Dos tr…s sensores implantados nos animais do grupo Controle 2, um apresentou problemas com a coleta de dados (animal 10). Por isso, estes dados n€o foram incluˆdos nos resultados. A figura 17 mostra termogramas de todos os animais ao longo dos 31 dias de experimento ao passo que a figura 18 mostra a temperatura m‚dia ao longo de 24 horas nas
Figura 16. Actogramas duplos de animais do experimento 3. (A) Animal submetido ƒ restri•€o de glicose na etapa de claro-escuro e com alimenta•€o ƒ vontade na etapa de escuro constante. (B) Animal mantido com alimenta•€o ƒ vontade durante o claro-escuro e submetido ƒ restri•€o de glicose em escuro constante. (C) Animal submetido ƒ restri•€o de ra•€o em claro-escuro e escuro constante. Em claro-escuro, a restri•€o alimentar teve inˆcio no dia 11 e fim no dia 20. Em escuro constante, o inˆcio foi no dia 42 e o fim, no dia 51. (D) Atividade antecipat†ria m‚dia nos primeiros e “ltimos cinco dias de restri•€o alimentar. * p < 0,05, *** p < 0,001, #p = 0,07, teste post-hoc de Tukey ap†s ANOVA de medidas independentes. Na figura A, as •reas em vermelho e verde indicam o perˆodo de 24 h utilizado para o c•lculo da atividade antecipat†ria nos blocos 1 e 2 da restri•€o alimentar, respectivamente (ver figura D). RG, restri•€o de glicose; RR, restri•€o de ra•€o; EE, escuro constante.
diferentes etapas do experimento. Em ambas as figuras, é possível observar o aumento gradual da temperatura central à medida que o horário de alimentação (glicose ou ração) se aproxima. Tal antecipação da temperatura surgiu de forma gradual nos primeiros dias de restrição alimentar (Fig. 18A-G). Após a etapa de restrição, a temperatura ressincroniza gradualmente ao ciclo claro-escuro (Figs. 17 e 18I-M). No segundo dia de privação (dia 31), a temperatura do grupo Experimental foi muito similar àquela do grupo Controle 1 antes de HZ 06 (horário de alimentação durante a etapa de restrição alimentar). No mesmo momento, o grupo Controle 2 mostrou um aumento gradual. Entretanto, isto foi devido aos dados de um animal. Pelo fato de termos apenas dois animais neste grupo, não podemos afirmar que este aumento é uma persistência do ritmo.
As figuras 19 e 20 mostram as concentrações de glicose nas quatro coletas realizadas. A primeira figura enfatiza o efeito da condição experimental, enquanto a segunda destaca o efeito das diferentes etapas do experimento em cada um dos grupos. No dia 10, nenhuma diferença foi encontrada entre ou dentro dos grupos (Fig. 19A). No quarto dia de restrição alimentar, os níveis de glicose foram visualmente baixos em HZ 05 nos grupos Experimental e Controle 2, comparados com o grupo Controle 1. Em HZ 08 e 11, os níveis de glicose se mostraram elevados nos grupos sob restrição alimentar, sendo aqueles do grupo Experimental, mais altos (Fig. 19B). No nono dia de restrição, quando a antecipação ao horário de alimentação está estabelecida, os níveis de glicose do grupo Controle 2 se mantiveram estáveis em todos os HZs em comparação com o quarto dia de restrição (Fig. 20). No grupo Experimental, os níveis de glicose em HZ 08 e 11 apresentaram um claro declínio em relação ao quarto dia de restrição (figs. 19C e 20B). Não encontramos diferenças entre os grupos no segundo dia de privação (Fig. 19D). Neste, os níveis de glicose ficaram em torno de 100 mg/dL, valor similar àqueles observados em HZ 05 para os grupos em restrição no dia 23 (ver Fig. 20).
Figura 17. Termogramas duplos. Ratos 1 a 4, grupo controle 1. Ratos 5 a 8, grupo experimental. Ratos 9 e 11, grupo controle 2. Na etapa de restrição alimentar (dias 15-24), a disponibilidade de glicose ou ração é representada pelo retângulo vertical em preto. A escala do gráfico é de 34 a 39 °C. Os tons mais escuros de cinza representam temperaturas mais altas.
Figura 19. Concentração de glicose. * p < 0,05, ** p< 0,01, teste post-hoc de Tukey após ANOVA de medidas independentes (grupos). # p < 0,05, &p < 0,01, teste post-hoc Tukey após ANOVA de medidas repetidas (hora do zeitgeber 05 comparado com hora do zeitgeber 08 e 11)
Figura 18. Temperatura corporal representada ao longo de 24 horas em todas as etapas do experimento. Durante a linha de base (A e B), é possível observar o ritmo sincronizado ao ciclo claro-escuro. A partir do dia 15, podemos observar o surgimento gradual da antecipação ao horário de alimentação (área tracejada). Após o fim da restrição alimentar, a temperatura ressincroniza ao ciclo claro-escuro (I-M). No segundo dia de privação (N), a temperatura apresenta um declínio nas primeiras horas da fase de claro. A partir de ZT 05 a mesma mostra uma ascensão, que se mantém durante o restante da fase de claro.
6. DISCUSSÃO
Nós demonstramos que a ingestão de glicose em horários fixos durante 10 dias é uma pista temporal suficiente para gerar atividade antecipatória em ratos. A persistência da antecipação observada no experimento 1 indica a natureza endógena do comportamento.
A atividade antecipatória foi evidente tanto em claro-escuro quanto na condição que denominamos de escuro constante. Entretanto, pelo fato de alguns animais não terem apresentado um claro ritmo em livre-curso, suspeitamos que os animais não estavam Figura 20. Concentração de glicose. (A) Grupo controle 1 (Ad lib). (B) Grupo experimental (RG). (C) Grupo controle 2 (RR). * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, # 0,05 < p < 0,08, teste post- hoc de Tukey após ANOVA de medidas repetidas.
realmente em escuro constante. É possível que o ambiente não estivesse completamente isolado da iluminação externa, o que explicaria nossas observações. Esta condição poderia ser denominada de claro-escuro de baixa intensidade. Nesta situação, observamos que os animais sob restrição temporal de glicose mostraram maior atividade antecipatória na média dos últimos cinco dias de restrição do que os animais sob restrição temporal de ração. Além disso, em escuro constante (ou claro-escuro de baixa intensidade), era impossível que o início da janela de alimentação coincidisse exatamente com HC 06 para todos os animais de um grupo, uma vez que os mesmos apresentaram períodos endógenos diferentes. Diante disto, a janela de alimentação estava no dia subjetivo, mas para alguns animais começava antes de HC 06 e para outros, depois. Com base nos períodos endógenos dos animais, a janela de alimentação para o grupo Experimental foi estabelecida entre 16h00 e 19h00 e para o grupo Controle 2, entre 12h00 e 15h00. Uma possível razão para os animais em restrição de glicose apresentar maior nível de antecipação seria o efeito da entrada do experimentador na sala às 15h00 para a retirada da ração do grupo Controle 2. Este era o momento em que os animais do grupo Experimental exibiam atividade antecipatória. O ruído da entrada na sala para a retirada da ração pode ter sido um estímulo que aumentou o estado de alerta dos animais e conseqüentemente, a locomoção.
A ingestão aumentou gradativamente em ambos os grupos submetidos à restrição alimentar (Fig. 14A). Contudo, devido ao fato de a ração conter maior conteúdo calórico que a solução de glicose utilizada (3,5 kcal/g e 2 kcal/ml, respectivamente), os animais em restrição de glicose ingeriram diariamente menos calorias que os animais em restrição de ração (Fig. 14B). Stephan (1997) utilizou um protocolo de atraso de fase do horário de alimentação para investigar a importância da quantidade de calorias ingeridas na expressão da atividade antecipatória ao alimento em ratos. Após a sincronização ao horário de alimentação, este foi atrasado em 8 horas. A magnitude dos atrasos de fase da atividade antecipatória foi
influenciada pela quantidade de ração oferecida (0, 2, 6 ou 16 g) e pela ingestão nos dois primeiros dias do novo horário de alimentação. Além disso, utilizando o mesmo protocolo, ele confirmou as observações de outros investigadores (Mistlberger & Rusak 1987) de que a quantidade calórica, mas não a distensão gástrica, é determinante no ajuste do oscilador sincronizado por alimento. Com base na quantidade de ração ingerida, Stephan calculou que um mínimo de 22 kcal é necessário para o ajuste do oscilador. Nossos resultados indicam que talvez esse limiar calórico seja um pouco mais baixo. Os animais em restrição de glicose no presente estudo exibiram atividade antecipatória visualmente evidente entre o quarto e o quinto dia de restrição. Nos dias imediatamente anteriores, a ingestão calórica foi por volta de 15 kcal.
Estudos utilizando regimes de alimentação com dieta hipocalórica (50 a 75 % da quantidade de ração ingerida diariamente em condições de alimentação à vontade) mostram que ratos e camundongos exibem atividade antecipatória e mostram avanços significativos no início da atividade noturna após serem submetidos ao escuro constante. Além disso, quando este regime é empregado nessa condição de iluminação o ritmo de atividade se torna sincronizado ao horário de alimentação (Challet et al. 1998; Caldelas et al. 2005). Adicionalmente, este esquema de alimentação provoca alterações nos mecanismos celulares e moleculares do núcleo supraquiasmático e na curva de resposta de fase à luz (Andrade et al. 2004; Caldelas et al. 2005; Mendoza et al. 2005; Mendoza et al. 2007). A diferença entre um regime de restrição temporal da alimentação e um regime de dieta hipocalórica é a quantidade de alimento oferecida, e conseqüentemente, a quantidade calórica ingerida. Num esquema de restrição temporal, quanto maior a janela de disponibilidade de alimento, maior a quantidade de alimento ingerida. No regime de dieta hipocalórica, a quantidade de alimento é fixa, determinada pelo pesquisador. A quantidade de calorias parece ser o fator que determina o efeito que o regime de dieta hipocalórica tem sobre o funcionamento do núcleo
supraquiasm•tico (Froy et al. 2008; Mendoza et al. 2008). Neste sentido, o resultado observado no presente estudo de que alguns animais do grupo experimental (restri•€o de glicose) n€o exibem apenas atividade antecipat†ria mas mostram aparente sincroniza•€o dos ritmos de atividade e temperatura de forma “completa” (Figs. 9 e 17) e alguns dias de transientes ap†s o fim do regime de alimenta•€o na etapa de escuro constante (Fig. 16) indica um possˆvel efeito na oscila•€o do n“cleo supraquiasm•tico. Efeito este que poderia ser explicado pela quantidade reduzida de calorias ingeridas pelos animais.
Uma possˆvel via de sincroniza•€o alimentar para o n“cleo supraquiasm•tico poderia existir atrav‚s do n“cleo arqueado no hipot•lamo. Nesta regi€o, neur—nios produtores de neuropeptˆdeo Y e horm—nio relacionado ao Agouti (reconhecidos por sua fun•€o na estimula•€o da ingest€o) s€o alvos da a•€o de v•rios sinais humorais perif‚ricos envolvidos no controle da ingest€o (Coppola & Diano, 2007) e especificamente, s€o inibidos por altas concentra•‡es de glicose (Burdakov & Gonz•lez 2009). Conex‡es recˆprocas entre o n“cleo supraquiasm•tico e o n“cleo arqueado foram descritas recentemente (Yi et al. 2006). Tendo em vista a fun•€o do n“cleo arqueado na regula•€o da ingest€o de alimento (Coppola & Diano, 2007), assume-se que tal conex€o deva servir para comunicar informa•€o a respeito do estado energ‚tico do organismo. A liga•€o entre o n“cleo arqueado e o n“cleo supraquiasm•tico constituiria ent€o uma via de sincroniza•€o para o “ltimo.
Com rela•€o ao peso corporal, os animais em restri•€o de glicose foram os que tiveram uma perda de peso consider•vel. Os animais do grupo Controle 1 (Ad lib) ganharam peso ao longo dos 10 dias da etapa de restri•€o alimentar. Por outro lado, os animais do grupo Controle 2 tiveram uma ligeira perda de peso durante esta etapa (Fig. 15). Espera-se que animais em restri•€o alimentar tenham perda de peso, como foi observado no presente estudo. A perda de peso mais acentuada no grupo Experimental ‚ provavelmente devida ƒ baixa quantidade de calorias ingeridas pelos animais, como discutido anteriormente.
A medida mais comumente utilizada em estudos de sincronização por alimento é a locomoção numa roda de atividade. Em ratos sob restrição alimentar no meio da fase de claro, por exemplo, é observado um aumento substancial da locomoção na roda de atividade nas horas que precedem a alimentação, uma diminuição da atividade durante a janela de alimentação, e novamente, alto nível de atividade no início da fase de escuro. Os sensores por infravermelho utilizados em nosso experimento detectam qualquer tipo de movimento (locomoção, alimentação, catação), o que leva a um padrão de atividade mais distribuído ao longo das 24 horas. Esta é a diferença entre as medidas feitas com roda de atividade e com sensores de detecção de movimento. Contudo, as características principais como antecipação, diminuição da atividade durante a janela de alimentação e aumento no início da fase de escuro são observadas neste (ver Fig. 12B) e em outros trabalhos (Mistlberger et al. 2009c) que utilizam sensores de movimento. Assim como a atividade motora, o ritmo de temperatura central foi sincronizado pela restrição de glicose e ração, apresentando um aumento gradual antes do horário de alimentação em ambas as condições. O nível de atividade antecipatória e o padrão circadiano de atividade e temperatura exibido pelos animais em restrição de glicose foi extremamente similar àquele exibido pelos animais com restrição de ração, indicando fortemente que o que medimos foi atividade antecipatória ao alimento. Ainda com relação à temperatura central, sabe-se que a privação alimentar provoca a diminuição do mínimo de temperatura em ratos, o que provavelmente está relacionado com a diminuição da produção de calor devido ao metabolismo (Yoda et al. 2000). No presente estudo, a diminuição do mínimo de temperatura foi observada tanto nos dias de restrição alimentar quanto nos dias de privação. No dia 31, segundo dia de privação, isto pode ser observado nas primeiras horas da fase de claro (Fig. 18N). Neste dia, entretanto, fizemos medições da concentração de glicose nas fases de HZ 05, HZ 08, e HZ 11, o que provocou um mascaramento positivo da atividade
motora e da temperatura, este último provavelmente devido ao aumento na produção de calor pela atividade.
Mistlberger et al. (1990) mostrou que esquemas de alimentação com proteína e gordura ou proteína e carboidrato, cada um disponível por uma hora diariamente na fase de claro, e separados por sete horas, induzem atividade antecipatória direcionada ao comedouro em ratos. Esses autores também mostraram que esses macronutrientes eram ineficazes em induzir antecipação se os animais não estivessem sob restrição calórica. Posteriormente, Stephan & Davidson (1998) mostraram que a ingestão de glicose, mas não de outras substâncias calóricas (óleo vegetal ou mineral), rapidamente muda a fase do oscilador sincronizado por alimento em ratos. Isto sugere que a concentração de glicose poderia alterar diretamente a atividade do oscilador sincronizado por alimento. Alternativamente, como conseqüência da ingestão de glicose, a concentração de outros sinais humorais mudaria e isto poderia servir como um sinal temporal para a mudança de fase do oscilador sincronizado por alimento, ou ainda, esses dois processos ocorreriam simultaneamente. A observação de Stephan & Davidson (1998) de que a ingestão de gordura não é efetiva em mudar a fase do oscilador sincronizado por alimento poderia parecer contraditória aos resultados encontrados por Mistlberger et al. (1990). Entretanto, devemos considerar diferenças metodológicas nos dois estudos. Os ratos do segundo estudo foram alimentados por somente dois dias com gordura, e possíveis mudanças de fase foram medidas. No estudo de Mistlberger et al., os animais foram mantidos no regime de alimentação por 14 dias. É possível que a ingestão de gordura ativa os sinais necessários para sincronizar o oscilador sincronizado por alimento de uma maneira pouco efetiva, sendo necessário, desta forma, um período longo para a observação da antecipação. Conseqüentemente, mudanças de fase não seriam evidentes em apenas dois dias de ingestão. Por outro lado, a ingestão de glicose poderia ser mais efetiva em alterar os sinais internos necessários para a sincronização (o próprio aumento na concentração
plasmática de glicose, por exemplo). Na verdade, não se sabem, com precisão, quais são os sinais associados com a ingestão de alimento que são necessários ou indispensáveis para a sincronização dos comportamentos antecipatórios à alimentação.
Recentemente, Waddington Lamont et al. (2007) mostraram que ratos ingerindo sacarose (frutose + glicose) no meio da fase de claro não expressam comportamento antecipatório. Algumas diferenças metodológicas entre o presente estudo e este citado devem ser consideradas. No presente trabalho, nós usamos glicose concentrada a 50 % enquanto Waddington Lamont et al. usaram sacarose a 32 %. Além disso, no estudo citado os animais tinham ração à vontade enquanto no presente estudo os ratos tinham glicose como sua única fonte alimentar. Como discutido acima, evidências mostram que a restrição calórica ou a quantidade expressiva de calorias ingeridas numa refeição são necessárias para a expressão de comportamentos antecipatórios ao alimento (Mistlberger & Rusak 1987; Mistlberger et al. 1990). Assim, a ausência de atividade antecipatória no estudo de Waddington Lamont et al. poderia ser devido à ausência de restrição calórica e/ou à baixa quantidade de calorias representadas pela ingestão de sacarose em comparação ao número de calorias ingeridas através de ração. Neste sentido, o mesmo grupo de pesquisa mostrou, posteriormente, que um alimento altamente palatável não induz atividade antecipatória a menos que o animal esteja num estado metabólico negativo (Verwey et al. 2007).
A glicose plasmática é um dos parâmetros humorais que se altera em resposta à ingestão de alimento (Campfield & Smith 2003; presente trabalho), especificamente, mostrando um aumento na sua concentração. No presente estudo, nós não poderíamos atribuir a sincronização da atividade antecipatória somente à glicose, uma vez que durante o período de restrição de glicose outros sinais, normalmente associados com a ingestão de alimento, como glucagon, insulina, grelina e leptina, poderiam contribuir para a expressão desta antecipação. Vários trabalhos mostram que estes sinais são sincronizados pelo horário de
alimentação (Bodosi et al. 2004; Díaz-Muñoz et al. 2000; Drazen et al., 2006; Martínez- Merlos et al. 2004; Schoeller et al. 1997). Alguns destes sinais têm efeitos na expressão do oscilador sincronizado por alimento ou na variável mais evidente sincronizada pela alimentação, o estado de vigília. Por exemplo, a ausência de funcionalidade do receptor da leptina provoca aumento na amplitude do ritmo antecipatório em ratos (Mistlberger e Marchant 1999), e também parece estar ligada à expressão do ciclo sono-vigília (Laposky et al. 2006); e a grelina, quando administrada em ratos com alimentação à vontade ou mantidos em restrição alimentar, é um potente indutor de atividade motora e de vigília (Szentirmai et al. 2006).
No presente estudo, as concentrações de glicose observadas durante a restrição alimentar refletiram o horário de alimentação ao qual os animais estavam submetidos. Uma característica marcante nesta etapa foi a baixa concentração de glicose uma hora antes da alimentação. Sabe-se que a injeção intravenosa de glicose ativa neurônios nos núcleos paraventricular, ventromedial e dorsomedial do hipotálamo (Dunn-Meynell et al. 1997), os quais participam da regulação da ingestão de alimento (Coll et al. 2007; King 2006; Yang et al. 2009). Além disso, Tkacs et al. (2007) mostraram que a diminuição da concentração de glicose induzida por insulina induz vigília através da ativação de áreas específicas no cérebro de ratos. Diversos trabalhos têm ligado a concentração extracelular de glicose com a atividade de algumas áreas cerebrais. Especificamente, a concentração desta molécula altera a freqüência de disparo de potenciais de ação de neurônios em regiões hipotalâmicas envolvidas na regulação da ingestão e da promoção de vigília, tais como o núcleo arqueado o núcleo ventromedial e a área lateral (Burdakov et al. 2005a; Burdakov et al. 2005b). Isto aponta para a relevância que a flutuação da concentração de glicose pode ter na temporização da atividade de diferentes regiões cerebrais.
Um trabalho recente sugere um papel para o núcleo ventromedial do hipotálamo na iniciação da atividade antecipatória ao alimento (Ribeiro et al. 2009). Trabalhos anteriores também apontam para a importância da área hipotalâmica lateral na expressão da antecipação ao alimento (Akyiama et al. 2004). Deve-se mencionar, contudo, que existem controvérsias quanto à necessidade da integridade dessas estruturas para a expressão dos ritmos antecipatórios ao alimento (Davidson 2006). Recentemente, um grupo de pesquisa sugeriu que o núcleo dorsomedial do hipotálamo seria essencial para a sincronização por alimento (Gooley et al. 2006; Fuller et al. 2008), o que gerou extensas discussões dentro na área (Gooley & Saper 2007; Landry & Mistlberger 2007; Mistlberger et al. 2009a; Mistlberger et al. 2009b; Fuller et al. 2009). Entretanto, pesquisadores de outros grupos mostraram, independentemente, que esta região não é imprescindível para a sincronização por alimento em ratos e camundongos (Landry et al. 2006, Landry et al. 2007; Moryia et al. 2009).
Os resultados obtidos na maioria dos estudos de lesão realizados até agora parecem indicar que o oscilador sincronizado por alimento, ao invés de ser constituído por uma única área no cérebro, é composto por uma rede de estruturas com funções parcialmente sobrepostas. Nossa hipótese é a de que uma gama de sinais humorais é responsável pela temporização de uma rede de osciladores localizados no cérebro, os quais são responsáveis pela expressão dos ritmos comportamentais antecipatórios ao alimento (Carneiro & Araujo 2009).
Recentemente, Hirao et al. (2009) mostraram que, durante restrição alimentar, o aumento na concentração plasmática de glicose é um sinal importante para a sincronização do oscilador circadiano localizado no fígado. Resultados obtidos por Stokkan et al. (2001) e Wu et al. (2010) indicam que o oscilador hepático necessita de um a dois ciclos para se ajustar ao horário de alimentação. Sabe-se que outras estruturas periféricas como o estômago e o tecido adiposo sincronizam ao horário de alimentação (LeSauter et al. 2009; Zvonic et al. 2006). Não