Estudos dos níveis de expressão dos genes pfcrt e pfmdr1 Esta fase do trabalho teve como objectivos estudar o perfil de expressão dos genes pfcrt

e pfmdr1 ao longo do ciclo intra-eritrocitário de P. falciparum. Identificar eventuais diferenças ao nível da expressão basal daqueles genes na fase de trofozoíto maduro, comparando parasitas resistentes e sensíveis à cloroquina e à mefloquina. Sendo também objectivo verificar, posteriormente se a presença destes antimaláricos origina uma resposta específica na expressão dos referidos genes, nos mesmos parasitas. Será efectuada uma breve análise dos pontos que se consideram importantes para a compreensão dos resultados obtidos, mais concretamente a selecção dos isolados utilizados, a optimização das condições relativas à técnica de PCR em tempo real e a validação do método 2-∆∆Ct_{, utilizado no tratamento dos resultados:}

a) Selecção dos isolados de P. falciparum

Tal como descrito no capítulo relativo aos materiais e métodos, para a realização dos estudos de expressão dos genes pfcrt e pfmdr1, foram utilizados clones de referência de fenótipo conhecido (3D7 e Dd2), bem como isolados de P. falciparum, seleccionados de acordo com o seu perfil de sensibilidade aos fármacos em estudo, obtido pelos microtestes já descritos (secção II.2.5.2.). De um total de dez isolados, testados para o seu grau de susceptibilidade à cloroquina e mefloquina, seleccionaram-se dois: STP 595 e STP 611, para os estudos de expressão dos genes pfcrt e pfmdr1. Os dois isolados seleccionados eram originários da mesma região, RD STP e tinham sido colectados em 1993 e mantidos em nitrogénio líquido no banco de isolados do CMDT.

a.1) Determinação do IC50 dos isolados STP 595 e STP 611 (cloroquina e mefloquina) e clone Dd2 (mefloquina)

Para os dois isolados seleccionados foram determinados os valores dos IC’s 50 relativos à cloroquina e à mefloquina e o valor do IC50 da mefloquina no clone Dd2, correspondente à dosagem de cada um dos fármacos que destrói ou inibe o

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desenvolvimento de 50 % (IC50) do total de parasitas para os 2 isolados seleccionados, com repetições e resultados idênticos.

Os valores, representados nos gráficos das figuras III.29, III.30, III.31, III.32 e III.33, são resultantes da média de dois ensaios independentes, cujas contagens foram efectuadas por três leitores diferentes.

Figura III.29 – Gráfico dos resultados dos testes de susceptibilidade à cloroquina do isolado STP 595.

Figura III.30 – Gráfico dos resultados dos testes de susceptibilidade à cloroquina do isolado STP 611.

Sendo a resistência à cloroquina definida pelo IC50 ≥ 100 nM (Basco et al., 1994; 1995;

Gay et al., 1997), a determinação dos respectivos IC50 permitiu classificar estes isolados de acordo com a sua susceptibilidade à cloroquina:

STP 595 Sensível (IC50 = 70 nM) STP 611 Resistente (IC50 = 271 nM)

Equação da recta da regressão linear associada à curva de morte dos parasitas do isolado STP 595 na presença de cloroquina. y = - 0,5254x + 86,597 IC50 (STP 595) = 70 nM Leitor 1 Leitor 2 Leitor 3 Leitor 1 Leitor 2 Leitor 3

Equação da recta da regressão linear associada à curva de morte dos parasitas do isolado STP 611 na presença de cloroquina. y = - 0,1479x + 90,134 IC50 (STP 611) = 271 nM Leitor 1 Leitor 2 Leitor 3 Leitor 1 Leitor 2 Leitor 3

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Figura III.31 – Gráfico dos resultados dos testes de susceptibilidade à mefloquina do isolado STP 595.

Figura III.32 – Gráfico dos resultados dos testes de susceptibilidade à mefloquina do isolado STP 611.

0 20 40 60 80 100 0 100 200 300 400 500 600 700

Figura III.33 – Gráfico dos resultados dos testes de susceptibilidade à mefloquina do clone Dd2.

Equação da recta da regressão linear associada à curva de morte dos parasitas do isolado STP 595 na presença de mefloquina. y = - 1,1613x + 84,22 IC50 (STP 595) = 30 nM Leitor 1 Leitor 2 Leitor 3 Leitor 1 Leitor 2 Leitor 3

Equação da recta da regressão linear associada à curva de morte dos parasitas do isolado STP 611 na presença de mefloquina. y = - 0,3093x + 87,691 IC50 (STP 611) = 121 nM Leitor 1 Leitor 2 Leitor 3 Leitor 1 Leitor 2 Leitor 3

Equação da recta da regressão linear associada à curva de morte dos parasitas do clone Dd2 na presença de mefloquina. y = -0,2793x + 82,829 IC50 (Dd2) ≅ 118 nM Leitor 1 Leitor 2 Leitor 3 Leitor 1 Leitor 2 Leitor 3

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Sendo os valores do cut off da resistência à mefloquina discrepantes (Basco et al., 1995; Gay et al., 1997), e considerando que o clone 3D7 é sensível à mefloquina e apresenta um IC50 de 43 nM, neste estudo considerou-se como o limiar entre sensibilidade e resistência a esta quinoleína 50 nM, sendo este um valor arbitrário, ligeiramente superior ao IC50 do referido clone. Assim e através da determinação dos respectivos IC50, foi possível a classificação destes isolados de acordo com a sua susceptibilidade a este antimalárico:

STP 595 Sensível (IC50 = 30 nM) STP 611 Resistente (IC50 = 121 nM) Dd2 Resistente (IC50 = 118 nM)

Para além dos acima citados ensaios de susceptibilidade, realizados aos isolados STP 595, STP 611 e Dd2 (MQ), foram também efectuados aos clones de referência (3D7 – CQ, MQ e Dd2 CQ). Os resultados foram repetidamente consistentes e encontram-se de acordo com os valores prévios reportados por outros autores (Duraisingh et al., 2000; Wellems et al., 1990). Na tabela III.20. apresentam-se os valores de IC50 e polimorfismos para cada um dos fármacos e populações parasitárias estudadas.

Tabela III.20. – Caracterização fenotipica e genotipica dos parasitas utilizados nos estudos de expressão; R – resistentes; S – sensível; IC50 em nM; * valores publicados (Duraisingh et al., 2000; Wellems et al., 1990) Pfmdr1 Proveniência geográfica IC50 CQ IC50 MQ CQ R/S MEF R/S Pfcrt 76 _{86 1042 1246} 3D7 ? 16* 43* S S K N N D C lo ne Dd2 SEAsiático 200* 118 R R T Y N D 595 RDSTP 70 30 S S T N N D Is ol ad o 611 RDSTP 271 121 R R T N N D

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b) Optimização das condições de PCR em tempo real

A técnica de PCR em tempo real foi seleccionada como a metodologia a utilizar nos estudos de expressão.

O estudo da especificidade da reacção de PCR efectuado, quer pelo protocolo de dissociação, quer pela visualização em gel de agarose, demonstrou que todas as reacções apresentavam uma elevada especificidade.

Pela observação dos valores do desvio padrão (DP) obtidos nos ensaios de quantificação relativa, realizada por PCR em tempo real, verificou-se que os valores de DP não ultrapassam o referido valor limite. Este facto significa que as repetições apresentam uma elevada reprodutibilidade entre elas, sendo determinante para a viabilidade dos ensaios, condicionando a inclusão dos mesmos neste estudo, assim, aqueles cujo desvio padrão obtido era superior a 0,38 não foram considerados.

A reprodutibilidade inter-ensaio, avaliada pela realização de uma nova reacção de PCR efectuada a várias amostras do estudo, seleccionadas aleatoriamente, é bastante elevada. Como se pode observar pela análise dos valores das eficiências das reacções, e partindo do pressuposto de que valores de eficiências iguais a 2 correspondem a reacções com eficiência máxima, conclui-se que todas as reacções são extremamente eficientes (tabela III.21, III.22 e figura III.34).

Tabela III.21 – Média dos Cts (triplicados) e respectivos desvios padrão (DP) nas reacções de amplificação dos genes pfcrt, pfmdr1 e pfβactinaI

pfcrt pfmdr1 pfββββactinaI

Conc. cDNA

Média Ct DP Média Ct DP Média Ct DP

1 24,6 0,10 18,2 0,03 17,7 0,17

0,1 28,1 0,17 21,6 0,11 20,4 0,10

0,01 31,7 0,24 24,7 0,28 26,7 0,09

0,001 33,4 0,35 28,4 0,23 27,1 0,38

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Figura III.34 – Representação gráfica dos valores Ct em função do log da concentração de DNA obtidos por PCR em tempo real, bem como a representação da regressão linear que lhes está associada.

Tabela III.22. – Eficiências das reacções de amplificação dos genes alvo (pfcrt e pfmdr1) e do gene de referência (pfβ actinaI)

Gene Declive (m) Eficiência reacção

pfcrt -3,0025 2.1

pfmdr1 -3,32 2.0

pfββββ actina I -3,01 2.1

Na tabela III.23 encontram-se os valores de Ct e desvios padrão obtidos nos ensaios realizados para avaliação das eficiências de reacção.

Tabela III.23 – Média dos Cts (triplicados) e respectivos desvios padrão (DP) nas reacções de amplificação dos genes pfcrt, pfmdr1 relativamente a pfβ actinaI

pfββββ actinaI pfcrt pfββββ actinaI pfmdr1 Conc. cDNA Ct DP Ct DP Ct DP Ct DP 1 21,9 0,35 24,6 0,10 17,7 0,17 18,2 0,03 0,1 24,7 0,26 28,1 0,17 20,4 0,10 21,6 0,11 0,01 28,4 0,27 31,7 0,24 26,7 0,09 24,7 0,28 0,001 30,3 0,06 33,4 0,35 27,1 0,38 28,4 0,23 0,0001 31,5 0,18 33,8 0,17

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Os resultados obtidos relativamente ao estudo da eficiência das reacções de amplificação dos genes pfcrt e pfmdr1, demonstraram que é possível utilizar o gene da pfβ-actinaI como calibrador endógeno, para normalizar os resultados da expressão dos referidos genes. Os declives das rectas de correlação obtidos foram de 0,10 e 0,05 do pfcrt e do pfmdr1, respectivamente (Tabela III.24), estes valores encontram-se dentro do intervalo requerido de 0,0 a 0,1

Tabela III.24. – Declives das regressões lineares associadas às reacções de amplificação dos genes alvo relativamente ao gene de referência.

Genes Declive (m)

pfcrt/pfβ actinaI 0,10

pfmdr1/ pfβ actinaI 0,05

Tendo-se efectuado a optimização das reacções e validado o método de tratamento dos resultados, efectuou-se o estudo da expressão dos 2 genes seleccionados, em três fases distintas, o perfil de expressão destes genes ao longo do ciclo intra-eritrocitário (3D7 e Dd2). Posteriormente, procedeu-se à avaliação dos níveis de expressão basal destes genes, em parasitas com fenótipos distintos (3D7, Dd2, STP 595 e STP 611), na fase de trofozoíto maduro. Por último, procedeu-se à avaliação dos níveis de expressão na presença de cloroquina e mefloquina, nos referidos parasitas de forma a avaliar uma indução da expressão destes genes, pela presença daqueles antimaláricos.

Todos os resultados obtidos por PCR em tempo real, bem como o seu tratamento através do método 2-∆∆Ct, encontram-se compilados em tabelas contendo:

a) Os valores de Ct de cada gene, correspondentes ao ciclo da reacção de PCR, no qual é detectado um aumento significativo da fluorescência emitida pelo SYBR Green. b) Os valores de DP (desvio padrão) apresentado entre cada medição, relacionados com a reprodutibilidade intra ensaio.

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d) O Nfold (número de vezes) que os genes alvo se expressam, relativamente ao nível

basal avaliado num controlo, com os respectivos intervalos de confiança.

Neste estudo apenas se considera um aumento de expressão significativo, quando Nfold

≥ 2, ou seja quando o nível de expressão duplica quando comparado com o controlo

interno de reacção. I

IIIII..22..11..AAVVAALLIIAAÇÇÃÃOODDOOSSNNÍÍVVEEIISSDDEEEEXXPPRREESSSSÃÃOOBBAASSAALLDDOOSSGGEENNEESSppffccrrttEEppffmmddrr11AAOO

L

LOONNGGOODDOOCCIICCLLOOIINNTTRRAA-_-EERRIITTRROOCCIITTÁÁRRIIOODDEEPP._.ffaallcciippaarruumm

III.2.1.1. Caracterização do material por microscopia óptica

A observação por microscopia óptica e contagem das parasitémias, dos esfregaços sanguíneos realizados no momento de cada colheita de material para extracção de RNA, permitiu determinar as percentagens de sincronização observadas ao longo de todo o ensaio. A sincronização manteve-se relativamente constante durante os períodos em que estes ensaios decorreram (95% de parasitas em sincronia em cultura in vitro).

Na figura III.35 encontra-se esquematizado o estadio de desenvolvimento em que se encontravam os parasitas no momento de cada colheita, bem como o número de colheitas efectuadas e os intervalos de tempo decorridos entre elas.

A observação dos esfregaços sanguíneos permitiu, assim, caracterizar o estadio de desenvolvimento do parasita no momento da colheita, de forma a poder posteriormente associá-lo a determinado nível de expressão dos genes em estudo.