5.1.1 Testes in vitro
Conforme mencionado na sessão de “Material e Métodos”, item 4.2.2, para avaliar o potencial antimicrobiano de óleos essenciais em chocolate, foram selecionados três óleos essenciais com efeito comprovado na literatura (FISHER; PHILLIPS, 2008; NGUEFACK et al., 2009; OUSSALAH et al., 2007; PEREIRA et al., 2004; ROTA et al., 2008). Adicionalmente uma blenda de óleo essencial de tomilho e capim limão foi avaliada a fim de verificar se os óleos possuíam efeito sinérgico.
Dentre os quatro óleos testados, o de tomilho e a blenda apresentaram maior efeito antimicrobiano contra as cepas Salmonella typhimurium ATCC 14028, Salmonella
enteritidis ATCC 13076, Escherichia coli ATCC 25922 e o isolado de Salmonella MB
89 (Tabela 3). Para as cepas isoladas Salmonella MB 87 e MB 88, todos os óleos essenciais, com exceção do óleo de tomilho, apresentaram valores de MIC e MBC maiores que 2,0 mg/mL.
Tabela 3. Atividade antimicrobiana (mg/mL) dos óleos essenciais de tomilho, laranja doce e blenda (capim-limão : tomilho) contra microrganismos de importância em chocolate amargo Salmonella typhimurium ATCC 14028 Salmonella enteritidis ATCC 13076 Salmonella MB 87 Salmonella MB 88 Salmonella MB 89 Escherichia coli ATCC 25922
MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC
Blenda 1 0,6 1,0 0,6 0,6 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 0,6 0,8 0,6 1,0 Óleo essencial de laranja >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 Óleo essencial de capim limão >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 0,9 >1,0 Óleo essencial de tomilho 0,3 0,35 0,3 0,3 0,6 1,0 0,7 0,7 0,3 >0,5 0,3 0,35
O óleo essencial de tomilho apresentou maior efeito antimicrobiano e se destacou por possuir uma concentração mínima inibitória de 0,3 mg/mL para S.
typhimurium ATCC 14028, S.enteritidis ATCC 13076 e Escherichia coli ATCC 25922.
Alguns autores demonstraram que a inibição de patógenos usando óleo essencial de tomilho depende do microrganismo avaliado. Segundo Sartorratto et al. (2004) o óleo de tomilho apresenta uma alta atividade antimicrobiana para Enterococcus faecium e uma atividade moderada para cepas como Staphylococcus aureus e Salmonella choleraesuis. Já para as cepas de E. coli, S. typhimurium e S. choleraesius, Gonçalves et
al. (2017) encontraram valores de MIC entre 0,15 e 0,25 mg/mL o que pode ser considerado uma alta atividade antimicrobiana.
A ação desse óleo essencial frente a diversos microrganismos pode estar vinculada à presença dos compostos fenólicos timol e carvacrol que correspondem a aproximadamente 80% da composição total (TEIXEIRA et al., 2013). Um estudo realizado por Helander et al. (1998) demonstrou que estes dois constituintes são capazes de alterar a permeabilidade da membrana citoplasmática das células ocasionando o rompimento da mesma.
A blenda (capim limão : tomilho) apresentou um efeito antimicrobiano menor em relação ao óleo essencial de tomilho para todos os patógenos testados, com valor de MIC igual a 0,6 mg/mL para as cepas padrão e Salmonella MB89. Tal resultado mostra que a adição do óleo essencial de capim limão diminuiu a atividade do óleo essencial de tomilho. Entretanto a sua aplicação em chocolate pode ser considerada uma alternativa, já que para Sartoratto et al. (2004), valores de MIC abaixo de 0,5 mg/mL representam uma alta atividade antimicrobiana.
No presente trabalho, o óleo essencial de laranja doce apresentou valores de MIC e MBC maiores que 2,0 mg/mL para todos os microrganismos testados. Settanni et al. (SETTANNI et al., 2012) ao investigarem a atividade de óleos cítricos contra Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus e Salmonella entérica, observaram que
dependendo da variedade do fruto utilizado, o óleo essencial pode apresentar maior ou menor atividade antimicrobiana. Em estudo realizado por Parviz et al. (2011) avaliou-se a composição química do óleo essencial de laranja doce obtido através da micro extração em fase sólida, micro extração em gota suspensa e por prensagem a frio e demonstraram que a quantidade de D-limoneno, principal constituinte, variou de 61% a 90% e o mirceno variou de 2,5% a 17,55%, em função do método de extração utilizado.
5.1.2 Testes in situ
O efeito dos óleos essenciais aplicados no chocolate foi avaliado durante 45 dias, visando entender as propriedades antimicrobianas comprovadas no ensaio “in vitro” quando estes são aplicados em uma matriz alimentícia. Os resultados destes tratamentos estão apresentados na Figura 1, onde CT representa a amostra controle, TM o tratamento com óleo essencial de tomilho e BL com a blenda de óleos essenciais.
Figura 1 - Comportamento de S. typhimurium inoculada em chocolate amargo com adição de óleo essencial de tomilho, blenda tomilho (3) : capim limão (1) e controle ao longo de 45 dias.
Fonte: Elaborado pela autora do trabalho
Uma amostra foi retirada no tempo 0 para avaliar o possível efeito imediato dos óleos essenciais na redução microbiológica. No entanto, em todos os tratamentos a população inicial encontrou-se em torno de 6 log UFC/g. Após 7 dias de armazenamento houve uma redução de aproximadamente 3 log UFC/log, contagem que se manteve até 30 dias para o tratamento controle e com óleo de tomilho, enquanto que o tratamento com a blenda de óleo demostrou uma contagem de 2,56 log UFC/g no mesmo período. Tal diferença não se manteve após o período de 45 dias de armazenamento, onde a contagem da amostra controle (2,65 log UFC/g) não diferiu dos tratamentos com óleo de tomilho (2,76 log UFC/g) e com a blenda de óleos essenciais (2,54 log UFC/g).
Os resultados obtidos durante o armazenamento mostram que a redução microbiológica não foi influenciada pela adição dos óleos essenciais, já que a amostra controle apresentou a mesma contagem que os tratamentos com óleos essenciais. Este comportamento pode estar relacionado à baixa atividade de água (0,30 a 0,50) e ao elevado teor de açúcar e gordura do chocolate. Tais características criam um ambiente desfavorável para o crescimento das bactérias (BECKETT, 2009; GRANADOS, 2016).
O efeito antimicrobiano de óleos essenciais em chocolate também foram estudados por Kotzekidou et al. (2008) que observaram não só a inibição do crescimento microbiano como a redução de aproximadamente 1 log das células iniciais durante 9 dias de armazenamento. No entanto, esta redução diferiu da amostra controle (sem óleo essencial) somente em certas condições de temperatura, atividade de água e tempo de armazenamento, indicando que somente o uso de óleo essencial não garante a proteção completa contra os patógenos utilizados.
Ainda que os óleos essenciais apresentem alta atividade antimicrobiana em ensaios in vitro, a aplicação em uma matriz alimentícia pode diminuir a sua eficácia devido à interação com componentes do alimento ou com outros aditivos (SETTANNI et al., 2012; GONÇALVES et al., 2017). Segundo a revisão realizada por Burt (2004), a concentração de óleo essencial necessária para se obter os mesmos efeitos antimicrobianos observados nos ensaios in vitro pode variar significativamente em função das características intrínsecas do alimento como o conteúdo de água, lipídios, proteína, pH, presença de antioxidantes e de outros aditivos, além dos fatores extrínsecos como a temperatura de armazenamento, tipo de embalagem, presença de ar e das características do microrganismo. A determinação da concentração de óleo essencial que apresenta um satisfatório efeito antimicrobiano é fundamental para a avaliação de sua aplicação em um produto alimentício, já que concentrações muito altas podem promover alterações indesejadas nas características sensoriais (BURT, 2004; TIWARI et al., 2009).
No presente estudo, a aplicação de maiores concentrações do óleo de tomilho e da blenda de óleos para se ter um efeito antimicrobiano poderia descaracterizar o sabor de chocolate, tornando-o desagradável sensorialmente.
5.2 ETAPA 2: AVALIAÇÃO TECNOLÓGICA DA APLICAÇÃO DOS ÓLEOS