A técnica de CL-EM/EM pode talvez ser considerada como a melhor escolha para a determinação quantitativa de drogas e seus metabólitos em matrizes biológicas, por ser altamente seletiva e assim eliminar a influência de interferentes, mesmo sem pré-tratamento da amostra. No entanto, há muito se observou que a presença de uma matriz gera interferências na detecção dos analitos, relacionadas a mudanças na eficiência de ionização na interface CL-EM (MATUSZEWSKI et al., 2003). Este fenômeno foi primeiramente descrito por Tang e Kebarle, 1991, que mostraram que a resposta de bases orgânicas em uma determinada matriz, utilizando a fonte de ionização electrospray, diminuiu à medida que a concentração de outras bases orgânicas foi aumentada (CASSIANO et al., 2009; GONZALES et al., 2014). A utilização de um padrão interno pode ajudar, corrigindo a supressão de ionização; ele é geralmente adicionado às amostras na sua fase de preparação e também às soluções de calibração. (KRUVE et al., 2015b).
A introdução de uma etapa de limpeza, como a SPE, ajuda a diminuir os efeitos de matriz e torna também o método mais sensível, pela possibilidade de pré- concentrar os analitos. Vários tipos de fase estacionária estão disponíveis comercialmente.
Apesar da fase C18 ser a mais conhecida e já ter sido empregada na determinação de CET em cabelo (LEONG et al., 2005), fases mistas (C18 ou C8/troca iônica ou polimérica/troca iônica) tem sido recentemente preferidas para analitos básicos (WU et al., 2008a; LENDOIRO et al., 2012; PARKIN et al., 2013). Todas as drogas básicas, por mais diversas quanto às suas estruturas, tem um grupo funcional amino- (NR3, NR2H, ou NRH2), e podem se ionizar pela adição de um próton (H+). No entanto, o processo de captação dos analitos básicos pelas fases mistas costuma se dar inicialmente por um mecanismo de sorção não-polar na parte hidrofóbica do sorbente. Após a retenção da droga, a lavagem do cartucho com água e solução aquosa ácida remove as interferências polares e garante que a droga esteja na forma protonada, fixada na parte iônica do sorbente. Drogas não polares e não-básicas são então removidas com uma lavagem orgânica e finalmente as drogas básicas podem ser eluídas com um solvente orgânico alcalino, que desfaz
as interações iônicas da droga com o sorbente pela neutralização da carga da droga. O solvente orgânico desfaz as interações hidrofóbicas que retiveram inicialmente a droga (AGILENT, 2015).
No procedimento aplicado neste trabalho, o extrato contendo os analitos básicos foi percolado com tampão fosfato a pH=6, no qual as bases já estão protonadas. Foi feita uma lavagem com ácido acético e outra com metanol (AGILENT, 2015). Seguiu-se a orientação do fabricante, também reportada por autores que trabalharam com esse tipo de fase estacionária, de secar bem a fase após a lavagem, para permitir que o solvente orgânico entre em contato com a parte hidrofóbica da fase. A eluição foi feita com acetato de etila:MeOH:hidróxido amônia (70:25:5 v/v), segundo protocolo de Dowling e colaboradores (2011), para drogas básicas.
Testes preliminares de avaliação da sorção dos analitos pelo cartucho Strata XC (item 4.7.2) foram feitos com soluções-padrão e mostraram que a massa de 60 mg de sorbente era suficiente para a retenção dos analitos, visto que as recuperações ficaram em torno de 95% para a CET e 105% para a NCET.
Para continuar o desenvolvimento do método, alguns testes preliminares foram realizados (item 4.9), com uma matriz composta por 4 tipos de cabelo e determinação por CL-EM e por CL-EM/EM.
A recuperação (RE) foi calculada de modo análogo ao de Fernández e colaboradores (2014), pela razão das áreas obtidas para os analitos adicionados antes e depois do processo de SPE. Para compensar oscilações instrumentais, os padrões internos deuterados foram adicionados, em ambos os casos, imediatamente antes da etapa de injeção no cromatógrafo (experimentos D/B, do item 4.9). O experimento foi feito em triplicata e resultou numa recuperação média de 101,8% e 94,5% para CET e NCET, respectivamente, na determinação por CL-EM. Por CL- EM/EM, foram encontradas recuperações de 97,9% e 92,7%, respectivamente para a CET e NCET.
O efeito matriz foi avaliado pelo método de adição após a extração (TAYLOR, 2005), por meio da razão entre a resposta do analito na amostra pós-extração (experimento E, item 4.9) e na solução de eluição pura (experimento C, item 4.9). Essa razão de respostas pode ser feita entre áreas absolutas (FM) (MATUSZEWSKI et al., 2003; FERNÁNDEZ et al., 2014) ou entre razões de áreas analito I analito ou
análogo deuterado (fator de matriz normalizado, FMnorm) nos dois meios (ANVISA, 2012; EMA, 2011). Por CL-EM, foram observados fatores de matriz normalizados ligeiramente positivos, de 119,7% e 100,2% para CET e NCET, respectivamente.
Por CL-EM/EM, os fatores de matriz normalizados foram ainda mais próximos de 100% (ausência de efeito de matriz): 98,7% e 105,5% para CET e NCET, respectivamente. Quando é observado o efeito matriz pelas áreas absolutas (FM) a relação ficou oposta (supressão de sinal) por CL-EM 80,2%; 95,8% e 80,1% para NCET, CET e NCETD4 respectivamente e por o CL-EM/EM 72,8%, 68,9%, 87,7%, 88,7% para NCET, NCETD4, CET e CETD4. Na validação analítica o efeito matriz será avaliado pelo fator de matriz normalizado conforme preconizado pela ANVISA e EMA.
O efeito acumulado (matriz + secagem), definido pela razão entre os experimentos B e C (EM2), foi de 86,1% e 76,1% para CET e NCET, por CL-EM e de 80% e 70% para CET e NCET por CL-EM/EM.
A eficiência da secagem (ES) foi de 72% e 76 % para CET e NCET por CL-EM e de 81% e 66% para CET e NCET por CL-EM/EM.
Tabela 12: Ensaio exploratório SPE/CL-EM.
A. Limpeza por SPE usando PI surrogate: refere-se à extração onde os padrões de CET, NCET e PIs participam do processo de eluição pelo SPE, portanto, padrões colocados antes do SPE e PI Surrogate; B. Branco de matriz com PI real: branco de amostra fortificado com padrões de CET e NCET e, após seco, fortificado com PIs, portanto, padrões colocados depois do SPE e PIs reais,; C. Solução-padrão injetada no cromatógrafo: padrões de CET, NCET e PIs puros, ou seja, sem a participação dos processos de SPE ou secagem; D. Limpeza por SPE usando PI real: padrões de CET, NCET participam do processo de eluição pelo SPE e os PIs colocados após o eluato ser seco, portanto padrões colocados antes do SPE e PIs real; E. Branco de matriz com PI surrogate: branco de amostra fortificado com padrões de CET e NCET e PIs juntos.
A B C D E
(AP/API)A (AP/API)B (AP/API)c (AP/API)D (AP/API)E
NCET CET NCET CET NCET CET NCET CET NCET CET
0,97 1,66 0,76 1,13 0,99 1,31 0,71 1,15 1,00 1,57 CV= 0,9% CV= 1,9% CV= 9,3% CV= 8,2% CV= 1,3% CV= 3,2% CV= 7,3% CV= 7,0% CV= 3,4% CV= 4,8%
EM2 (%) = B/C x100 Respe1(%) = D/Bx100 ESec (%) = B/E x100 FMnorm(%) = E/C x100
NCET CET NCET CET NCET CET NCET CET
Tabela 13: Ensaio exploratório SPE/CL-EM/EM
A. Limpeza por SPE usando PI surrogate: padrões de CET, NCET e PIs participam do processo de eluição pelo SPE, portanto, padrões colocados antes do SPE e PI Surrogate; B. Branco de matriz com PI real: branco de amostra fortificado com padrões de CET e NCET e, após seco, fortificado com PIs, portanto, padrões colocados depois do SPE e PIs reais,; C. Solução-padrão injetada no cromatógrafo: padrões de CET, NCET e PIs puros, ou seja, sem a participação dos processos de SPE ou secagem; D. Limpeza por SPE usando PI real: padrões de CET, NCET participam do processo de eluição pelo SPE e PIs colocados após o eluato ser seco, portanto padrões colocados antes do SPE e PIs real; E. Branco de matriz com PI surrogate: branco de amostra fortificado com padrões de CET e NCET e PIs juntos.
A B C D E
(AP/API)A (AP/API)B (AP/API)c (AP/API)D (AP/API)E
NCET CET NCET CET NCET CET NCET CET NCET CET
0,95 1,11 0,70 0,87 1,00 1,09 0,65 0,86 1,05 1,08 CV= 6,6% CV=