPME foram aplicados, como aumento
da força iônica, aquecimento da solução e agitação, para favorecer a transferência de massa. Na proposição das condições experimentais levou-se em consideração que, ao contrário da SPME, a substância precisa atravessar a cutícula ou essa precisa ser aberta, para que a incorporação aconteça. Os processos de transferência passiva através de membranas biológicas são lentos por natureza. Então dois intervalos de tempo foram propostos, 1 h e 24 h.
Teste 3: Este teste foi dividido em dois valores distintos de pH: Teste 3a, em pH 5 (pH fisiológico do cabelo) e teste 3b, em pH 7 (pH fisiológico do sangue), ambos feitos com 200 mL de tampão fosfato 1 mol L-1 saturados com NaCl. Cada tampão foi colocado em um béquer de 250 mL ao qual foram adicionados, com seringa analítica, 40 µL do medicamento. Após o preparo da solução de incorporação, 3 g do cabelo íntegro foram totalmente mergulhados e ficaram de molho por até 24 h, a 45 °C, sob agitação. Durante esse período foram retiradas 2 porções para tratamento e avaliação. O teste, portanto, se dividiu nos tempos T1= 1 h e T2= 24 h.
O processo de coloração artificial de cabelo utiliza produtos usualmente formulados com amônia, pelo fato da cutícula abrir-se em pH alcalino e o pigmento ser incorporado após 45 min (valor médio) em contato com o cabelo. Pensando nisso, um quarto teste (descrito abaixo) foi proposto para verificar se a abertura da cutícula favoreceria a incorporação mais rápida da cetamina na forma ionizada.
Teste 4: Este teste se dividiu em 2 partes; foi realizado um pré tratamento, com o objetivo de abrir a cutícula do cabelo. Em uma solução amoniacal pH≈10 (que consistiu em água destilada com 5 gotas de hidróxido de amônio P.A), 3 g do cabelo integro foram deixados de molho por 45 min e logo após, lavados rapidamente com água ultra-pura e colocados em uma solução de incorporação. Com auxílio de proveta, 200 mL de solução de tampão fosfato 1 mol L-1, saturada com NaCl, pH 5, foram colocados em um béquer de 250 mL e então foram adicionados, com seringa analítica, 40 µL do medicamento. O cabelo, que havia passado pela solução amoniacal, foi totalmente mergulhado na solução de incorporação e ficou de molho por 1 dia (24 h) sob agitação. Durante esse período foram retiradas 2 porções para tratamento e avaliação. O teste, portanto, se dividiu nos tempos T1= 1 h e T2= 24 h.
A Tabela 6 mostra esquematicamente os tempos em que foram avaliados os diferentes testes de incorporação.
Tabela 6 : Tempos de incorporação do cabelo nos diferentes testes.
Tempo TESTE 1 TESTE 2 TESTE 3a TESTE 3b TESTE 4 T0 Cabelo antes dos testes: igual para todos
T1 2 dias 2 dias 1hora 1hora 1hora
T2 6 dias 5 dias 1 dia 1 dia 1 dia
T3 12 dias - - - -
T4 16 dias - - - -
4.10.2 Lavagem pós-incorporação
Durante o processo de incorporação, uma quantidade muito maior fica adsorvida na superfície externa e precisa ser efetivamente removida. O procedimento padrão para verificar se não existe mais droga aderida à superfície externa do cabelo é a análise dos solventes de lavagem, após evaporação e obtenção do resíduo seco.
No presente estudo adotou-se o procedimento de verificação da contaminação externa com o teste que foi nomeado por teste de presença com metanol, explicitado a seguir:
Foi adicionado 1 mL de MeOH a um tubo falcon contendo a amostra previamente lavada e seca, e agitou-se por 30 s em vórtex; com o auxilio de uma pipeta Pasteur, o MeOH foi recolhido, colocado em um tubo de vidro e levado à secura em fluxo de nitrogênio a 40 °C. O conteúdo foi redissolvido com 20 µL MeOH e 80 µL de tampão NH4Ac 10 mmol L-1 pH 6,0 para injeção no CL-EM/EM.
Todos os cabelos, independente do processo utilizado para incorporação da cetamina, passaram pelos mesmos processos de lavagem. Um estudo de otimização do procedimento não chegou a ser realizado. A proposta no presente estudo foi, ao final de cada procedimento de limpeza, avaliar a amostra do cabelo através do teste de presença com MeOH. Quando o resultado da análise fosse <LD do método proposto, então o processo de limpeza seria aceito como suficiente.
Os cabelos, após serem retirados das soluções de incorporação, foram sacudidos manualmente de forma vigorosa para eliminar o excesso de solução e colocados em estufa a uma temperatura menor que 50 °C por 2 h, para secar.
Deu-se início, então, às várias etapas de lavagem, conforme detalhado na Tabela 7. Em cada etapa, a amostra foi completamente submersa em um determinado solvente ou solução aquosa (metanol, água, solução de SDS e acetona) dentro de um tubo falcon de 50 mL com tampa e agitada vigorosamente em vórtex por 2 min; a seguir, a amostra foi levada à estufa a uma temperatura de cerca de 50 °C por 1 h para secar. A partir do quarto processo de lavagem, o cabelo foi delicadamente seco com um papel absorvente, antes de ser colocado para secar, a fim de remover o máximo do solvente.
Ao final do primeiro processo, a amostra foi submetida ao procedimento de limpeza aplicado a amostras autênticas, conforme descrito, no item 4.5.1.
Tabela 7: Procedimentos das consecutivas etapas de lavagem.
Lavagem Procedimento
1ª
3 X água (vórtex 2 min) + 2X MeOH (vórtex 2 min) Seco estufa (1 h, 50 °C)
2X acetona (vórtex 2 min) + 2 X diclorometano (vórtex 2 min) Seco estufa (1 h, 50 °C)
Teste de presença com MeOH
2ª
3 X água (vórtex 2 min) + 2X MeOH (vórtex 2 min) Seco estufa (1 h, 50 °C)
Teste de presença com MeOH
3ª
6 X água (vórtex 2 min) + 4X MeOH (vórtex 2 min) Seco estufa (1 h, 50 °C)
Teste de presença com MeOH
4ª
2X MeOH (vórtex 2 min)
Seco (overnight a temperatura ambiente) Teste de presença com MeOH
5ª
3X SDS 0,01 % (vórtex 2 min) + água ( exaustiva) + 1X Acetona Seco estufa (1 h, 50 °C)
Teste de presença com MeOH
6ª
3X SDS 0,01 % (vórtex 2 min) + água ( exaustiva) + 1X Acetona Seco estufa (1 h, 50 °C)