2. MATERIAL E MÉTODOS
2.4. Experimento 2: Teste de fertilidade utilizando sêmen refrigerado e congelado de
Para o teste de fertilidade foi utilizado um pool de ejaculados de 3 touros. Após a homogeneização dos ejaculados o pool foi dividido em 3 partes, duas destinadas a refrigeração em diluidor com ou sem crioprotetor e uma para congelação, conforme já descrito no item 2.1, este procedimento foi realizado duas vezes com os mesmo animais, devido as IATF serem efetuadas em 2 etapas.
Na primeira etapa foram utilizadas 400 vacas sincronizadas conforme descrito no item 2.1. as quais foram divididas aleatoriamente entre os três grupos estudados, sendo que para as amostras refrigeradas com glicerol utilizou-se 140 animais, as refrigeradas sem crioprotertor um total de 135 vacas e 125 animais foram inseminados com sêmen congelado. Já para a segunda etapa de IATF, quinze dias após a primeira foram utilizadas mais 362 vacas, sendo que 138 para amostras refrigeradas com crioprotetor, 133 para doses refrigeradas sem glicerol e 91 vacas foram inseminadas com sêmen congelado.
2.5. Análise Estatística
Todas as análises estatísticas foram efetuadas através do programa Instat 5.0 (GraphPad Software Inc, USA). Para as análises in vitro das características espermáticas foi realizado o teste de variância (ANOVA) seguido do teste de Tukey, quando necessário. Já para a avaliação dos resultados do teste de fertilidade utilizou- se o teste Exato de Fisher. Todas os resultados foram consideradas significativas quando p<0,05.
3. Resultados Experimento 1
Em relação às características seminais avaliadas in vitro para a análise da cinética espermática foi verificado que para as variáveis MT, VAP, VSL e RAP as amostras congeladas diferiram estatisticamente dos demais grupos estudados apresentando valores inferiores. Entretanto, para MP o grupo refrigerado com crioprotetor apresentou valores similares aos observados no grupo onde o sêmen foi congelado, sendo que estes foram significativamente menores dos que os valores da amostra a fresco e do grupo refrigerado sem a presença do glicerol. Já para variável VCL, o grupo refrigerado com glicerol apresentou valores superiores em relação aos demais grupos estudados e as amostras refrigeradas sem crioprotetor e a fresco foram superiores aos encontrados no grupo congelado. As características seminais BCF, STR e LIN apresentaram valores significativamente menores no grupo onde as amostras foram refrigeradas com glicerol em relação aos demais grupos, entretanto a variável ALH apresentou valores significativamente superiores neste grupo em relação aos demais, conforme (tabela 2).
Tabela 2 – Valores médios e erro padrão das variáveis da cinética espermática analisadas pelo CASA, de amostras do sêmen Fresco, Refrigerado 5oC/24h e congelado de bovinos.
Variáveis Fresco Refrigerado Congelado
BB C/Crio BB S/Crio BB MT (%) 89,9 ± 0,9a 89,7 ± 0,9a 88,4 ± 1,0a 76,3 ± 1,6b MP (%) 69,9 ± 1,1a 58,3 ± 1,5b 65,2 ± 1,7a 58,2 ± 1,6b VAP (µm/s) 96,3 ± 2,8a 101,1 ± 4,1a 92,7 ± 3,7a 78,4 ± 1,9b VSL (µm/s) 81,3 ±2,1a 76,1 ± 2,3a 76,2 ± 2,0a 65,7 ± 1,6b VCL (µm/s) 147,1 ± 5,0b 174,7 ± 7,6a 148,8 ± 6,7b 121,8 ± 3,3c ALH (µm) 5,3 ± 0,2b 6,8 ± 0,3a 5,6 ± 0,3b 4,8 ± 0,1b BCF (Hz) 31,6 ± 0,6a 26,0 ± 0,9b 30,5 ± 1,0a 31,6 ± 0,8a STR (%) 83,5 ± 0,6a 76,2 ± 1,1b 81,8 ± 1,1a 84,1 ± 0,7a LIN (%) 58,2 ± 1,1a 47,1 ± 1,0b 55,2 ± 1,4a 57,0 ± 1,0a RAP (%) 87,4 ± 1,2a 86,0 ± 1,3a 84,4 ± 1,4a 71,3 ± 1,7b
abc Letras diferentes na mesma linha diferem estatisticamente entre si p<0,05.
Motilidade Total (MT), Motilidade Progressiva (MP), Velocidade de Trajeto (VAP), Velocidade Progressiva (VSL), Velocidade Curvilinear (VCL), Amplitude do deslocamento Lateral de Cabeça (ALH), Freqüência de Batimentos de Cauda (BCF), Retilinearidade (STR), Linearidade (LIN), Espermatozóides Rápidos (RAP).
BB = Diluidor BotuBov; BB C/Crio = BB com crioprotetor; BB S/Crio = BB sem crioprotetor.
Foram avaliadas diferentes funções espermáticas baseando-se apenas nas células que se encontravam com as membranas plasmáticas e acrossoamal íntegras, desta forma pode-se observar que para a maioria dos testes estudados PL, ROS e CAP não houve diferenças estatísticas entre os valores obtidos nos grupos estudados, entretanto para os testes de IMPA e DNA as amostra congeladas apresentaram uma menor taxa de espermatozóides com as membranas íntegras e um maior índice de fragmentação do DNA, (tabela 3).
Tabela 3 – Valores médios e erro padrão das variáveis analisadas por Citômetro de fluxo, de amostras do sêmen Fresco, Refrigerado 5oC/24h e Congelado de bovinos.
Variáveis Fresco Refrigerado Congelado BB C/Crio BB S/Crio BB PL (%) 5,5±0,7 6,4±0,9 7,6±1,1 4,6±0,8 ROS (%) 5,1±1,0 5,4±0,8 6,2±1,0 6,3±0,9 IMPA (%) 73,7±2,6a 76,5±2,2a 76,1±2,2a 40,7±1,9b CAP (%) 1,3±0,1 1,5±0,1 1,5±0,1 2,2±0,3 DNA (%) 0,9±0,1a 1,2±0,1a 1,1±0,1a 1,6±0,1b
abLetras diferentes na mesma linha diferem estatisticamente entre si, p<0,05,
Espermatozóides Íntegros; com Peroxidação Lipídica (PL), Estresse Oxidativo (ROS), Membrana Acrossomal e Plasmática (IMPA), Capacitados (CAP), Fragmentação de Cromatina (DNA), BB = Diluidor BotuBov; BB C/Crio = BB com crioprotetor; BB S/Crio = BB sem crioprotetor.
Experimento 2
Analisando os dados obtidos no teste de fertilidade, foi observado que a taxa de prenhez foi significativamente superior no grupo refrigerado com glicerol em relação aos índices encontrados nas vacas inseminadas com sêmen congelado. E os animais que foram inseminados com sêmen refrigerado sem a presença do glicerol apresentaram valores similares entre os outros dois grupos estudados, conforme descrição (tabela 4).
Tabela 4 – Número de animais e porcentagem da taxa de prenhez aos 60 dias pós IATF, de amostras do sêmen Refrigerado com ou sem crioprotetor à 5oC/24h e
Congelado de bovinos.
Grupos Taxa de Prenhez
BB C/Crio 142/278 (51,0)a
BB S/Crio 119/268 (44,0)ab
BB Congelado 88/216 (41,0)b
ab Letras diferentes na mesma coluna diferem estatisticamente entre si p<0,05.
BB = Diluidor BotuBov; BB C/Crio = BB com crioprotetor; BB S/Crio = BB sem crioprotetor. IATF = Inseminação Artificial em Tempo Fixo.
4. DISCUSSÃO
Apesar de Polge et al., [5] terem descoberto as qualidades crioprotetoras do glicerol há sete décadas, ainda hoje, pouco se sabe a respeito de sua real função sobre os espermatazoides.
Mann e Write, [6] e Mohri e Masaki, [7], sugerem que o glicerol pode interagir com espermatozoides bovinos, sendo metabolizado e convertido em um estoque extra de glicose, que seria utilizado posteriormente durante o processo de fertilização.
Nesse sentido, a utilização do glicerol em diluidores destinados a refrigeração de espermatozóides bovinos, poderiam apresentar melhores taxas de fertilidade em relação aos refrigerados sem esse crioprotetor, adicionalmente este tipo de preservação espermática na forma líquida contendo o glicerol, também apresentaria vantagens em relação ao procedimento da congelação (utilizando o glicerol como crioprotetor), uma vez que a quantidade de lesões a ultra-estrutura espermática é menor no processo da refrigeração.
A queda acentuada dos parâmetros espermáticos ocorrida nas amostras congeladas era esperada, pois vários autores já haviam constatado resultados semelhantes que são causados pelos danos nos espermatozoides e que podem ser ultra-estruturais, físicos, bioquímicos ou funcionais [2,14,15,16,17]. Corroborando com os achados deste experimento onde a porcentagem de células com as membranas plasmáticas e acrossomal intactas, foram significativamente menores nas amostras que foram submetidas ao processo de congelação. Januskauskas et al., [18] verificaram que mudanças da membrana pode estar relacionadas a danos do DNA após criopreservação do sêmen bovino pois encontraram correlação significativa entre a porcentagem de células com desnaturação do DNA, mensurada pela acridina laranja. Este achado também foi observado no presente trabalho, haja vista que a fragmentação do DNA foi maior nas amostras que foram congeladas.
A técnica de refrigeração do sêmen bovino visa à redução da temperatura com concomitante diminuição do metabolismo espermático, prolongando com isso sua vida útil. Portanto a refrigeração do sêmen reduz o catabolismo espermático preservando-o por longos períodos [19].
Os resultados apresentados na tabela 2 mostram uma similaridade entre as amostras refrigeradas com e sem crioprotetor por 24 horas de refrigeração a 5°C em relação ao sêmen fresco. Entretanto estas de um modo geral apresentaram resultados superiores às congeladas.
Quando se compara as amostras com e sem crioprotetores observa-se uma queda da motilidade progressiva do grupo refrigerado com glicerol em relação às demais e semelhante as congeladas. Isto deve ter ocorrido em função da presença do glicerol nestes meios por possuir alta osmolaridade, o que pode ter causado uma desidratação celular concomitantemente com uma alta viscosidade do meio PARKS e GRAHAM [20]; WATSON, [15], bem como a densidade do meio pode interferir na velocidade espermática diminuindo a amplitude flagelar MORTINER [21], enquanto que Hirai et al., [22] descreveram que a velocidade dos espermatozoides é inversamente proporcional a viscosidade do meio. Celegnini et. al. [17] observaram superioridade das variáveis de velocidade quando comparou a congelação com o meio BotuBov® considerado denso (gema de ovo + glicerol) com o meio Bioxcell® com menor densidade (lecitina de soja) enquanto que Chacur et al., [23] também comparando BotuBov®, Tris, BotuBov Egg Free na criopreservação e observaram melhores resultados das motilidades e velocidades do meio BotuBov Egg Free e concluíram que estaria ligado a menor densidade do diluidor. Resultados semelhantes foram obtidos por Crespilho et. al. [24] que analisando amostras de sêmen refrigeradas de bovinos por 24 e 48 horas obteve menores índices de motilidade progressiva e maior lineralinadade espermática do meio BotuBov Lecitina de soja em relação ao diluidor TRIS e concluiu que os resultados observados estariam confirmando os obtidos por Celegnini et. al. [17].
No presente trabalho os resultados de VAP e VSL foram inferiores no grupo de amostras congeladas em relação aos demais, e isto está ligado às injurias ocasionados pelo processo de congelação [17,24,23].
Quanto ao VCL foi observado para o grupo refrigerado com glicerol velocidades superior aos encontrados aos demais grupos. Essa alteração de movimento pode ter ocorrido devido a desidratação celular promovida pelo crioprotetor glicerol o que faz o espermatozoide se torne mais leve e contribua para aumento dessa velocidade. O
mesmo não foi observado para o grupo congelado, pois o processo de criopreservação deve ter promovido danos celulares significativos e irreversíveis. Segundo Vestegen et al., [25] o VCL e o ALH tem mostrado grande correlação com a taxa de fecundação in vitro de oócitos. Essa alteração da característica da viabilidade espermática foi evidenciada para amplitude do deslocamento lateral de cabeça (ALH) onde as refrigeradas apresentaram características de lateralização diferentes para os grupos com e sem glicerol, ajudando os achados, uma vez que o glicerol pode ser o responsável por essa mudança. Já nas amostras congeladas essa característica fica difícil de ser visualizada, pois essas amostras sofreram o processo de congelação. Os resultados observados aos de Celegnini et. al. [17] e diferentes de O’Cornell et al., [26] que não observaram diferenças de ALH entre sêmen fresco e criopreservado. Os valores obtidos foram contrastantes aos obtidos por Arruda et al., [27] que afirmou quanto maior o valor numérico do ALH se traduz em pior qualidade espermática.
Para os resultados de BCF, foram encontrados resultados intrigantes, pois as amostras refrigeradas com glicerol apresentaram os menores valores quando comparadas aos demais grupos, isto pode ter ocorrido possivelmente pelo direcionamento do gasto de ATP para as reações bioquímicas ocorridas em uma provável gliconeogenese no sentido de promover um aporte adicional de energia para célula, processo este descrito por Mann & Write,[6], entretanto esse fenômeno não foi observado nas amostras congeladas, provavelmente devido ao processo da criocapacitação que se instala em espermatozoides descongelados, dessa forma, estes podem estar apresentando um gasto aumentado de ATP devido ao início do processo de hiperativação em que o metabolismo celular é maior. Esse estado criocapacitado não foi visualizado pelo teste utilizado no presente experimento, que evidencia momentos mais tardios do processo de capacitação. Segundo Vestengen et al., [25] as crioinjúrias causadas nos espermatozoides durante os processos de refrigeração e principalmente congelação podem levar as células espermáticas a apresentar lesões compatíveis a capacitação e que comprometem a longevidade espermática.
Os movimentos de retilinearidade (STR) e linearidade (LIN) foram inferiores nos grupos com crioprotetor glicerol concordando com a motilidade progressiva (MP), já que a osmolaridade e viscosidade do meio pode contribuir com a variação cinética
espermática, resultados semelhantes aos encontrados por Celegnini [17] e que haviam sido esclarecidos por Mortiner [21] afirmando que a densidade do meio pode influenciar na velocidade espermática e Hirai et al., [22] que a velocidade e diretamente proporcional a viscosidade do meio.
Os resultados de espermatozoides rápidos (RAP) no grupo congelado novamente apresenta resultados inferiores, devido ao processo de congelação e danos espermáticos na ultraestrutura e nas características física, bioquímicas e ou funcionais [15,2,17].
Quanto ao índice de integridade de cromatina as amostras refrigeradas foram superiores as congeladas e esta diferença se deve ao processo de criopreservação que pode incrementar as lesões apresentadas. De acordo com Bochenek et al., [28] pode existir correlação negativa entre os danos da estrutura da cromotina e fertilidade de sêmen congelado de touros.
Em relação aos índices de concepção, observados neste experimento foi verificado que a taxa de fertilidade no grupo congelado foi similar a observada nas amostras refrigeradas sem presença do glicerol, esse achado corroboram com observados por Fujita et. al. [29]. Entretanto, nas amostras refrigeradas com glicerol foi observado índices superiores aos observados no grupo congelado, resultados semelhantes aos obtidos por Crespilho et. al. [24]. Ratificando que a presença do glicerol na refrigeração de sêmen bovino é uma estratégia necessária para incrementar as taxas de prenhez em programas IATF.
5. CONCLUSÃO
A utilização de sêmen refrigerado por 24 horas/5oC com adição de glicerol ao diluidor promove maior taxa de prenhez em IATF, em relação ao sêmen congelado. Desta forma, contribuindo para um aumento da utilização da IATF em propriedades que utilizam a monta natural, já que maximizaria a utilização dos touros impostos a esse tipo de regime. E ainda, se mostra como uma alternativa promissora para inclusão de
animais geneticamente superiores, os quais o sêmen não suporta bem o processo da congelação em programas de IATF.
Agradecimentos
A Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo – FAPESP pelo apoio financeiro e a empresa Botupharma® pelo fornecimento dos meios diluidores.
6. REFERÊNCIAS
[1] Verberckmoes S, Soom, AV, Dewulf, J, Kruif, A. Comparison of three diluents for the storage of fresh bovine semen. Theriogenology, 2005, 63:912-22.
[2] Watson, PF. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Anim Reprod Sci, 2000, 60: 481-92.
[3] Vishwanath, R, Shannon, P. Storage of bovine semen in liquid and frozen state. Anim Reprod Sci, 2000, 62:23-53.
[4] Kankofer, M, Kolm, G, Aurich, J, Aurich, C. Activity of glutathione peroxidase, superoxide dismutase and catalase and lipid peroxidation intensity in stallion semen during storage at 5°C. Theriogenology 2005, 63:1354-65.
[5] Polge, C, Smith, AU, Parkes, AS. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures. Nature 1949, 164-66.
[6] Mann T, White IG. Metabolism of Glycerol, Sorbitol and Related Compounds by Spermatozoa. Nature 1956; 178:142.
[7] Mohri, H. & Masaki, J. Glycerokinase and its possible role in glycerol metabolism of bull spermatozoa. J Reprod Fertil 1967, 14: 179-94.
[8] Kundu, CN, Chakraborlty J, Dutta P, Bhattacharyya D, Ghost A, Majunder GC. Development of a simple sperm cryopreservation model using a chemical defined medium and the goat caudal epididymal spermatozoa. Cryobiology 2000,40: 117-25. [9] Crespilho AM. et al. Eficiência comparativa entre dois diluidores para a congelação de sêmen bovino sobre os padrões de motilidade e integridade de membrana plasmática. Revista ARS Veterinária, 22, n.3, 229-235, 2006
[10] Freitas-Dell’aqua CP, Guasti PN, Monteiro GA, Maziero RRD, Dell’Aqua Jr JA, Papa FO. Flow cytometric analysis of fertile and subfertile frozen stallion spermatozoa. Anim Reprod 2012 9:941.
[11] De Andrade AF, Zaffalon FG, Celeghini EC, Nascimento J, Bressan FF, Martins SM, et al. Post-thaw addition of seminal plasma reduces tyrosine phosphorylation on the surface of cryopreserved equine sperm, but does not reduce lipid peroxidation. Theriogenology 2012; 77:1866 –72.
[12] Guasti PN, Freitas-Dell’aqua CP, Maziero RRD, Hartwig FP, Monteiro GA, Lisboa FP, Papa FO. Validation of flow cytometry for assessment of membrane lipid peroxidation of equine spermatozoa. In: IV International Symposium on Animal Biology of Reproduction, 2012, Campinas/SP. IV International Symposium on Animal Biology of Reproduction. Belo Horizonte/MG: Animal reproduction - Periodicals. I. Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. II. Brazilian College 2012, 9: 929.
[13] Evenson DP, Ballachey BE. Flow cytometric evaluation of bull sperm chromatin structure, mitochondrial activity, viability and concentration. Proc Eleventh NMB Tech Conf Al Reprod 1986,109.
[14] Salamon, S, Maxwell, WMC. Fronzen storage of ram semen I. Processing, freezing, thawing and fertility after cervical insemination. Anim Reprod Sci 1995, 37:185-249.
[15] Watson, PF. Recent developments and concepts in the cryopreservation of spermatozoa and the assessment of their post-thawing function. Reprod Fertil Devel 1995, 7:871-91.
[16] Holt WV. Fundamental aspects of sperm cryobiology: The importance of species and individual differences. Theriogenology 2000, 43: 47-58.
[17] Celeghini ECC, Arruda RP, Andrade AFC, Nascimento J, Raphael CF, Rodrigues, PHM. Effects that bovine sperm cryopreservation using two different extenders has on sperm membranes and chromatin Anim Reprod Sci 2008, 104: 119-31.
[18] Januskauskas A, Johannisson A, Rodriguez-Martinez H. Subtle membrane changes in cryopreserved bull semen in relation with sperm viability, chromatin structure, and field fertility. Theriogenology 2003,60:743-58.
[19] Squires E L, Pickett JK, Graham DK, Vanderwall DK, Mccue PM, Bruemmer JE. Cooled and frozen stallion semen. In: Anim Reprod Biology Lab. Colorado. College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences- Colorado States University, 1999.
[20] Parks JE, Graham JK. Effects of cryopreservation procedures on sperm membranes. Theriogenology 1992, 38:209-22.
[21] Mortimer ST. A critical review of the physiological importance and analysis of sperm movement in mammals. Human Reprod Update 1997, 3:403-39.
[22] Hirai M, Cerbito WA, Wijayaguna W. The effect of viscosity of semen diluents on motility of bull spermatozoa. Theriogenology. 1997; 47:1463-78.
[23] Chacur MGM, Dias HS, Papa FO, Louvison BA, Calesco MM, Papa PM. Efeito de meios diluentes na viabilidade de sêmen congelado bovino. Veterinária e Zootecnia (UNESP) 2012, 19: 346-55.
[24] Crespilho AM, Papa FO, Santos M. P, Sá Filho MF. Use of Cooled Bull Semen as a Strategy to Increase the Pregnancy Rate in Fixed-Time Artificial Insemination Programs Case Report. J Anim Vet Sci 2012, 7: 175-79.
[25] Verstegen J, Iguer-Ouada MI, Oclin K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 2002; 57:149-79.
[26] O’dell WT, Almquist JO. Freezing bovine semen. I. Techniques for freezing bovine spermatozoa in milk diluents. J Dairy Sci 1957, 40:1534–41.
[27] Arruda RP, Ball BA, Gravance CG, Garcia AR, Liu IKM. Effects of extenders and cryoprotectants on stallion sperm head morphometry. Theriogenology 2002, 58: 253-56. [28] Bochenek M, Smorag Z, Pilch J. Sperm chromatin structure assay of bulls qualified for artificial insemination. Theriogenology 2001, 56: 557-67.
[29] Fujita AS, Weiss RR, Junior Rossi P, Kozicki LE, Greselle FVN, Bertol MAF. Taxa de gestação em novilhas nelore sincronizadas para IATF e inseminadas com sêmen resfriado e congelado. Arch Vet Sci 2013,18: 13-21.
CONCLUSÕES GERAIS
A utilização de sêmen refrigerado por 24 horas/5oC com adição de glicerol ao diluidor promove maior taxa de prenhez em IATF, em relação ao sêmen congelado. Desta forma, contribuindo para um aumento da utilização da IATF em propriedades que utilizam a monta natural, já que maximizaria a utilização dos touros impostos a esse tipo de regime. E ainda, se mostra como uma alternativa promissora para inclusão de animais geneticamente superiores, os quais o sêmen não suporta bem o processo da congelação em programas de IATF.
ANEXO – NORMAS PARA PUBLICAÇÃO NA REVISTA THERIOGENOLOGY – ISSN 0093-691X
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