Executores do processo autofágico

Existem seis principais conjuntos de proteínas envolvidos na execução do fluxo autofágico, desde a formação dos autofagossomos até a sua entrega aos lisossomos e posterior degradação [151, 155], como descrito a seguir:

(1) Complexo multiproteico ULK1, organizado a partir de ULK1 (unc-51-like autophagy activating kinase 1), RB1CC1 ou FIP200 (RB1-inducible coiled-coil 1), ATG13 e ATG101. Esse complexo inicia a autofagia e a etapa de nucleação do fagóforo; (2) Complexo multiproteico PI3KC3, envolvendo PI3KC3 (phosphatidylinositol 3-kinase

catalytic subunit type 3) - também conhecido como VPS34 (vacuolar protein sorting 34) - Beclin1 (BECN1) e AMBRA1 (autophagy/beclin-1 regulator). Esse complexo também participa na etapa de nucleação e formação dos fagóforos;

(3) Duas proteínas transmembrana, ATG9 e VMP1 (vacuole membrane protein 1), as quais facilitam o recrutamento de lipídeos para o PAS para participar na etapa de expansão da membrana de isolamento (fagóforo);

(4) Dois sistemas de conjugação de ubiquitina, que catalisam as ligações covalentes de ATG12 a ATG5 e ATG16L1 e de fosfatidiletanolamina (PE) à proteína MAP1LC3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, também conhecida como LC3). Esses sistemas atuam na expansão do fagóforo e maturação dos autofagossomos, além de auxiliar na fusão dos mesmos com os lisossomos;

(5) Conjunto de proteínas reguladoras da fusão entre autofagossomos e lisossomos, principalmente mediada pelas proteínas SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor-attachment receptor);

(6) Diversas enzimas lisossomais, como as catepsinas, que hidrolisam carboidratos, proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos a baixos níveis de pH, permitindo assim a reciclagem da carga autofágica e sua reutilização pela célula.

Muitas outras moléculas já foram descritas por estarem envolvidas em cada uma dessas etapas, embora não estejam tão bem caracterizadas quanto às mencionadas acima. Para uma recente revisão do assunto, referir-se a [156, 157].

46 Organelas como retículo endoplasmático, mitocôndria, complexo de Golgi e até mesmo vesículas endossomais já foram identificadas como possíveis PASs, refletindo a contribuição de diferentes fontes de membrana intracelular para a formação dos autofagossomos. Nesses sítios, sob condições de indução de autofagia, ULK1 é autofosforilada e subsequentemente fosforila ATG13 e FIP200 (complexo ULK1). ATG13, por interação com ATG14, atrai para o PAS os componentes do complexo PI3KC3, que são então ativados pelo complexo ULK1 dando início ao processo de nucleação. O complexo PI3KC3, por sua vez, atua na formação de PI3P (Phosphatidylinositol 3-phosphate) para o posterior recrutamento de proteínas que interagem com essa molécula – as WIPIs (WD repeat domain phosphoinositide-interacting) [158]. WIPIs então atraem para o PAS os membros dos sistemas de conjugação de ubiquitina - ATG12, ATG5 e ATG16L1 e LC3, ATG3 e ATG7- dando início à etapa de expansão do fagóforo [156]. O complexo ULK1 traz para o PAS ainda, via interação com ATG9 e VMP1, as vesículas que fornecem material lipídico à essa expansão [159].

As proteínas ATGs mais importantes na etapa de expansão são os membros da família ATG8, que incluem a proteína LC3. As LC3 nascentes são processadas por clivagem em sua região C-terminal mediada pela cisteína-protease ATG4, expondo um resíduo de glicina que é essencial para sua conjugação com PE [160]. Após esse processamento, elas são ativadas pela enzima ATG7 e então conjugadas à PE por ação de ATG3, convertendo-se de sua forma livremente difusa (conhecida como LC3-I) à forma lipidada ancorada à membrana do fagóforo (referida como LC3-II). Essa conjugação de PE à LC3 é auxiliada pelo complexo ATG12-ATG5, e é essencial para promover a expansão e o posterior fechamento do fagóforo, formando o autofagossomo [161]. Além do processamento C-terminal das LC3 nascentes, ATG4 também é capaz de desconjugar essas proteínas das moléculas de PE. Como a maior parte das atividades autofágicas das LC3 são atribuídas à sua conjugação com PE, essa possível desconjugação deve ser controlada, e, para funcionar adequadamente na membrana autofágica, as LC3 lipidadas devem ser protegidas de ATG4 [162, 163].

As proteínas LC3 ancoradas à membrana dos fagóforos facilitam o recrutamento da carga autofágica nos casos de autofagia seletiva. Na autofagia seletiva, a carga a ser degrada é especificamente marcada com sinais “eat-me”, que em sua maior parte representam moléculas de ubiquitina adicionadas a esse material. Essas moléculas de ubiquitina são então reconhecidas por receptores de autofagia, que vão direcionar essa carga à membrana do fagóforo por meio de sua capacidade de interação com LC3 através do domínio LIR (LC3-interacting region). Dentre os principais receptores já descritos por participar no reconhecimento e direcionamento da carga

47 autofágica estão: p62 (SQSTM1), OPTN (Optineurin), NBR1 (Neighbor Of BRCA1 Gene 1 Protein) e NDP52 (nuclear dot protein 52 kDa) [164].

Após o fechamento do fagóforo e a formação completa do autofagossomo, o mesmo sofre um processo de maturação, o qual envolve a liberação das ATGs de sua membrana externa e o recrutamento da maquinaria responsável pelo encaminhamento dos mesmos aos lisossomos e pela mediação da fusão dessas organelas. Proteínas do citoesqueleto trabalham para o encaminhar os autofagossomos à região perinuclear, onde os lisossomos estão preferencialmente localizados. Microtúbulos servem como o caminho no qual as proteínas motoras cinesinas e, principalmente, dineínas deslizam carregando os autofagossomos. Proteínas como a GTPase Rab7 funcionam como adaptadores para conectar os autofagossomos às proteínas motoras [165].

Já a maquinaria de fusão engloba principalmente: Rab GTPases, proteínas de fixação e SNAREs. Rabs, como a Rab7, servem para ativar e recrutar as proteínas de fixação do complexo HOPS (homotypic fusion and vacuolar protein sorting). Esse complexo atua para manter em proximidade as membranas das organelas a serem fundidas - autofagossomo e lisossomo - funcionando como uma ponte ente elas e, assim, dando suporte à fusão mediada pelas SNAREs [165]. SNAREs são proteínas de membrana localizadas em complexos de membrana opostos que podem interagir um com o outro. Na autofagia, as SNARES STX17 (Syntaxin 17) e SNAP29 (synaptosomal-associated protein 29) nos autofagossomos e as SNARES VAMP7 e VAMP8 nos lisossomos já foram descritas por mediar a fusão dessas organelas [154, 166].

Por fim, uma vez liberado o conteúdo dos autofagossomos no lúmen do lisossomo, as enzimas lisossomais vão então degradar e reciclar esses componentes de volta para as células. Os lisossomos contêm mais de 50 hidrolases ácidas - entre fosfatases, nucleases, glicosidades, proteases, peptidades, sulfatases e lipases – que são capazes de degradar virtualmente qualquer macromolécula celular. As proteases catepsinas B, L e D são das moléculas mais ativas na degradação da carga autofágica [167]. A figura 8 ilustra o mecanismo da autofagia e as principais moléculas envolvidas na execução de cada etapa.

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FIGURA 8.A AUTOFAGIA E SEUS EXECUTORES. A FIGURA ILUSTRA AS DIFERENTES ETAPAS DO FLUXO AUTOFÁGICO - NUCLEAÇÃO, EXPANSÃO, SELEÇÃO DA CARGA, FECHAMENTO E MATURAÇÃO, ENTREGA AOS LISOSSOMOS E DIGESTÃO ENZIMÁTICA -, BEM COMO AS PRINCIPAIS MOLÉCULAS ENVOLVIDAS EM CADA UMA DELAS.