EXEMPLOS DE UTILIZAÇÃO DE PLANEJAMENTOS ESTATÍSTICOS

Cockshott e Sullivan (2001) utilizaram planejamentos estatísticos seqüenciais para a otimização de um meio para a produção de equinocandina B por Aspergillus nidulans em fermentação submersa. O Quadro 4 apresenta um resumo dos planejamentos experimentais utilizados para a otimização do meio.

Na primeira etapa foi utilizado um planejamento Plackett Burman com 20 tratamentos e 3 pontos centrais, sendo avaliadas 15 variáveis. Na seqüência, as cinco variáveis de maior significância foram utilizadas em um planejamento fatorial fracionário 2⁵ com 2 pontos centrais, em 2 blocos de ½ fração, totalizando 18 experimentos em cada bloco. As variáveis do PB não significativas ou com efeitos negativos foram ignoradas (COCKSHOTT e SULLIVAN, 2001).

No caso dos planejamentos Plackett Burman, o efeito da curvatura indica como as variáveis precisam ser direcionadas para atingirem a região de ótimo. A metodologia de superfície de resposta é apropriada quando a região de ótimo é identificada. Com a obtenção destes dados, o pesquisador pode aproximar a função resposta para um modelo de 2ª ordem, as condições de ótimo podem ser determinadas experimentalmente e confirmadas através de experimentação. A condição necessária para um único ponto de máximo é a presença de efeitos quadráticos negativos (COCKSHOTT e SULLIVAN, 2001).

Quadro 4 Resumo dos planejamentos experimentais utilizados na otimização do meio para a produção de equinocandina B por A. nidulans em fermentação submersa

Planejamentos Objetivo

Plackett Burman

Avaliar o impacto individual de cada componente do meio sobre a produção de equinocandina B objetivando focar os

futuros experimentos nos componentes críticos do meio de cultivo

Planejamento fatorial completo 2⁵

Quantificar os efeitos individuais e de interação dos 5 fatores críticos a fim de

localizar a região de ótimo

Otimização

Aumentar o planejamento fatorial completo com os pontos axiais e pontos

centrais adicionais a fim de completar o planejamento de superfície de resposta e

confirmar a região de ótimo

Confirmação

Utilização da análise de curvatura para investigar regiões de ótimo promissoras

como determinado pela superfície de resposta

Fonte: COCKSHOTT e SULLIVAN (2001)

Se a curvatura do estágio fatorial é insignificante e os fatores lineares são significativos, indica que a superfície de resposta é linear e a região de ótimo está fora da região de estudo. Nesta situação deve-se buscar a região de ótimo através do método do caminho ascendente. Este método utiliza a magnitude e o sinal dos efeitos lineares para determinar a região de onde se obterão as respostas máximas. O caminho dos novos experimentos inicia no centro do espaço experimental atual em direção externa a este. As

respostas destes experimentos são plotadas até a identificação do centro de uma nova região que conterá a região de ótimo (COCKSHOTT e SULLIVAN, 2001).

Na análise do experimento fatorial 2⁵, os autores obtiveram p=0,121 para a curvatura do modelo e várias interações de variáveis significativas. Neste, caso, como o efeito da curvatura não foi significativo, porém indicativo de curvatura e as interações foram significativas, a presença da curvatura é evidente. Neste caso, o método do caminho ascendente é inapropriado, sendo utilizado o método de curvatura ascendente, que inclui pontos axiais e novos pontos centrais ao planejamento. Assim, totalizando, os autores utilizaram um planejamento fatorial completo com 32 experimentos, somados a 7 pontos centrais e 10 pontos axiais (2 por variável) (COCKSHOTT e SULLIVAN, 2001).

O efeito das interações entre variáveis (% óleo de girassol, % peptona, % glicose, período de incubação e velocidade de agitação) sobre a produção de lipases por Aspergillus carneus foi estudado por Kaushik et al. (2006). Cada variável foi avaliada em três níveis (-1,0,+1) através de um planejamento de face centrada, num total de 32 experimentos. A resposta utilizada foi a máxima atividade lipolítica obtida. A modelo gerado está apresentado na Equação 1, sendo: Y a resposta predita pelo modelo; β0 a média; β1, β2, β3, β4 e β5 os coeficientes lineares; β11, β22, β33, β44 e β55 os coeficientes quadráticos; β12, β13, β15, β23, β24, β25, β34, β35 e β45, os coeficientes de interação. Os níveis das variáveis foram gerados a partir das melhores respostas obtidas em experimentos prévios realizados variando-se uma variável por vez, sendo mostrados na Tabela 2.

DE . BE . CD . BE . BD . BC .

AE . AD . AC . AB . E . D . C .

B . A . E . D . C B . A . Y

45 35

34 25

24 23

15 14

13 2 12

2 55 2 44

33

22 2 11 2

5 4 3 2 1 0

β + β + β

+ β + β

+ β

+ β

+ β

+ β

+ β + β + β + β

+ β + β + β + β + β + β + β + β

=

(1)

Tabela 2 Níveis das variáveis utilizadas na otimização da produção de lipase por A. carneus através de um Planejamento de Face Centrada

Variável/nível -1 0 +1

Óleo de girassol (%) 1 1,5 2

Peptona (%) 0,2 0,5 0,8

Glicose (%) 0,8 1,0 1,2

Agitação (min^-1) 200 250 300

Tempo de incubação (h) 72 96 120

Fonte: KAUSHIK et al (2006)

A atividade lipásica máxima obtida na otimização foi de 12,7 U mL^-1 em 96 h de incubação, utilizando-se 1% de óleo de girassol, 0,8% de glicose, 0,8% de peptona e

agitação de 200 min^-1, em comparação com 7,2 U mL^-1 obtida nos experimentos variando-se uma variável por vez. Para validação do modelo foram realizados 6 experimentos com diferentes níveis de óleo de girassol, glicose e velocidades de agitação e mantendo-se fixas a concentração de peptona em 0,8% e o tempo de incubação em 96 h, visto estas variáveis não terem apresentado significância estatística em um intervalo de confiança de 95%.

Foram confirmados os melhores níveis das variáveis significativas conforme o modelo quadrático gerado, sendo a máxima atividade enzimática de 12,67 U mL^-1 (KAUSHIK et al., 2006).

Vohra e Satyanarayana (2002) estudaram a produção de fitase por Pichia anomala através da metodologia de superfície de resposta. O meio de cultivo utilizado foi primeiramente otimizado variando-se uma variável por vez. As variáveis experimentais foram as concentrações de glicose (A) e extrato de carne (B) e a concentração inicial de inóculo (C). Utilizou-se um DCCR composto por 8 experimentos (2³) + 6 pontos axiais e 6 pontos centrais. O modelo de 2ª ordem gerado está apresentado na Equação 2. Os coeficientes de primeira e segunda ordem e de interação encontrados são apresentados na Tabela 3. Os parâmetros A, B e B2 foram significativos no modelo. A validação do modelo foi realizada em um experimento com concentração de glicose (A) de 0,5%, extrato de carne (B) de 0,1% e concentração inicial de inóculo de 1,5%, sendo obtida uma atividade enzimática de 139 U g^-1. O valor de atividade enzimática predito pelo modelo nestas condições foi de 131 U g^-1.

BC . AC . AB . C . B . A

. C . B . A .

Y =β₀+β₁ +β₂ +β₃ +β₁₁ ²+β₂₂ ²+β₃₃ ²+β₁₂ +β₁₃ +β₂₃ (2)

Tabela 3 Coeficientes de primeira e segunda ordem e de interação para o modelo de 2º ordem gerado na otimização da produção de fitase por Pichia anomala através da

metodologia de superfície de resposta

ββββ0 ββββ1 ββββ2 ββββ3 ββββ11 ββββ22 ββββ33 ββββ12 ββββ13 ββββ23

131,44 -3,02 -71,44 12,75 0,1 8,86 -0,5 2,09 -2,02 -2,41

Fonte: VOHRA e SATYANARAYANA (2002)

Elibol e Ozer (2002) estudaram os efeitos da concentração inicial de glicose e da concentração de óleo de milho como indutor da produção de lipase por Rhizopus arrhizus através de um planejamento composto central rotacional, cujos níveis reais e codificados estão apresentados na Tabela 4. A avaliação estatística do planejamento gerou um modelo de 2ª ordem com R² de 0,98. A máxima atividade lipolítica obtida foi de 300 µM min^-1 utilizando-se 1 g L^-1 de glicose e 2,7 g L^-1 de óleo de milho.

Kalil et al. (2000) estudaram a otimização do rendimento e produtividade de uma fermentação alcoólica contínua. Primeiramente, um planejamento Plackett Burman de 20 experimentos foi utilizado para a seleção de variáveis significativas no processo, tendo sido avaliadas 10 variáveis. Destas, cinco apresentaram significância estatística sobre o processo, sendo estudadas, em uma segunda etapa, a partir de um delineamento composto central ortogonal composto por 32 experimentos referentes ao planejamento fatorial completo (2⁵), 10 experimentos referentes à adição dos pontos axiais e 1 experimento no ponto central (somente um ponto central foi adicionado visto ser um trabalho de simulação).

Tabela 4 Níveis reais e codificados das variáveis utilizadas na otimização da produção de lipase por Rhizopus arrhizus

Variáveis/Níveis -αααα -1 0 +1 +αααα

Glicose (g L^-1) 1 3,25 5,5 7,75 10

Óleo de milho (g L^-1) 1 5,75 10,5 15,25 20

Fonte: ELIBOL e OZER (2002)

Souza et al. (2006) realizaram a otimização da composição de um meio de cultivo para a produção de transglutaminase de Bacillus circulans BL32. Sete componentes do meio de cultivo foram testados em duas concentrações através um planejamento Plackett Burman de 12 experimentos. Dos sete componentes estudados, apenas 2 apresentaram-se com significância estatística (p<0,05) sobre a produção de transglutaminase. Em uma segunda etapa, a concentração destes componentes foi estudada através de um Delineamento Composto Central Rotacional de duas variáveis, num total de 12 experimentos.

Burkert et al. (2004) otimizaram a produção de lipase pelo fungo Geotrichum sp.

através de técnicas seqüenciais de planejamento experimental. As variáveis de estudo foram a concentração de glicose, a concentração da água de maceração de milho, a concentração da fonte de nitrogênio (nitrato de amônio) e o tipo de óleo adicionado como indutor (óleo de soja ou azeite de oliva na concentração de 1%). Foram realizados 5 planejamentos experimentais, sendo o primeiro um planejamento fatorial completo tipo 2⁴ com seis pontos centrais, onde a glicose não apresentou efeito significativo sobre a produção da enzima, sendo excluída dos demais planejamentos. Dois planejamentos do tipo 2³ com 6 pontos axiais e 3 pontos centrais foram realizados utilizando-se como variáveis as concentrações de azeite de oliva, nitrato de amônio e água de maceração de milho. O mesmo foi realizado utilizando-se o óleo de soja como indutor. A composição ótima do meio de cultivo foi obtida com concentrações de nitrato de amônio entre 2,1% e 2,5%, com 13% a 15% de água de maceração de milho e 0,6% de óleo de soja, obtendo-se atividade lipásica

de 20 U mL^-1. Utilizando-se azeite de oliva como indutor, o meio ótimo apresentou 0,8 a 1%

de nitrato de amônio, 13 a 15% de água de maceração de milho e 0,6% de azeite de oliva, alcançando-se uma atividade enzimática de 17 U mL^-1.