MATERIAL E MÉTODOS

4.7.4.1. Microrganismos, manutenção e preparo do inóculo

Duas cepas de Aspergillus sp. (O-8 e O-4), foram isoladas de solo contaminado por óleo diesel e selecionadas como boas produtoras de lipases via fermentação submersa e em estado sólido, respectivamente.

Após isolamento, os microrganismos foram mantidos em tubos com ágar-batata-dextrose (ABD) inclinado sob refrigeração a 4°C, sendo realizadas repicagens periódicas a cada 3 meses. O preparo do inóculo para as fermentações foi realizado através da inoculação dos fungos em placas de Petri contendo 30 mL de meio ABD solidificado e incubação a 30ºC por 5 dias.

4.7.4.2. Produção de lipases e biossurfactantes via fermentação submersa

O meio de cultivo foi preparado utilizando-se 10% (m/v) de farelo de trigo, o qual foi submetido a cozimento a 100ºC durante 30 min em 50% do volume total de água destilada.

Após, o meio foi filtrado e adicionado de 10% (v/v) de solução salina, 45 g.L^-1 de extrato de

levedura e 20 g.L^-1 de óleo de soja como indutor. A solução salina continha 2 g.L^-1 de KH₂PO₄, g.L^-1 de MgSO₄ e 10 mL L^-1 de solução traço, a qual era composta por 0,63 mg.L^-1 de FeSO4.7H2O, 0,01 mg.L^-1 de MnSO4 e 0,62 mg.L^-1 de ZnSO4 (BERTOLIN et al., 2001). O meio líquido foi autoclavado e o pH do meio ajustado a 7,0 utilizando-se soluções de HCl 1,5 M ou NaOH 1 M.

A produção dos biocompostos foi realizada em erlenmeiers de 250 mL com volume inicial de meio de 100 mL, num total de 14 experimentos. A inoculação dos meios foi realizada utilizando como inoculo uma área circular de 20 mm de diâmetro de ABD contendo esporos do fungo O-8. Após a inoculação, os cultivos foram incubados durante 7 dias a 30°C com agitação de 120 min^-1. A cada 24 h foi interrompida a fermentação em 2 erlenmeiers e os meios utilizados para as determinações analíticas.

4.7.4.3. Produção de lipases e biossurfactantes via fermentação em estado sólido

O meio de cultivo para a fermentação em estado sólido foi preparado com 85,7% de farelo de soja e 14,3% de casca de arroz, utilizada para aumentar a porosidade do meio e facilitar a transferência de oxigênio. O meio foi adicionado de 71% (v/p) de solução salina (2 g.L^-1 de KH2PO4, g L^-1 de MgSO4 e 10 mL L^-1 de solução traço, a qual era composta por 0,63 mg L^-1 de FeSO4.7H2O, 0,01 mg L^-1 de MnSO4 e 0,62 mg L^-1 de ZnSO4 e água destilada até o volume de 1 L), a fim de fornecer micronutrientes (BERTOLIN et al., 2001). O meio de cultivo foi autoclavado a 103 kPa por 20 min, sendo posteriormente adicionado de 2% de azeite de oliva e 2% de nitrato de sódio como fonte de nitrogênio. O pH foi corrigido até 4,5 a partir da adição de uma solução 1,5 M de H₂SO₄ e a umidade foi ajustada até 60% pela adição de água destilada estéril.

Os experimentos foram realizados em erlenmeiers de 300 mL contendo 50 g de meio e inoculados com 2,5 mL de uma suspensão de esporos a fim de obter-se uma concentração inicial de esporos no meio de cultivo de 2.10⁶ esporos g^-1. Foram incubados 14 erlenmeiers a 30°C, sendo a cada 48 h interrompida a fermentação em dois erlenmeiers e os farelos utilizados para as determinações analíticas.

4.7.4.4. Determinações analíticas

4.7.4.4.1. Obtenção dos extratos

Os meios da fermentação submersa foram centrifugados para a separação das células fúngicas e os extratos obtidos utilizados para as determinações analíticas.

Os farelos da fermentação em estado sólido foram submetidos à extração para a determinação das atividades lipolíticas e emulsificantes. Para a determinação da atividade lipolítica, 1 g de farelo fermentado foi extraído com 10 mL de solução tampão fosfato 0,2 M pH 7,0 em banho-maria a 160 min^-1 durante 30 min a 37ºC, com posterior filtração para separação dos sólidos. Para a determinação da atividade emulsificante, 5 g de farelo fermentado foram extraídos com 30 mL de água destilada a 90ºC seguido de extração em banho-maria a 50ºC durante 30 min,com posterior filtração e centrifugação para a separação dos sólidos e esporos.

4.7.4.4.2. Estimativa do crescimento fúngico

Os meios da fermentação submersa foram centrifugados para separação dos sólidos. O sobrenadante foi separado para a determinação de lipases e biossurfactantes e os sólidos foram adicionados em cápsulas de alumínio taradas e secas em estufa a 70°C durante 24 h para a determinação da concentração celular (g L^-1).

Os farelos obtidos durante a fermentação em estado sólido foram submetidos à determinação de proteínas por Kjeldhal (A.O.A.C., 1995) a fim de estimar o crescimento fúngico.

4.7.4.4.3. Determinação da atividade lipolítica (AL)

Na determinação da AL foi adotado o método descrito por Burkert et al. (2004), o qual se baseia na titulação com NaOH 0,01 M dos ácidos graxos liberados pela ação da enzima lipase, presente no extrato enzimático, sobre os triacilgliceróis do azeite de oliva emulsionados em goma arábica.

4.7.4.4.4. Determinação da atividade emulsificante

As atividades emulsificantes óleo em água e água em óleo foram determinadas segundo metodologia proposta por MARTINS et al. (2006), utilizando-se 3,5 mL de extrato e 2 mL de óleo de soja. A mistura foi agitada em agitador vórtex a 700 min^-1 por 1 min. Após 60 min de repouso foi lida a absorbância do meio emulsificado óleo/água em espectrofotômetro a 610 nm. A leitura foi realizada diminuindo-se da absorbância do branco, obtida a partir da leitura da amostra. Dessa forma, obteve-se a atividade emulsificante óleo em água através da Equação 1. Após 24 h de repouso foi realizada a leitura da altura da emulsão água/óleo formada e da altura total (altura da emulsão mais altura da camada remanescente de óleo), gerando a atividade emulsificante água em óleo de acordo com a

Equação 2. Dois brancos foram realizados, utilizando água no lugar da amostra e os extratos obtidos a partir dos meios de cultivo não fermentados.

D ).

ABS ABS

(

AE_O/A = _amostra− _branco (1)

D ).

E E

(

AE_A/O = _amostra− _branco (2)

Onde:

AE = atividade emulsificante (UE);

O/A = óleo em água;

A/O = água em óleo;

ABS = absorbância;

E = relação centesimal entre a altura da emulsão água/óleo e a altura total;

D = diluição da amostra em água.

4.7.4.4.5. Determinação da tensão superficial

Os extratos obtidos durante a fermentação submersa foram utilizados para a determinação da tensão superficial em tensiômetro (Kruss Processor Tensiometer K-6, Alemanha) usando o método do anel, sendo a tensão medida com a amostra em contato com o ar (COSTA et al., 2006; RODRIGUES et al., 2006b). Neste método, um recipiente contendo a amostra a ser analisada é suspendida até que o contato com a superfície do anel seja registrado. O contato da amostra com o anel é desfeito, de maneira que o filme líquido produzido abaixo do anel é alongado, sendo determinada a força máxima necessária para a extensão do filme, obtendo-se a tensão superficial (RODRIGUES et al., 2006b).

4.7.4.4.6. Determinação da atividade antimicrobiana

O potencial antimicrobiano dos extratos obtidos durante a fermentação submersa foi determinado utilizando-se como microrganismo indicador o Staphylococus aureus ATCC 25923. A cepa foi repicada em 50 mL de meio BHI (Infusão cérebro coração) estéril e incubada por 24 h. A suspensão de microrganismos obtida foi diluída com BHI estéril até que apresentasse absorbância 0,20 em comprimento de onda 610 nm. Em tubos de ensaio estéreis, adicionaram-se 4 mL da suspensão diluída do S. aureus e 1 mL do extrato da fermentação previamente esterilizado. Os tubos foram incubados a 37ºC durante 12 h, sendo lida a absorbância a 610 nm a cada hora. Foram realizadas triplicatas do ensaio para cada extrato obtido durante o processo fermentativo. Como controles, foram realizados dois

ensaios: a) 3 tubos contendo 4 mL de suspensão do microrganismo e 1 mL de meio de cultivo não fermentado e b) 3 tubos contendo 4 mL de BHI estéril e 1 mL de água destilada estéril. Os dados de absorbância versus tempo foram utilizados para o cálculo do potencial antimicrobiano (PA), conforme a Equação 3.

100 ABS .

ABS (%) ABS

PA

controle extrato controle −

= (3)