UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
Julyana Laura Medeiros Vaughan
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E EFEITOS TECNOLÓGICOS DE ÓLEOS ESSENCIAIS APLICADOS EM CHOCOLATE
CAMPINAS 2020
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E EFEITOS TECNOLÓGICOS DE ÓLEOS ESSENCIAIS APLICADOS EM CHOCOLATE
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Tecnologia de Alimentos
Supervisor (orientador): Profa. Dra. Priscilla Efraim
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA JULYANA LAURA MEDEIROS
VAUGHAN, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. PRISCILLA EFRAIM
CAMPINAS 2020
Ana Paula Badan Ribeiro Membro titular
Faculdade de Engenharia de Alimentos - UNICAMP
Valdecir Luccas Membro titular
Instituto de Tecnologia de Alimentos - ITAL
Camilia Aoyagui dos Santos Membro titular
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de São Paulo - IFSP
*Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno
Primeiramente a Deus pela oportunidade concedida e por ser minha fortaleza em todos os dias de minha vida.
A minha orientadora Priscilla Efraim por toda paciência e por todos os ensinamentos que me foram passados.
Aos meus pais José Júnior e Laucy, pelo amor, dedicação e cuidados, por apoiarem os meus sonhos e me dar suporte para concretizá-los.
A minha avó Terezinha que sempre amparou a mim e aos meus irmãos em todos os momentos de nossas vidas, pelas conversas de incentivo e todo carinho que me foi dado ao longo desta jornada.
Ao meu avô José (in memoriam) que foi incansável ao me incentivar a estudar, por todas as conversas e lições de vida que me foram passadas, por todas as risadas e abraços que me fizeram querer ser uma pessoa melhor.
Aos meus irmãos Lohanne e José Neto pelo carinho, pelas histórias, por dividirem comigo as preocupações e os momentos felizes de nossa família e por criarem um mundo mais feliz e divertido.
A toda minha família, tios e tias, primos e primas, pelo suporte e toda preocupação no meu desenvolvimento pessoal e profissional.
Aos meus queridos amigos do Laboratório de Frutas e Hortaliças (FEA/UNICAMP) por todo conhecimento compartilhado e por serem meu lar fora de casa.
Ao meu companheiro Matheus, por todo amor, paciência e por estar sempre ao meu lado nos momentos bons e ruins.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo financiamento desta pesquisa sob o processo nº 2016/04871-4.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES)- Código de financiamento 001.
Entre as estratégias para o controle microbiano em alimentos, a adição de óleos essenciais vem se destacando por representar uma alternativa proveniente de fonte natural frente ao uso de aditivos químicos. O potencial antimicrobiano de alguns óleos essenciais pode estar relacionado aos seus constituintes químicos como terpenos, álcoois, cetonas, fenóis, ácidos, aldeídos e ésteres, bem como às características morfológicas da bactéria-alvo. Para a aplicação em chocolate, foi investigada a concentração mínima inibitória (MIC) e a concentração mínima bactericida (MBC) de três óleos essenciais: tomilho (Thymus
vulgaris), capim limão (Cymbopogan citratus), laranja doce (Citrus sinensis) e uma
blenda de Thymus vulgaris e Cymbopogan citratus frente aos patógenos Salmonella
typhimurium ATCC 14028, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Escherichia coli ATCC
25922 e três cepas de isoladas de Salmonella enteritidis. Os resultados dos ensaios in
vitro indicaram que o óleo essencial de tomilho e a blenda de tomilho e capim limão
apresentaram maior efeito inibitório e foram selecionados para avaliação do efeito contra a Salmonella typhimurium dentro da matriz alimentícia estudada, o chocolate. Após a inoculação da cepa (tempo 0), a contagem apresentou diferença significativa entre a amostra controle e as amostras com os óleos essenciais, porém, nos demais tempos (7, 14, 30 e 45 dias) as amostras não diferiram entre si, indicando que os óleos essenciais não tiveram efeito sobre a redução da população microbiana. Dentre os constituintes dos óleos essenciais, os monoterpenos têm sido estudados pela capacidade de alterar a mobilidade molecular dos cristais de gordura e consequentemente modificar o comportamento de cristalização da manteiga de cacau. Desta forma, o objetivo da segunda etapa do estudo foi avaliar a influência da adição dos óleos essências de tomilho e da blenda (tomilho : capim limão) sobre a composição em ácidos graxos e na isoterma de cristalização da manteiga de cacau. Foram avaliados parâmetros relacionados ao chocolate ao longo da armazenagem como: a força necessária para a quebra (snap), o aparecimento de fat bloom por meio do índice de brancura e microscopia eletrônica de varredura (MEV) e da estrutura, por meio do hábito polimórfico por DRX e comportamento de fusão (DSC). A adição dos óleos essenciais não modificou a composição em ácidos graxos da manteiga de cacau, porém diminuiu ligeiramente a taxa do crescimento cristalino. Ademais, a presença dos óleos essenciais propiciou redução da tensão de ruptura (snap) do chocolate e aumentou o tempo necessário para a formação de fat bloom a partir de 62 dias de armazenamento. A transição polimórfica dos cristais instáveis para a forma mais estável
chocolate com adição da blenda de óleos essenciais, a transição foi detectada a partir de 30 dias. A adição de óleos essenciais conferiu ao chocolate maior maciez e possível retardamento na formação do fat bloom. Os resultados poderão auxiliar futuras pesquisas relativas ao uso de óleos essenciais e terpenos em chocolate, com vista ao retardamento do fat bloom ou inibição do crescimento microbiano.
Palavras-chave: fat bloom, manteiga de cacau, monoterpenos, óleos essenciais, antimicrobiano, e atividade antimicrobiana, bactérias.
Among the strategies for microbial control in food, the addition of essential oils has been highlighted by representing an alternative from natural source in the face of the use of chemical additives. The antimicrobial potential of some essential oils may be related to their chemical constituents such as terpenes, alcohols, ketones, phenols, acids, aldehydes, and esters, as well as the morphological characteristics of the target bacterium. For the application in chocolate, the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericidal concentration (MBC) of three essential oils: thyme (Thymus vulgaris), lemongrass (Cymbopogan citratus), sweet orange (Citrus sinensis) and a blend of
Thymus vulgaris and Cymbopogan citratus against Salmonella Typhimurium ATCC
14028 pathogens, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Escherichia coli ATCC 25922 and three strains of Salmonella enteritidis isolates. The results of the in vitro assays indicated that thyme essential oil and the blend of thyme and lemongrass presented greater inhibitory effect and were selected to evaluate its effect against Salmonella Typhimurium within the studied food matrix, chocolate. After inoculation of the strain (time 0), the count showed a significant difference between the control sample and the samples with the essential oils, but in the other times (7, 14, 30 and 45 days) the samples did not differ from each other, indicating that essential oils had no effect on the reduction of the microbial population. Among the constituents of essential oils, monoterpenes have been studied by the ability to alter the molecular mobility of fat crystals and consequently modify the crystallization behavior of cocoa butter. Thus, the objective of the second stage of the study was to evaluate the influence of the addition of thyme and blend essence oils (thyme: lemongrass) on the fatty acid composition and on the cocoa butter crystallization. Parameters such as the force necessary for breakage (snap), the appearance of fat bloom by means of the whiteness index and scanning electron microscopy (SEM), and the structure, through the polymorphic habit by DRX and fusion behavior (DSC) were evaluated during a period of storage. The addition of essential oils did not modify the fatty acid composition of cocoa butter but slightly decreased the rate of crystalline growth. On the other hand, they reduced the tension of chocolate break (snap) and slowed the formation of fat bloom from 62 days of storage. The polymorphic transition from unstable crystals to the most stable form (βVI) was detected from 21 days of storage to the chocolate control sample and chocolate with the addition of thyme essential oil, while the transition to chocolate with the addition of the blend of essential
microbial growth. Keywords: fat bloom, cocoa butter, monoterpenes, essential oils, antimicrobial activity, bacteria.
Figura 1 - Comportamento de S. typhimurium inoculada em chocolate amargo com adição de óleo essencial de tomilho, blenda tomilho (3) : capim limão (1) e controle ao longo de 45 dias. ...44 Figura 2 - Isotermas de cristalização a 15 ºC (A) e a 17,5 ºC (B) da amostra de chocolate amargo controle - sem adição de óleo essencial (CT), chocolate amargo com adição de óleo essencial de tomilho (TM) e chocolate amargo com adição de blenda dos óleos essenciais de tomilho (3) : capim limão (1) (BL)...47 Figura 3 - Curvas de fusão obtidas por calorimetria diferencial de varredura durante 7 e 45 dias de armazenamento do chocolate sem adição de óleo essencial (A), chocolate com adição de óleo essencial de tomilho (B) e chocolate com adição de blenda de óleos essenciais de tomilho (3) : capim limão (1) (C) ...52 Figura 4- Valores do índice de brancura (IB) das superfícies das barras de chocolate sem adição de óleo essencial (CT), chocolate com adição de óleo essencial de tomilho (TM) e chocolate com blenda de óleos essenciais de tomilho (3) : capim limão (1) (BL) ao longo do tempo de armazenamento de 90 dias...54 Figura 5 - Micrografias obtidas com lente de aumento de 100x, das amostras de chocolate sem adição de óleo essencial (CT), chocolate com adição de óleo essencial de tomilho (TM) e chocolate com adição de blenda de óleos essenciais de tomilho (3) : capim limão (1) (BL) armazenadas durante 45 dias...58
Tabela 1. Composição química dos principais constituintes encontrados na literatura dos
óleos essenciais de tomilho, capim-limão e laranja...27
Tabela 2. Tratamentos aplicados às amostras de chocolate...36 Tabela 3. Atividade antimicrobiana (mg/mL) dos óleos essenciais de tomilho, laranja doce e blenda (capim-limão : tomilho) contra microrganismos de importância em chocolate amargo... ... ... ...42 Tabela 4. Composição em ácidos graxos das fases lipídicas das três amostras: chocolate amargo controle - sem adição de óleo essencial (CT), chocolate amargo com adição de óleo essencial de tomilho (TM) e chocolate amargo com adição de blenda de óleos essenciais de tomilho:capim limão (3:1) (BL)...46 Tabela 5. Tempo de indução (tSFC), conteúdo de gordura sólida (SFCmáx, %) e meio tempo de cristalização (t1/2) da fase lipídica dos chocolates obtidos durante a cristalização isotérmica a 15 ºC e a 17,5 ºC...49 Tabela 6. Hábito polimórfico das amostras de chocolate sem adição de óleo essencial (CT), com adição de óleo essencial de tomilho (TM) e com adição de blenda de óleos essenciais de tomilho (1): capim limão (3) (BL) nos tempos t7, t14, t21, t30 e t45 dias...51 Tabela 7. Parâmetros da curva de fusão Tonset (ºC), Tpeak (ºC), Toff (ºC) e Entalpia (J/g) determinados nos tempos de armazenamento t7 e t45 para os chocolates sem adição de óleo essencial (CT), chocolate com adição de óleo de tomilho (TM) e chocolate com blend de óleos essenciais (BL)...54 Tabela 8. Tensão de ruptura do chocolate (kgf/cm2) das amostras de chocolate sem adição de óleo essencial (CT), chocolate com adição de óleo essencial de tomilho (TM) e chocolate com adição de blenda de óleos essenciais de tomilho (3) : capim limão (1) (BL) armazenadas durante 45 dias...59
2 OBJETIVO GERAL ... 17 2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 17 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 18 3.1 CHOCOLATE ... 18 3.1.1 Mercado ... 18 3.1.2 Processo de fabricação ... 19
3.2 Característica polimórfica da manteiga de cacau ... 21
3.3 Cristalização da manteiga de cacau e do chocolate ... 22
3.4 Salmonella ... 24
3.4.1 Salmonella em chocolate ... 25
3.5 Óleos Essenciais ... 27
3.5.1 Aplicação de óleos essenciais para o controle microbiano ... 28
3.5.2 Óleos essenciais em chocolate ... 30
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 32 4.1 MATERIAL ... 32 4.1.1 Óleos essenciais... 32 4.1.2 Ensaios microbiológicos ... 32 4.1.3 Produção do chocolate ... 33 4.2 MÉTODOS ... 33
4.2.1 Produção da massa de chocolate ... 33
4.2.2 ETAPA 1: Avaliação do Efeito Antimicrobiano... 33
4.2.2.1 Avaliação do Efeito Antimicrobiano dos óleos essenciais: ensaios in vitro e in situ ... 33
a. Microrganismo e ativação das cepas ... 33
b. Preparação do inóculo ... 34
c. Determinação da concentração mínima inibitória (MIC) ... 34
a. Inoculação da Salmonella no chocolate ... 35
b. Determinação da Salmonella ... 36
4.2.3 ETAPA 2: Avaliação Tecnológica ... 37
4.2.3.1 Caracterização da fase lipídica do chocolate ... 37
a. Preparo da amostra ... 37
b. Composição em ácidos graxos ... 37
c. Isoterma de cristalização (RMN) ... 38
4.2.3.2 Ensaios de temperagem e moldagem dos chocolates e avaliação da influência à qualidade tecnológica ... 38
a. Efeito da adição de óleos essenciais na estabilidade do chocolate ... 39
4.2.4 Análise estatística ... 41
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 42
5.1 ETAPA 1: POTENCIAL ANTIMICROBIANO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS ... 42
5.1.1 Testes in vitro ... 42
5.1.2 Testes in situ ... 44
5.2 ETAPA 2: AVALIAÇÃO TECNOLÓGICA DA APLICAÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS EM CHOCOLATE ... 46
5.2.1 Caracterização da fase lipídica do chocolate... 46
5.2.2 Caracterização dos chocolates ... 50
a. Hábito Polimórfico ... 50
b. Comportamento de fusão ... 51
c. Índice de brancura (IB) ... 54
d. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ... 57
e. Análise instrumental de textura ... 59
6 CONCLUSÃO ... 61
7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 62
1 INTRODUÇÃO
O chocolate é um produto amplamente difundido ao redor do mundo e conhecido pelas suas características de sabor e textura, que propiciam ao consumidor uma experiência sensorial única (BECKETT, 2009). O consumo de chocolate e de produtos de confeitaria ao redor do mundo vem aumentando a cada ano, entre os anos de 2012/2013 cerca de 6,94 milhões de toneladas foram consumidos, alcançando 7,31 milhões de toneladas em 2015/2016. Este cenário se tornou positivo para o biênio de 2018/2019 com estimativa de consumo de 7,69 milhões de toneladas (STATISTA, 2015). o que coloca os países produtores de cacau em um cenário economicamente promissor, dentre eles, o Brasil que ocupou a sexta posição entre os maiores produtores mundiais na safra de 2017/2018 (FAOSTAT, 2020).
Esse alimento consiste em um sistema de sólidos de cacau e cristais de açúcares que coexistem com uma fase gordurosa composta primordialmente por manteiga de cacau. Devido à natureza hidrofílica do açúcar e hidrofóbica da manteiga de cacau, podem ser adicionados emulsificantes como a lecitina de soja para diminuir a tensão superficial e promover a compatibilidade entre os ingredientes (AFOAKWA et al., 2009; SVANBERG et al., 2013).
A manteiga de cacau, principal ingrediente do chocolate, apresenta uma natureza altamente polimórfica o que confere a esta gordura um complexo comportamento de cristalização, podendo ocorrer em seis formas polimórficas diferentes. A forma βV é o polimorfo mais desejável no chocolate devido aos adequados pontos de fusão e solidificação, que proporcionam ao chocolate uma estabilidade em temperatura ambiente e completa fusão a temperatura corporal. Esta característica promove o desprendimento suave das partículas sólidas na manteiga de cacau durante a degustação permitindo consigo o desprendimento de sabor, gerando uma sensação agradável durante a degustação (MARTY-TERRADE; MARANGONI, 2012). Além de influenciar em outros atributos sensoriais como textura, brilho e snap (HODGE; ROUSSEAU, 2002).
Devido a algumas características do chocolate, como a baixa atividade de água (0,30 a 0,35) e o baixo teor de umidade (0,5 a 1,0%) (AUGUSTO, 2017), porém, o alto teor de lipídios, surtos relacionados com este produto estão relacionados com a presença de Salmonella. Durante a década de 70, três surtos foram identificados, um deles ocorreu na Suécia com 110 pessoas afetadas e os demais ocorreram nos Estados Unidos e Canadá em 1973 e 1974 após a contaminação em bolas de chocolate, sendo a
fonte de contaminação amêndoas de cacau com Salmonella Eastbourne (DOYLE; BEAUCHAT, 2007; WERBER et al., 2005).
A presença deste patógeno no chocolate está relacionada com o aumento de sua resistência térmica durante o processo de torrefação e com a manutenção das suas células em estado latente durante o armazenamento do chocolate, já que a baixa atividade de água do produto promove um ambiente desfavorável à sua multiplicação (CÁNOVAS et al., 2001; NASCIMENTO et al., 2012). Além disso, em alimentos com elevado teor lipídico, como amendoim e chocolate, as moléculas de gordura promovem uma proteção para essas bactérias. Desta forma, ao transitarem pelo trato gástrico, não são afetadas pela acidez ou por enzimas digestivas, permitido a sua chegada ao intestino, onde, mesmo que a dose infectante seja extremamente baixa, ocorre a colonização e o surgimento do quadro clínico ( BRASIL, 2011; D’AOUST et al., 1975;).
Neste contexto, uma das formas mais utilizadas pela indústria de alimentos para garantir a inocuidade dos alimentos está no uso de conservadores químicos, como nitratos, nitritos, parabenos, ácido sórbico, sulfito e ácido cítrico. No entanto, o uso de alguns desses conservadores químicos tem sido associado a reações adversas como carcinogenicidade e alta toxicidade (AUN et al., 2011; FALEIRO, 2011; SOLÓRZANO-SANTOS; MIRANDA-NOVALES, 2012). Assim, é crescente a busca por produtos naturais que apresentem atividade anti-microbiana. Tanto os óleos essenciais individuais como as blendas têm recebido especial atenção por inibir o crescimento de diversos patógenos relacionados ao alimento como Salmonella spp., Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Listeria innocua e Staphylococcus aureus (AMBROSIO et al., 2017).
Estudos têm demonstrado que os óleos essenciais podem ter efeito antimicrobiano tanto em bactérias Gram positivas quanto Gram negativas. Ao estudar o efeito de óleo de laranja, Fisher e Phillips (2006) observaram que este óleo foi capaz de inibir o crescimento da Escherichia coli O157, uma bactérias gram-negativa e da Listeria. monocytogenes, gram positiva. Os componentes isolados dos óleos essenciais de laranja também apresentaram resultados positivos. Um estudo realizado por O`Bryan et al. (2008) demonstrou que a concentração inibitória dos terpenos de laranja e d-limoneno foi 1% enquanto que a essência de laranja apresentou uma faixa de 0,125% a 0,5% contra as cepas de Salmonella spp. testadas. Outros estudos demonstraram efeito antimicrobiano contra a Salmonella typhimurium e E.coli utilizando óleo de tomilho e contra S. Enteritidis e S.typhimurium utilizando óleo de capim limão (TEIXEIRA et al., 2013;
SHIN, 2005). Segundo Lis-Bachin e Deans (1997) essa atividade antimicrobiana pode estar relacionada à alta porcentagem de monoterpenos eugenol, cinamaldeído, timol, limoneno e, em alguns casos, citonelol e geraniol.
Os óleos essenciais apresentam em sua composição uma grande quantidade de terpenos. Entre esses, os monoterpenos têm sido pesquisados por demonstrarem potencial em modificar o comportamento de cristalização dos lipídios. A adição d-limoneno, um monoterpeno encontrado principalmente em óleos essenciais de frutas cítricas, pode acelerar a transição polimórfica da manteiga de cacau da forma β’ para a forma β (RAY et al., 2012; MIYASAKI et al., 2016). De acordo com Do et al. (2008), esta modificação no comportamento cristalino pode ser atribuída à localização do d-limoneno entre a cadeia de ácidos graxos e os cristais de gordura, que permite uma maior mobilidade dos triacilgliceróis (TAGs) promovendo uma modificação no rearranjo estrutural destas moléculas.
Neste contexto, entender a influência da adição de óleos essenciais no comportamento de cristalização, nas características sensoriais e consequente estabilidade do chocolate é fundamental para a obtenção de um produto com qualidade. Também torna-se importante estudar sua aplicação como antimicrobiano natural para entender a sua potencialidade contra patógenos de interesse.
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2 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral deste trabalho foi avaliar a ação antimicrobiana de óleos essenciais e a sua influência na estabilidade física de chocolate do tipo amargo.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Avaliar a ação antimicrobiana dos óleos essenciais de tomilho (Thymus vulgaris), capim limão (Cymbopogan citratus), laranja doce (Citrus sinensis) e uma blenda de
Thymus vulgaris e Cymbopogan citratus contra Salmonella e Escherichia coli.
• Avaliar o efeito antimicrobiano dos óleos essenciais de tomilho (Thymus vulgaris) e uma blenda de tomilho e capim limão (Cymbopogan citratus), em chocolate. • Avaliar a influência da adição do óleo essencial de tomilho e da blenda tomilho:capim-limão para a qualidade do chocolate do tipo amargo durante o armazenamento.
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 CHOCOLATE
O chocolate consiste em um sistema de partículas sólidas de cacau e açúcar dispersos em uma fase contínua de gordura que consiste primordialmente em manteiga de cacau (HODGE; ROUSSEAU, 2002). Segundo a RDC nº 264 de setembro de 2005, outros ingredientes podem ser adicionados ao chocolate, desde que a formulação contenha no mínimo 25% de sólidos de cacau. A resolução também prevê que o chocolate branco deve apresentar no mínimo 20 % de sólidos totais de manteiga de cacau (BRASIL, 2005).
A obtenção do chocolate é realizada através das etapas de mistura dos ingredientes, refino, conchagem, temperagem e moldagem das barras. Dentre estas etapas de processamento, a temperagem é responsável pela pré-cristalização da manteiga de cacau com a formação de núcleos estáveis (1-3%) para que a fase lipídica restante se cristalize na forma adequada (AFOAKWA; 2010). Chocolates pré-cristalizados de forma correta resultam em um produto com superfície que apresenta brilho, bom snap e resistência ao fat bloom durante o armazenamento (CAPAROSA; HARTEL, 2019).
3.1.1 Mercado
O mercado de chocolates movimentou, no Brasil em 2016, um total de 206,2 milhões de dólares entre transações de exportação e importação. No ano seguinte, essa movimentação aumentou para 252 milhões de dólares, alcançando um resultado ainda mais promissor em 2018, com um total de 380 milhões de dólares (ABICAB, 2018). Em um panorama internacional, o mercado de chocolate apresenta tendências igualmente vantajosas com um crescimento no volume de vendas e uma maior arrecadação no valor total. Estima-se que as vendas em 2021 comparadas com o ano de 2016 apresentem um aumento significativo, em função do valor total do produto, chegando a 35% na Rússia, 27% no Japão e 17% nos Estados Unidos (BRASIL, 2018).De acordo com INTERNATIONAL COCOA ORGANIZATION – ICCO (2020), 35% do processamento das amêndoas de cacau entre a safra 2017/2018 foi realizado pelos países que constituem a União Europeia, com uma notável contribuição da Alemanha e Holanda que processaram 9,74% e 12,73%, respectivamente. Nos demais continentes como Ásia/Oceania, África e América, este processamento foi 22,9%, 21,0% e 19,0%,
respectivamente. Uma projeção para a safra 2019/2020 prevê que o processamento das amêndoas na Ásia e Oceania possa ter um aumento de 2,6% enquanto que a Europa processará menos 2,2% em relação a 2017/2018. Entretanto, os países europeus continuarão a ser os principais representantes no processamento das amêndoas de cacau. Os países europeus também se destacam como os maiores consumidores per capita. Em 2017, a Suíça consumiu 8,8 kg, seguida pela Áustria (8,1 kg), Alemanha (7,9 kg), Reino Unido (7,6 kg) e Suécia (6,6 kg). O Brasil neste cenário apresentou um baixo consumo per capita com 1,2 kg neste mesmo ano (STATISTA, 2020). Em 2016, a produção de chocolate e de produtos derivados de cacau no Brasil correspondeu a 710 mil toneladas, onde o consumo aparente foi de 709 mil toneladas e a exportação foi 28 mil toneladas, indicando que a produção de chocolate é fortemente absorvida pelo mercado interno (ABICAB, 2018).
Dentre os países produtores de cacau (principal matéria-prima para a fabricação de chocolate), o Brasil encontra-se como o sétimo maior produtor. Entre o período de 2016 e 2017, os principais produtores foram: Costa do Marfim, Gana, Equador, Indonésia, República dos Camarões e Nigéria, respectivamente. Uma projeção para o período de 2018 a 2019 indica a posição no ranking dos três principais produtores ficará inalterada, enquanto que os três seguintes alternarão entre si e o Brasil continuará na sétima posição (ICCO, 2019). O último levantamento realizado pela Food and Agriculture Organization of the United Nations - FAO (2019) apontou que entre o período de 2016 e 2017, a África detinha 69,5% da produção mundial de cacau seguida pela América com 15,5%, Ásia com 13,9% e Oceania com 1%.
Diante do aumento do consumo mundial de chocolate e de produtos derivados de cacau, além da crescente busca dos consumidores por alimentos de qualidade, torna-se cada vez mais importante o aprimoramento das técnicas de produção e a diferenciação destes produtos frente aos já existentes no mercado. O posicionamento de um produto como alternativa à proporcionar experiências sensoriais ao consumidor, pode ser uma das estratégias adotadas. O chocolate é um alimento com uma alta complexidade de sabores que permite ser associado a outros ingredientes que podem intensificar este perfil sensorial (ITAL, 2014).
O processamento do chocolate começa com a mistura dos ingredientes. Nesta etapa ocorre a homogeneização dos componentes que pode ser realizada em misturadores encamisados a 50º C para manter a gordura fundida (AFOAKWA, 2010). A seguinte etapa é o refino que objetiva a diminuição do tamanho das partículas dos sólidos de cacau, açúcar e outros ingredientes como o leite (CAPAROSA; HARTEL, 2019). A massa, então, é submetida ao processo de conchagem que consiste em homogeneização constante sob temperaturas ente 45º C e 80º C a fim de diminuir a atividade de água e volatilizar do ácido acético, que fora produzido ao final da etapa de fermentação. Ao final do processo, são adicionados emulsificantes para promover a dispersão das partículas sólidas na fase lipídica do chocolate (ZIEGLEDER, 2009).
Após a conchagem, é realizado o processo de temperagem do chocolate. A temperagem é uma etapa em que ocorre a pré-cristalização de uma pequena proporção de triacilgliceróis (1 a 3% no total), que irão atuar como núcleos para a formação da rede cristalina de gordura.
Este processo consiste no aumento da temperatura a aproximadamente 40 ºC para a completa fusão do chocolate, a fim de eliminar sua memória cristalina. Em seguida, ocorre a diminuição da temperatura, com consequente remoção do calor sensível, até aproximadamente 32 ºC quando se inicia a formação de cristais. A partir deste momento, tanto cristais instáveis de forma polimórfica β`quanto os mais estáveis da forma β começam a ser formados. A diminuição de temperatura pode ser levada até aproximadamente 27 ºC, quando um novo aquecimento até 32 ºC é realizado para fundir os cristais instáveis (β`) e manter somente os estáveis (β) (TALBOT, 1999). É desejável que durante este processo sejam formados núcleos de cristais na forma βV, que irá proporcionar ao produto final brilho, resistência ao fat bloom e migração de gordura. Uma boa temperagem é capaz de desenvolver este tipo de cristal em quantidade suficiente para evitar uma cristalização altamente heterogênea durante o resfriamento (LANGEVELDE et al., 2001; LONCHAMPT; HARTEL, 2004;).
Caso o chocolate apresente uma temperagem insuficiente, poucos núcleos de cristalização serão formados, impossibilitando uma boa cristalização da massa de chocolate durante o resfriamento. Isto acarretará no aumento do tempo de cristalização já que núcleos continuarão sendo formados no resfriamento, em vez de ocorrer somente crescimento de cristais. Além disso, a formação dos novos núcleos durante o resfriamento ocorrerá na forma polimórfica mais instável e posteriores problemas de recristalização poderão ocorrer (LONCHAMPT; HARTEL, 2004).
Quando ocorre sobre-temperagem, a concentração de cristais formados na massa de chocolate é muito alta. Isto pode ocorrer devido a um logo tempo de processo. Tal condição pode aumentar a dureza e a viscosidade do produto, reduzindo o brilho e promovendo a opacidade da superfície do chocolate (AFOAKWA, 2010).
A moldagem é uma etapa que tem por finalidade promover forma ao chocolate. Esta etapa pode ser realizada apenas vertendo o chocolate temperado em moldes ou pode ser uma operação de dosagem formando uma camada de chocolate para a produção de chocolates com recheios. Durante este processo, bolhas de ar podem ser incorporadas e podem promover variações de peso e indesejáveis alterações no produto final. Para evitar este problema, os moldes deverão ser levados à vibração assim que o chocolate for depositado para que as bolhas de ar sejam removidas (GRAY, 2009).
A última etapa consiste no resfriamento da massa para promover sua cristalização. Os equipamentos de resfriamento mais adequados possuem zonas de resfriamento que consistem em:
- Primeira zona, com temperatura entre 12 e 15º C, na qual ocorre a retirada do calor sensível da massa de chocolate que entra no túnel em temperaturas entre 28 – 32° C;
- Segunda zona, com temperaturas entre 7 e 10º C, na qual ocorre a retirada da maior parte do calor latente de cristalização da gordura;
Terceira e última área, com temperaturas entre 12 e 18°C, que permitem que o chocolate saia do equipamento com temperatura acima do ponto de orvalho da área de embalagem, evitando assim a condensação de umidade sobre o produto (GRAY, 2009).
3.2 CARACTERÍSTICA POLIMÓRFICA DA MANTEIGA DE CACAU
A manteiga de cacau é composta quase que em sua totalidade (95%) por triacilgliceróis e em menor proporção encontram-se os diacilgliceróis, monoacilgliceróis e ácidos graxos livres, além de componentes solubilizados como esteróis e tocoferóis. Os três principais ácidos graxos encontrados em sua composição são: ácido palmítico (C16:0), ácido esteárico (C18:0) e ácido oleico (C18:1). Na molécula de triacilglicerol, a posição central sn-2 é claramente dominante pelo ácido oleico, enquanto que os outros dois ácidos graxos saturados são esterificados nas posições 1 e 3 da molécula. Esta simplicidade de arranjo entre os ácidos graxos faz com que a manteiga de cacau apresente três principais triacilgliceróis simétricos: palmitoil-2-oleoil-palmitina (POP),
1-palmitoil-2-oleoil-estearina (POS) e 1-estearoil-2-oleoil-estearina (SOS) (AKOH; MIN, 2008; LIPP; ANKLAM, 1998).
Devido a essa organização, a manteiga de cacau pode cristalizar em seis formas polimórficas diferentes, identificadas como I, II, III, IV, V e VI, ou por letras gregas γ, α, β`e β, sendo a forma β subdividida em βV e βVI (BECKETT, 2009). A forma polimórfica βV é o polimorfo mais desejável no chocolate devido ao seu adequado ponto de fusão e solidificação, o que propicia ao chocolate uma estrutura com excelentes atributos sensoriais em termos de textura (snap e derretimento) e brilho (HODGE; ROUSSEAU, 2002). Essa forma polimórfica é induzida na etapa de temperagem ou pré-cristalização em condições definidas de temperatura, resfriamento e taxa de cisalhamento (SVANBERG et al., 2013). Por outro lado, a mudança cristalina para a forma polimórfica βVI está associada ao armazenamento prolongado já que essa transição é mediada somente em estado sólido. O principal resultado dessa reestruturação é a formação de fat
bloom, defeito caracterizado pela perda de brilho, surgimento de manchas esbranquiçadas
e aumento na maciez na superfície do chocolate (HODGE; ROUSSEAU, 2002; BISWAS et al., 2017).
O fat bloom pode ocorrer em algumas situações como (CEBULA; ZIEGLEDER, 1993):
(a) Temperagem insuficiente, na qual a manteiga de cacau é cristalizada na forma IV e ao chocolate ser levado para temperatura ambiente, ocorre recristalização na forma V. Durante esta transformação, a formação da forma polimórfica mais estável provocará a contração da massa e algumas moléculas de gordura que permaneceram no estado líquido migrarão para a superfície onde possivelmente se solidificarão na forma de grande cristais;
(b) Temperagem e resfriamento adequados, nos quais a forma polimórfica V passará naturalmente para a forma VI, de maior estabilidade devido ao tempo e condições de armazenamento como flutuações de temperatura e exposição a luz solar.
(c) Adição de diferentes tipos de triacilgliceróis provocando uma desestruturação do sistema e recristalização de certos componentes.
3.3 CRISTALIZAÇÃO DA MANTEIGA DE CACAU E DO CHOCOLATE
A cristalização da fase lipídica é uma etapa importante para a obtenção de uma rede cristalina adequada no produto final. Este processo depende de fatores como a
composição de triacilgliceróis (TAGs), taxa de cisalhamento e da temperatura de processo (SONWAI; MACKLEY, 2006; VEREECKEN et al., 2010).
A manteiga de cacau possui uma determinada composição em TAGs, o que lhe confere a capacidade de se cristalizar em seis diferentes formas polimórficas. A cristalização e a estabilidade de cada polimorfo estão diretamente relacionadas com a temperatura empregada durante este processo. As formas metaestáveis γ e α podem cristalizar a partir da gordura fundida e a forma β′ pode ser obtida tanto a partir da manteiga de cacau fundida quanto da transformação do polimorfo α. Uma vez formada, a forma polimórfica β′ pode permanecer estável até 28 dias se a temperatura for estabilizada a 15º C. O aumento desta temperatura ocasiona a sua transformação para a forma mais estável β (MARANGONI; MCGAULEY, 2003).
A formação destes cristais também pode ser influenciada pela presença de compostos minoritários como emulsificantes, estéres de sorbitana, ésteres de sacarose e lecitina (DOS SANTOS, 2018). Ao avaliar o efeito da adição de açúcar na cristalização de manteiga de cacau, Dhonsi e Stapley (2006) verificaram que houve uma diminuição no tempo de indução da cristalização, o que pode ser atribuído ao comportamento do açúcar em atuar como um agente de nucleação heterogênea, induzindo à formação de polimorfos instáveis.
Outra classe de aditivos que podem retardar a cristalização são os ésters de sorbitana. Este composto é obtido a partir da esterificação de sorbitol e um ácido graxo, geralmente ácido esteárico, oleico, palmítico ou láurico. Em função do grau de esterificação, é possível a obtenção de diferentes interações com os TAGs e consequentemente diferentes efeitos sobre a cristalização (SONWAI; PODCHONG; ROUSSEAU, 2017). O Tristearato de sorbitana pode retardar a transformação do cristal βV para βVI devido ao alto empacotamento de suas cadeias de carbono, que promovem uma estrutura rígida e dificultam os movimentos das moléculas de gordura. Por outro lado, os monoesteratos de sorbitana podem dificultar a transição polimórfica β`para β (GARTI; SCHLICHTER; SARIG, 1986). O efeito destes aditivos no processo de cristalização depende da similaridade da composição de ácidos graxos e TAGs entre estes aditivos e a matriz lipídica a ser utilizada (SMIT et al., 2011).
3.4 SALMONELLA
A Salmonella é uma bactéria Gram negativa, anaeróbia facultativa, pertencente à família Enterobacteriaceae, capaz de metabolizar nutrientes tanto por fermentação quanto por via respiratória. Está amplamente distribuída na natureza, por utilizar homens e outros animais como portadores, veiculando-se através da ingestão de alimentos, principalmente de origem animal como carnes, ovos e leite (BRASIL, 2011).
A salmonelose é uma doença infecciosa que representa uma preocupação global, com surtos identificados em diversos países ao redor do mundo. As infecções por esta bactéria implicam em significativa mortalidade e gastos exorbitantes para o sistema de saúde. Nos Estados Unidos estima-se que os custos diretos e indiretos somam um bilhão de dólares. No Brasil, os custos relacionados com internações por doenças transmitidas por alimentos entre os anos de 1999 a 2004 chegaram a 280 milhões de reais, sendo a Salmonella spp. o principal agente causador. Dentre os surtos em que foi possível a identificação do agente etiológico, a Salmonella spp. causou 34% (BRASIL, 2005).
Durante as décadas de 80 e 90, os produtos lácteos foram reportados em grandes surtos de salmonelose humana. Em 1984, o Canadá experimentou um grande surto de 2.700 casos confirmados de infecção por sorovar Typhimurium. No ano seguinte, o consumo de leite pasteurizado contaminado provocou surto com 16.284 casos confirmados nos Estados Unidos. No final da década de 90, ovos, frutas e legumes frescos figuraram proeminentemente como veículos da salmonelose. Embora a salmonelose seja frequentemente associada ao consumo desses tipos de alimento, o chocolate tem sido descrito como um veículo desde a década de 70 (WERBER et al., 2005; DOYLE; BEAUCHAT, 2007).
Um grande surto envolvendo o consumo de chocolate foi relatado em 1973, com mais de 200 casos no Canadá e nos Estados Unidos, dos quais 38% foram hospitalizados (D’AOUST, 1977). Em 2006, 45 casos de infecção relacionados à
Salmonella Montevideo foram reportados no Reino Unido em função do consumo de
confeitos (HARKER et al., 2014).
Dentre os diversos sorotipos de Salmonella, a subespécie entérica é comumente relacionada às Doenças Transmitidas por Alimento (DTA), sendo que
Enteritidis e Typhimurium são os principais sorovares isolados causadores de infecções
Dependendo do sorotipo, a Salmonella pode causar três tipos de doenças (SHINOHARA et al., 2008; HAMMACK, 2012):
- Febre tifoide: causada pela S. Typhimurium. Possui sintomas graves que incluem septicemia, febre alta, diarreia, vômito, dores abdominais e corporais que podem ocorrer entre 7 a 28 dias, em média 14 dias. Após a infecção, os indivíduos podem se tornar portadores por meses ou anos, constituindo então uma fonte contínua de infecção;
- Gastroenterite (Salmonelose): é provocada por diversos sorotipos e trata-se da infecção mais comum causada por Salmonella. A pessoa infectada desenvolve um quadro de infecção gastrointestinal com dores abdominais, febre, dor de cabeça, náuseas, vômitos e/ou diarreia, que pode perdurar por até três semanas;
- Febre entérica: causada pela S. Paratyphi. Possui período de incubação de 6 a 48 horas, com sintomas mais brandos que a febre tifoide, podendo desenvolver também um quadro de gastroenterite.
3.4.1 Salmonella em chocolate
A presença de Salmonella em chocolate pode estar ligada aos ingredientes provenientes do cacau. Porém a contaminação de amêndoas, nozes e cacau adicionados ao produto também pode ser responsável pelos surtos relacionados ao consumo de chocolate (WERBER et al., 2005). Durante o processamento desses tipos de produtos, a contaminação ocorre principalmente nas etapas de fermentação, secagem e armazenamento do cacau ou nos processos de secagem de amêndoas, nozes e outras castanhas (FOWLER, 2009).
As condições de processamento do cacau o tornam uma possível fonte de
Salmonella desde o início da produção. A quebra do fruto ainda no campo o expõe a
possíveis fontes de contaminação como o solo, folhas, insetos, animais, recipientes de madeira e as próprias mãos dos manipuladores (ZIEGLEDER, 2009). Durante a etapa de secagem, as amêndoas de cacau são expostas ao sol com pouco controle ambiental e o seu revolvimento é realizado, muitas vezes, com os pés dos manipuladores em contato direto sobre as sementes (GRANADOS, 2016).
Segundo Krapf e Gantenbein-Demarchi (2010), a etapa de torrefação dos grãos pode alcançar temperaturas de até 140° C. Outra etapa que envolve tratamento térmico é a conchagem do chocolate, geralmente realizada em temperaturas entre 50 e 80 °C durante período que pode variar entre 4 e 72 horas. A depender das condições de
conchagem, que são bastante variáveis em função do tipo de chocolate, dos equipamentos utilizados e da qualidade almejada, seria possível a completa inativação de microorganismos como a Salmonella. Para Comissão Internacional de Especificações Microbiológicas para Alimentos- ICMSF (1982), a torrefação é a principal barreira e, se realizada nas condições tradicionais de temperatura (105 a 150 ºC/15 minutos), pode ser suficiente para destruir microrganismos vegetativos, incluindo patógenos como a
Salmonella.
Entretanto, um estudo realizado por Nascimento et al. (2012) demonstrou que a resistência térmica da Salmonella aumenta significativamente durante o processo de torrefação. Os autores avaliaram quatro temperaturas (110, 120, 130 e 140 ºC) aplicadas em nibs e amêndoas de cacau e verificaram que a resistência térmica da Salmonella foi ligeiramente maior em nibs em comparação com amêndoas de cacau após exposição a 110, 120 e 130° C. Quando a temperatura foi elevada para 140° C, não houve diferença significativa entre as duas matrizes estudadas. A maior resistência térmica nos nibs observada em temperaturas mais baixas foi atribuída, em parte, à uma maior superfície de contato e ao maior teor de gordura presente nos nibs de cacau em relação às amêndoas.
Em ambientes com baixa atividade de água, a Salmonella promove mecanismos de defesa para manutenção das suas atividades metabólicas, como a produção de solutos como a trealose, dissacarídeo que funciona como termo-protetor e permite o crescimento em alta temperatura, manutenção do turgor das células e estabilização de proteínas (CÁNOVAS et al., 2001). Outra estratégia pode ser a manutenção das suas células em estado latente até que as condições ambientais estejam novamente favoráveis para a retomada de seu desenvolvimento (DODIER, 2015). Além disso, em alimentos com elevado teor lipídico, como amendoim e chocolate, as moléculas de gordura promovem uma proteção para essa bactéria. Desta forma, a transitar pelo trato gástrico, não é afetada pela acidez ou por enzimas digestivas, permitido sua chegada ao intestino, onde, mesmo que a dose infectante seja extremamente baixa, ocorre a colonização e o surgimento do quadro clínico ( BRASIL, 2011; D’AOUST, 1977). De acordo com Cordier (1994) as características do chocolate como a baixa atividade de água e alto teor de gordura aumentam significativamente a resistência térmica nas etapas de refino e conchagem, ou seja, após a etapa de torrefação, não há mais etapas de processamento capazes de destruir a Salmonella de forma efetiva.
Ao considerar o produto final, nenhuma medida de controle é aplicada para inibição destes patógenos como, por exemplo, o uso de conservantes. Assim, estratégias
adicionais às etapas de processamento devem ser estudadas para garantir a segurança alimentar do consumidor e a qualidade do produto.
3.5 ÓLEOS ESSENCIAIS
Os óleos essenciais podem ser obtidos através da extração de diferentes partes de plantas, ervas, especiarias ou frutas (KOTZEKIDOU; GIANNAKIDIS; BOULAMATSIS, 2008; DHIMAN et al., 2016). A composição destes óleos pode variar de acordo com o local de origem da matéria-prima, da espécie e da parte que foi utilizada para a extração, como folhas ou casca, por exemplo. Na Tabela 1 é possível observar os principais constituintes dos óleos essenciais de laranja, tomilho e capim limão. De maneira geral, apesar da diferença do local de origem entre os óleos, estes apresentam em sua composição os mesmos componentes majoritários.
Tabela 1. Composição química dos principais constituintes encontrados na literatura dos
óleos essenciais de tomilho, capim-limão e laranja.
Autor Localidade Principais constituintes Óleo essencial
(ZAMBONELLI et al., 2004)
Ravenna, Italia Thymol (30,5%); p-cymene
(39,1%); linaool (3,7%) Óleo essencial de tomilho
Drôme, França Thymol (34,7%); p-cymene
(24,8%); γ-terpinene (17,3%) Óleo essencial de tomilho
(ROTA et al., 2008)
Murcia, Espanha Thymol (57,7%); p-cymene
(18,7%); Carvacrol (2,8%) Óleo essencial de tomilho
Murcia, Espanha
Thymol (68,1%); p-cymene (11,2%);
γ(gamma)-Terpinene (4,8%)
Óleo essencial de tomilho (Thymus zygis subsp.
gracilis)
(ALVAREZ et al., 2016) Nuevo León, México
D-Limonene (91,12%);
myrcene (4,11%) Óleo essencial de laranja
(ESPINA et al., 2011) Lérida, Espanha
Limoneno (85,50%);
cis-Limonene oxide (1,03%); Óleo essencial de laranja
(BASSOLÉ et al., 2011)
Oua- gadougou, Burkina Faso
Citral (48,1%); neral (33,31%); myrecene (11,41%)
Óleo essencial de capim limão (MATASYOH et al., 2010) Kakamega, Quênia Citral (39.53%); neral (34,6%); myrecene (11%)
Óleo essencial de capim limão
Segundo Bakkali (2008), os óleos essenciais podem conter mais de 40 componentes diferentes que estão presentes em pequenas concentrações, enquanto que dois ou três constituintes formam a maior parte de sua composição química. Os autores citados na Tabela 1 demonstraram que os óleos de tomilho, capim-limão e de laranja são formados principalmente pelo Timol, Citral e D-limoneno, respectivamente. Estes compostos são formados pela combinação de duas unidades de bases de Carbono, sendo cada unidade formada por 5 carbonos. Esta organização estrutural classifica-os como monoterpenos de baixo peso molecular (BAKKALI et al., 2008). Estudos tem demonstrado que alguns destes terpenos podem apresentar atividade antimicrobiana. Fisher e Phillips (2006) indicaram que o linalol apresentou atividade antimicrobiana frente à bactérias gram positivas (L. monocytogenes, B. cereus e Staph. aureus) e gram negativas (E. coli e Camp. jejuni). Um estudo realizado por Delleau et al. (2008) verificaram que dentre 10 monoterpenos estudados na produção de biofilme atimicrobiano, o timol, o geraniol e o carvacrol foram os mais eficientes na redução do desenvolvimento de Candida albicans.
3.5.1 Aplicação de óleos essenciais para o controle microbiano
Diversos compostos encontrados em plantas e ervas têm sido amplamente estudados por demonstrarem atividade antimicrobiana e apresentarem efeitos inibitórios contra patógenos transmitidos por alimentos, sendo eles bactérias, fungos ou vírus (SWAMY; AKHTAR; SINNIAH, 2016). Estas propriedades estão relacionadas com a presença de óleos essenciais e outros metabólitos secundários presentes em diferentes partes da planta (flores, frutos, raízes, folhas) (GONÇALVES et al., 2017).
Nas últimas décadas, os óleos essenciais têm recebido especial atenção por apresentarem uma alternativa aos conservadores químicos, principalmente pela crescente busca dos consumidores por alimentos com menor quantidade de aditivos químicos e maior quantidade de ingredientes naturais. Apesar dos conservadores químicos estarem sujeitos à legislação específica e controle por órgãos de saúde, há uma preocupação constante entre os consumidores com relação à sua segurança, principalmente em relação aos que podem provocar reações adversas (AUN et al., 2011; SOLÓRZANO-SANTOS; MIRANDA-NOVALES, 2012).
Os óleos essenciais são misturas complexas que envolvem centenas de compostos voláteis e provenientes da metabolização secundária das plantas com o intuito
de proteção contra o ataque de patógenos. Desta forma, a sua composição está intimamente ligada à região da planta da qual será extraído, às condições climáticas em que se deu o crescimento e ao tipo de manejo realizado (NEGI, 2012; CALO et al., 2015). Quimicamente, estes óleos são constituídos de terpenos, álcoois, cetonas, fenóis, ácidos, aldeídos e ésteres, esses componentes podem ser divididos em dois principais grupos: compostos de terpeno e compostos aromáticos (CALO et al., 2015), nos quais a presença dos dois principais componentes pode representar até 70% da composição química (PANDEY; SINGH; TRIPATHI, 2014). Segundo Swamy (2016), a atividade antimicrobiana pode estar relacionada ao seu componente majoritário ou ao efeito sinérgico entre os componentes e depende da característica morfológica da bactéria-alvo (bactérias Gram-positivas e Gram-negativas).
Em estudo desenvolvido por Djenane (2015) avaliou-se a atividade antimicrobiana de três óleos essenciais: laranja (Citrus sinensis L.), limão (Citrus
limonum L.) e bergamota (Citrus aurantium L.) contra Staphylococcus aureus. O autor
verificou que o óleo essencial de laranja, contendo 77% de D-limoneno, apresentou menor atividade que a bergamota que continha somente 22% de D-limoneno. Porém, o óleo essencial de limão, com 50% deste constituinte, apresentou a maior atividade antimicrobiana. Essa maior atividade foi atribuída à presença de outros constituintes que exibiram um efeito sinérgico em relação à atividade antimicrobiana.
Óleos cítricos, como o de laranja, já são utilizados pela indústria de bebidas, alimentos e cosméticos pelas suas características sensoriais. Recentemente, vêm recebendo atenção como aditivos capazes de inibir microrganismos patogênicos como
Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes e Salmonella typhimurium (FISHER; PHILLIPS, 2006). Segundo Alvarez et al. (2016) a concentração
mínima inibitória pode variar de acordo com a concentração do óleo essencial durante o método de extração, indicando que maiores concentrações de óleo tem melhores efeitos antimicrobianos.
O óleo de tomilho tem sido amplamente estudado ao longo dos anos e apresenta efeito antimicrobiano comprovado sobre diversos microrganismos como
Escherichia coli, S. typhimurium, B. cereus, L. monocytogenes e S. aureus (HELANDER
et al., 1998; SHAN et al., 2007; ROLDÁN; DÍAZ; DURINGER, 2010) . Em um estudo com 15 óleos essenciais comerciais, Mith et al., (2014) apontaram que a espécie thymus
vulgaris esteve dentre os três óleos essenciais com maior atividade antimicrobiana
A fim de verificar o potencial atimicrobiano dos voláteis do capim limão, Raybaudi-Massilia et al. (2006) utilizaram uma concentração de 2 μL/mL para inativar cepas de Salmonella Enteritidis, E. coli e Listeria innocua em sucos de maçã e pêra não tratados termicamente. Estes resultados sugerem que o óleo essencial de capim limão pode representar uma boa alternativa contra microrganismos patogênicos em sucos de frutas não pasteurizados. Outra aplicação para este óleo essencial foi avaliada por Moore-Neibel et al. (2012) em folhas verdes orgânicas. Estes autores observaram que o potencial antimicrobiano do óleo de capim-limão contra Salmonella newport dependia da concentração do óleo e do tempo de tratamento. Além destes fatores, a eficácia antimicrobiana foi influenciada pela espécie de folha verde que estava sendo tratada, onde a rugosidade das folhas, presença de metabólitos antimicrobianos secundários naturais na superfície e o conteúdo de nutrientes podem ter afetado a ação microbiana do óleo essencial.
Ao serem utilizados em matrizes complexas como os alimentos, os óleos essenciais podem ter sua atividade reduzida em função do pH, atividade de água, presença de enzimas, proteínas e lipídios. Em investigação para o possível uso dos óleos essenciais de orégano e noz-moscada, Firouzi et al. (2007) indicaram por testes in vitro que os óleos essenciais possuíam atividade antimicrobiana substancial e, quando utilizados em sistemas alimentares, as quantidades necessárias poderiam dobrar de valor. Já Kotzekidou et al. (2008), ao utilizarem óleos essenciais contra patógenos inoculados em chocolate, observaram redução da carga microbiana durante o armazenamento prolongado.
3.5.2 Óleos essenciais em chocolate
Estudos recentes têm demonstrado que os óleos essenciais e seus componentes apresentam a capacidade de atuar como modificadores da cristalização da manteiga de cacau. O principal componente do óleo essencial de laranja, o D-limoneno, apresentou efeito comprovado em acelerar a transição polimórfica dos cristais βV para βVI (MIYASAKI et al., 2016).
Para verificar o impacto da adição de D-limoneno na cristalização da manteiga de cacau, Ray et al. (2012) avaliaram o comportamento de fusão, o hábito polimórfico e a microestrutura cristalina das amostras, sob suas condições de processo: sem temperagem e temperagem manual em mesa de mármore. Os resultados mostraram que o D-limomeno diminuiu a temperatura de fusão da manteiga de cacau e induziu a
cristalização isotérmica em menores temperaturas, tanto nas amostras que não foram temperadas quanto nas que foram submetidas a esta etapa. A avaliação da forma polimórfica por difração de raio-X comprovou que o D-limoneno acelerou a transformação de cristais instáveis em mais estáveis no início do processo de cristalização, bem como propiciou a transformação das formas polimórficas βV para βVI. Em estudo realizado por Do et al. (2008), verificou-se outras mudanças relacionadas à adição de D-limoneno no chocolate, como a diminuição significativa na viscosidade do chocolate após a substituição da manteiga de cacau por este monoterpeno e a diminuição do teor de gordura no estado sólido – Solid Fat Content (SFC). A correlação entre a dureza do chocolate e o SFC medido indicou que o chocolate tornou-se mais macio.
A influência de outros terpenos como o mentol e timol na manteiga de cacau foi descrita recentemente por Prinzio et al. (2019) através da teoria de equilíbrio sólido-liquido da mistura. Os autores demonstraram que apesar da diferença das estruturas moleculares entre terpenos e TAGs, extensas regiões de soluções sólidas podem ser promovidas. A formação destas regiões sólidas depende da massa molar dos TAGs e do terpeno considerado, com uma tendência a aumentar quanto maior a massa molar dos TAGs. Tendo em vista que a principal causa do fat bloom em chocolates pode estar relacionada com a migração da fase liquida para sua superfície, os monoterpenos se apresentam como uma alternativa para diminuição deste defeito no chocolate, já que aumentam soluções sólidas estáveis na gordura e desta forma evitam a migração da fase liquida.
4 MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi desenvolvido em duas etapas:
Etapa 1: Avaliação do efeito antimicrobiano de óleos essenciais in vitro e in
situ em chocolate.
Etapa 2: Avaliação do efeito tecnológico em função da aplicação de óleos essenciais em chocolate.
4.1 MATERIAL
4.1.1 Óleos essenciais
Para avaliação da atividade antimicrobiana nos ensaios in vitro foram utilizados:
- Óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris), Phytoterápica, produzido por Phytotratha Cosmeticos LTDA, Brasil, método de extração: destilação a vapor;
- Óleo de capim limão (Cymbopogan citratus), Legeé, produzido por Arte dos aromas Ind. Com. Ltda., Brasil;
- Óleo essencial de laranja doce (Citrus sinensis), Terra Flor, produzido por Terra Flor Aromaterapia, Brasil, método de extração: prensagem a frio;
- Blenda produzida com o óleo essencial de tomilho e de capim limão na proporção 3:1.
Para os ensaios do efeito antimicrobiano em chocolate foram utilizados o óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris) e a blenda de Thymus vulgaris e
Cymbopogan citratus na proporção 3:1. A concentração foi estabelecida com base na
atividade antimicrobiana dos óleos essenciais determinada neste estudo e, também, com intuito de desenvolver um produto final agradável sensorialmente.
4.1.2 Ensaios microbiológicos
Os meios de cultura utilizados para a ativação das cepas nos ensaios in vitro foram: Mueller Hinton e Luria Bertani (meio preparado com 10g de triptona, 5g de extrato de levedura, 5g de ágar e 5g de NaCl em 1000 ml de água destilada). As análises para determinação de MIC e MBC utilizaram os meios anteriormente citados e o meio Nutrient Agar e as soluções: Dimetilsulfóxido (DMSO), solução salina a 0,85%, solução de Tween
80 e TTC (2,3,5-cloreto de trifenil 43 tetrazolium). Já a determinação da Salmonella nos ensaios in vivo utilizou Caldo tripticase de soja (TSB) Buffered Peptone Water (BPW, Merck, Darmstadt, Alemanha), Xilose Lisina Desoxicolato (XLD, Merck, Darmstadt, Alemanha) e ágar tripticase de soja (Difco, Sparks, EUA).
4.1.3 Produção do chocolate
Para os experimentos, foi produzido chocolate amargo de acordo com a formulação adaptada de Dos Santos (2018): 46,6% de açúcar refinado (União, Camil Alimentos, Brasil), 43% de liquor de cacau natural (Barry Callebaut), 10% de manteiga de cacau desodorizada (Barry Callebaut) e 0,4% de lecitina de soja (SOLEC® - DuPont Nutrition & Bioscience) como emulsificante.
4.2 MÉTODOS
4.2.1 Produção da massa de chocolate
Inicialmente, todos os ingredientes foram pesados em balança eletrônica (LS2, Marte Científica, SP, Brasil). O liquor e a manteiga de cacau foram fundidos a 40 ºC e misturados gradualmente aos demais ingredientes para refino e conchagem utilizando o equipamento Melanger Spectra (Chocomaker, Brasil), até a obtenção de uma massa homogênea. O processo foi realizado em 24 horas a uma temperatura de aproximadamente 60 ºC, em função do cisalhamento da massa. Um micrômetro digital modelo 293-561-30 (Mitutoyo, Kawasaki, Japão) foi utilizado para monitorar o tamanho máximo das partículas até a obtenção de uma massa com tamanho máximo das partículas inferior a 25μm. Ao término do processo, a massa de chocolate produzida foi armazenada em embalagens de vidro com tampa em câmara para posterior utilização nas Etapas 1 e 2 do trabalho.
4.2.2 ETAPA 1: Avaliação do Efeito Antimicrobiano
4.2.2.1 Avaliação do Efeito Antimicrobiano dos óleos essenciais: ensaios in vitro e in situ
Os microrganismos utilizados no experimento foram: Salmonella
typhimurium ATCC 14028, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Escherichia coli ATCC
25922 e três cepas de Salmonella enteritidis isoladas de frango que foram gentilmente cedidas pelo Dr. Edir Nepomuceno Silva da Universidade de Campinas - UNICAMP (Campinas, SP- Brasil). Para a realização do experimento in vitro, as culturas isoladas que estavam sob refrigeração (4 ºC) foram ativadas em caldo Luria Bertani e as culturas padrões ATCC foram ativadas em meio Mueller Hinton e incubadas a 37 ºC por 24 horas. A avaliação antimicrobiana in situ foi realizada com a cepa de Salmonella
typhimurium ATCC 14028 que estava armazenada em biofreezer a -80 ºC suspensas em
pérolas de vidro com 3,5% de glicerol no Laboratório de Higiene e Legislação da Faculdade de Engenharia de Alimentos (UNICAMP). A reativação consistiu na transferência de uma pérola de vidro para o caldo TSB e incubação a 37 ºC durante 24 horas. A cultura então foi estriada em ágar inclinado de TSA e mantida a 4 ºC até o momento de sua utilização (não excedendo 20 dias de armazenamento).
b. Preparação do inóculo
Para a realização da análise, a cepa que estava sob-refrigeração (4 ºC) foi retirada com uma alça estéril de 10μl das rampas de TSA e transferida para 10 mL de caldo TSB, seguida de incubação em BOD a 37 ºC por 24 horas. Um segundo repique foi realizado transferindo 2 mL desta suspensão para 30ml de caldo TSB a 37 ºC por 24 horas. Em seguida, estes foram centrifugados a 7000 rpm/ 7min a 4 ºC em centrífuga J2-21 (Beckman, EUA). O sobrenadante foi descartado e a massa celular foi re-suspendida em solução salina a 0,85%. Para a contagem do inóculo foram realizadas diluições seriadas em posterior plaqueamento em TSA com incubação por 20- 24 horas a 37 ºC.
c. Determinação da concentração mínima inibitória (MIC)
A atividade antimicrobiana foi avaliada de acordo com o método de microdiluição em caldo descrito pelo CLSI (2012). Os inóculos das bactérias crescidas por 24 horas foram padronizados em 0,85% de solução salina a uma concentração de 108 UFC mL-1, este ajuste foi realizado em espectrofotômetro a 625 nm até a obtenção da absorbância entre 0,08 e 0,13. A partir desta, foram realizadas diluições em séries de 10 vezes até a concentração final de 104 UFC mL-1. Em paralelo, uma solução de 8 mg/mL
do óleo essencial foi preparada em meio Mueller Hinton contendo 5% dimetilsulfóxido (DMSO) e solução de Tween 80 disperso em água (0,1%).
Em placas de microdiluição com 96 poços foram acrescentados 100 µL do inóculo padronizado a 104 UFC mL-1 e 100 µL do meio de cultura (Luria Bertani para os isolados de Salmonella ou Mueller Hinton para as cepas padrões) contendo diferentes concentrações de óleo essencial em uma faixa de 2 a 0,00195 mg/mL. Para todas as amostras foram realizadas o controle negativo contendo 100 µL do óleo essencial e 100 µL do meio de cultura. E o controle positivo foi monitorado adicionando 100 µL de cada inóculo padronizado em 100 µL do meio de cultura. As placas foram fechadas e incubadas a 37 ºC durante 24 horas. Para detectar o crescimento microbiano, foi adicionado 50 µL de uma solução de TTC (2,3,5-cloreto de trifenil 43 tetrazolium) a 0,1% em todos os poços. A MIC foi determinada como a menor concentração em que o composto foi capaz de inibir o crescimento microbiano.
d. Determinação da concentração mínima bactericida (MBC)
Após a incubação e determinação da MIC, foi realizada uma nova diluição seriada dos microrganismos de acordo com os procedimentos descritos no item 4.2.1.2 (c). O novo intervalo da concentração do óleo foi estabelecido entre a concentração mínima inibitória (determinada no teste anterior) e a concentração do poço seguinte em que se percebeu a mudança de coloração pelo revelador. Para avaliar o MBC, o caldo foi retirado de cada poço das placas de microdiluição em que não houve crescimento visual e incubado em placas com o meio Luria Bertani a 37 ºC por 24 horas para isolados de
Salmonella ou em Ágar Nutriente para as cepas padrões. O MBC foi definido como a
concentração capaz de inibir completamente o crescimento microbiano.
4.2.2.2 Atividade antimicrobiana in situ no chocolate
a. Inoculação da Salmonella no chocolate
A metodologia descrita por Kotzekidou et al. (2008) foi utilizada como base para o tratamento do chocolate com os óleos essenciais selecionados, seguindo algumas modificações. Uma porção de 200 g da massa de chocolate foi derretida a 40 ºC e resfriada até 30 ºC para inoculação de uma suspensão microbiana (Salmonella typhimurium) a 2% com 1.5% de Tween 80 adicionado para melhor dispersão da solução microbiana
(NASCIMENTO et al., 2012). A concentração inicial do inóculo nas amostras foi de 106 UFC mL-1.
Para avaliação do efeito antimicrobiano in situ (aplicação no chocolate), foram utilizados os óleos essenciais de tomilho e uma blenda de tomilho : capim limão na proporção de 3:1 e uma amostra controle para a qual não houve adição de óleo essencial. Os óleos essenciais foram adicionados de acordo com sua concentração mínima bactericida (MBC) para a Salmonella typhimurium (Tabela 2). Após a homogeneização manual, as amostras foram armazenadas em bolsas NASCO em estufa incubadora BOD em temperatura constante de 25 ºC durante 0, 7, 14, 30 e 45 dias. Os tratamentos foram realizados em duplicata, totalizando 6 amostras.
Tabela 2. Tratamentos aplicados às amostras de chocolate
Identificação Tratamento
Tratamento CT Inoculação com S. typhimurium sem adição de
óleo essencial
Tratamento TM Inoculação com S. typhimurium e concentração
de óleo de tomilho igual a 1xMBC
Tratamento BL
Inoculação com S. typhimurium e concentração de blenda de óleo de tomilho e capim limão a
1xMBC
CT – Chocolate do tipo amargo sem adição de óleo essencial; TM – Chocolate do tipo amargo com adição de óleo essencial de tomilho; BL – Chocolate do tipo amargo com adição de blenda de óleo de tomilho e capim limão (3:1).
b. Determinação da Salmonella
Em cada intervalo de tempo foram retiradas amostras para a contagem de S.
typhimurium através da técnica de contagem em placas. Desta forma 10 g de chocolate
foram homogeneizados manualmente em 90 mL de leite desnatado reconstituído suplementado com Verde Brilhante a 1%. Em seguida, este material foi mantido em capela de fluxo laminar durante 60 minutos para reparação das células injuriadas, de acordo com as especificações de Silva et al., 2010. A partir da primeira diluição foram realizadas diluições seriadas (1:10) em água peptonada tamponada até a diluição 10-5. As culturas foram plaqueadas em ágar xilose lisina deoxicolato (XLD) e incubadas durante
24 horas a 37 ºC. O número das colônias foi expresso em log de unidades formadoras de colônia (UFC) por grama.
4.2.3 ETAPA 2: Avaliação Tecnológica
4.2.3.1 Caracterização da fase lipídica do chocolate
a. Preparo da amostra
Para a obtenção da fase lipídica do chocolate foi realizada uma proporção dos ingredientes que o constituem. De acordo com a formulação descrita na seção 4.1.3, o chocolate possui em sua formulação 10% de manteiga de cacau e 43% de liquor, sendo que a fase gordurosa presente no liquor corresponde a 53%. Para as amostras que apresentaram óleo essencial, foram adicionados uma concentração de 0,35 mg/g de óleo de tomilho ou 1 mg/g de blenda de óleos (tomilho : capim limão) em função da massa de chocolate considerada.
A manteiga de cacau presente no liquor foi extraída através da prensagem manual em prensa hidráulica manual (Charlott, São Paulo, Brasil). Para tanto, o liquor foi aquecido a 60 ºC em estufa TE-394/1 (Tecnal, Piracicaba, Brasil) até sua completa fusão e transferido para dois sacos de lona, um sobre o outro, para garantir a separação da manteiga dos sólidos do cacau se houver o rompimento de um deles. A prensagem foi realizada aplicando-se sequencialmente 20, 20 e 30 toneladas, respectivamente. As amostras foram coletadas em béqueres de plástico e pesadas em balança analítica para posterior homogeneização com os demais componentes da fase lipídica.
A composição da fase lipídica da amostra controle (CT) consistiu em manteiga de cacau e a manteiga extraída do liquor, enquanto que as amostras TM e BL foram acrescidas de óleo de tomilho e blenda de óleos, respectivamente. Cada amostra foi armazenada em frascos âmbar de vidro com tampa preta e batoque de plástico sob refrigeração até o momento da análise.
b. Composição em ácidos graxos
A composição em ácidos graxos foi realizada em cromatógrafo gasoso Agilent 68650 Series GC System, após a esterificação segundo a metodologia descrita por Hartmann e Lago (1973). Os ésteres metílicos resultantes foram separados de acordo
