UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
EFEITO DA INCORPORAÇÃO DO GLICEROL SOBRE A VIABILIDADE
E FERTILIDADE DO SÊMEN BOVINO REFRIGERADO
PATRICIA DE MELLO PAPA
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
EFEITO DA INCORPORAÇÃO DO GLICEROL SOBRE A VIABILIDADE
E FERTILIDADE DO SÊMEN BOVINO REFRIGERADO
PATRICIA DE MELLO PAPA
Dissertação apresentada ao programa de pós- graduação em Biotecnologia Animal (Área de concentração Reprodução Animal) para obtenção do título de Mestre.
Orientador: José Antônio Dell`Aqua Junior
NOME DO AUTOR: Patricia de Mello Papa
TÍTULO: EFEITO DA INCORPORAÇÃO DO GLICEROL SOBRE A VIABILIDADE E FERTILIDADE DO SÊMEN BOVINO REFRIGERADO
COMISSÃO EXAMINADORA:
Prof. Dr. José Antônio Dell`Aqua Junior (Presidente e Orientador) Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ- UNESP- BOTUCATU
Prof. Adjunto Marco Antonio Alvarenga (Membro)
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ- UNESP- BOTUCATU
Prof. Dr. André Maciel Crespilho (Membro) Departamento de Reprodução Animal FMVA-UNISA-Santo Amaro
Profa. Titular Maria Denise Lopes (Suplente)
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ- UNESP- BOTUCATU
Prof. Dr. André Furugem Cesar de Andrade (Suplente) Departamento de Reproducao Animal
FMVZ- USP- Pirassununga.
DEDICATÓRIA
Ao meu pai, Frederico que graças a sua dedicação e paixão pelo que faz me cativou a seguir seus passos, quem durante muitas vezes, por horas e horas, não mediu palavras para me passar seus conhecimentos, me ajudou, me aconselhou, cumpriu papel duplo nesta jornada, de pai e mestre.
À minha mãe Lucia, por ser o pilar de força e coragem que sustenta a nossa família, essa vitória também é totalmente dedicada a você, pois sem você nada disso teria acontecido.
Aos meus irmãos Priscila e Gustavo por sempre estarem presentes em todos os sentidos, não medindo esforços para que eu chegasse até aqui.
Ao Cássio Renesto Junqueira pelo amor, dedicação, incentivo e paciência durante todo esse tempo.
A Deus que me deu a vida, saúde e determinação para atingir meus objetivos.
AGRADECIMENTOS
Agradeço em especial Prof. José Antônio Dell`Aqua Junior pela amizade, apoio e orientação, sem os quais esse trabalho não se realizaria.
À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP- Campos de Botucatu e Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, em nome de todos os seus professores e funcionários.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, pela concessão da bolsa de estudos.
Aos amigos do curso de pós- graduação do Centro de Biotecnologia em Reprodução Animal - CERAN pelo convívio durante todo o período em que estivemos juntos.
A Camila de Paula Freitas Dell`Aqua pela ajuda com as analises, sugestões e correções e, sobretudo pela paciência, ensinamento e amizade.
As amigas Priscilla e Rosiara obrigada pela ajuda durante o experimento, pela amizade e todo o apoio.
Ao Felipe Vianna que ajudou na realização desse trabalho.
A toda minha família, pelas palavras de incentivo em especial a minha avó que sempre me inclui em suas orações com muito amor e carinho.
Lista De Abreviaturas
°C: graus Celsius; µL: microlitro; µm: micrômetro;
ALH: amplitude do deslocamento lateral cabeça; ASBIA: associação brasileira inseminação artificial; ATP: trifosfato de adenosina;
BCF: frequência de batimento flagelar; BE: benzoato de estradiol;
CASA: análise computadorizada do movimento espermático; DMSO: dimetilsulfoxido;
DNA: ácido desoxirribonucleico; ECP: cipionato de estradiol;
EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético;
FITC-PSA: isothiocionato de fluoresceína associado a aglutinina do Pisum sativum; IA: Inseminação Artificial;
IATF: Inseminação Artificial com Tempo Fixo;
IPMA: integridade de membrana plasmática e acrossomal; LDL: lipoproteína de baixa densidade;
LIN: linearidade;
LP: peroxidação lipídica; Mg: miligrama;
MOT: motilidade total; MP: motilidade progressiva; PGF2α: Prostaglandina; PI: iodeto propídio;
RAP: espermatozoides com velocidade rápida; ROS: espécie reativas de oxigênio;
STR: retilinearidade;
TEC: Toneladas equivalente carcaça; TRIS: Tris (hidroximetilaminometano) UI: unidade internacional;
Lista de Tabelas
Tabela 1 – Metodologia da análise computadorizada (CASA) da cinética espermática dos espermatozoides bovinos. ... 22
Tabela 2 – Valores médios e erro padrão das variáveis da cinética espermática analisadas pelo CASA, de amostras do sêmen Fresco, Refrigerado 5oC/24h e Congelado de bovinos. ... 27
Tabela 3 – Valores médios e erro padrão das variáveis analisadas por Citômetro de fluxo, de amostras do sêmen Fresco, Refrigerado 5oC/24h e Congelado de bovinos. . 28
SUMÁRIO
Capítulo 1 ... 1
INTRODUÇÃO ... 2
HIPÓTESE ... 4
OBJETIVO GERAL ... 4
Capítulo 2 ... 5
REVISÃO DE LITERATURA ... 6
1. Meios Diluidores ... 6
2. Princípios da Criopreservação ... 8
3. Sêmen Bovino Refrigerado ... 10
4. Inseminação Artificial em Tempo Fixo ... 12
REFERÊNCIAS ... 13
Capítulo 3 ... 16
Sêmen refrigerado com ou sem glicerol em Inseminação Artificial em Tempo Fixo . Erro! Indicador não definido. RESUMO ... 17
1. INTRODUÇÃO ... 18
2. MATERIAL E MÉTODOS ... 19
2.1. Animais, processamento das amostras e protocolo de IATF ... 19
2.2. Análises Espermáticas ... 21
2.2.2. Características avaliadas por Citometria de Fluxo ... 22
2.3. Experimento 1: Avaliação in vitro das características seminais de sêmen fresco, refrigerado e congelado de bovinos... 24
2.4. Experimento 2: Teste de fertilidade utilizando sêmen refrigerado e congelado de bovinos. ... 25
2.5. Análise Estatística ... 26
3. Resultados ... 26
4. DISCUSSÃO ... 29
5. CONCLUSÃO ... 32
RESUMO
PAPA, P.M. Efeito da incorporação do glicerol sobre a viabilidade e fertilidade do sêmen bovino refrigerado. Botucatu, 2013 Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
O objetivo do presente estudo foi comparar a viabilidade e fertilidade do sêmen na refrigerado bovino diluído em meio diluidor comercial Botu Bov® com e sem crioprotetor glicerol a 5°C por 24 horas em sistema passivo de refrigeração Botu Flex® e comparados com amostras congeladas. Foram realizadas análises dos padrões de cinética espermática pelo CASA e viabilidade celular pela Citometria de Fluxo. Para o teste de fertilidade foram utilizados pool de 3 touros da raça Nelore, com idade média de 30 meses em programas de IATF. Os ejaculados foram divididos em 3 grupos experimentais de acordo com o meio diluidor, sendo Grupo (BB c/ crio), diluidor Botu Bov® com 7% de glicerol à 5°C/24horas; Grupo (BB s/ crio) diluidor Botu Bov® sem glicerol à 5°C/24horas; Grupo (BB) sêmen congelado com Botu Bov® com 7% de glicerol. Para o teste de fertilidade foram inseminadas 762 vacas da raça Nelore (Bos taurus indicius) em programas de IATF de forma randomizada: sendo 278 para (BB c/ crio), 268 para (BB s/ crio) e 216 para (BB). Os índices de concepção foram de 51%a,44%ab e 41%b respectivamente para (BB c/ crio), (BB s/ crio) e (BB) (p<0,05). Através dos resultados alcançados pode-se concluir que houve uma preservação espermática maior da amostra mantida sob-refrigeração com crioprotetor glicerol à 5°C/24horas, quando comparado com a amostra congelada. Esses resultados promovem a perspectiva da maximização de touros da fazenda utilizados em monta natural e animais geneticamente superiores que não apresentam índices de congelabilidade satisfatórios serem utilizados como doadores de sêmen em programas de IATF.
ABSTRACT
PAPA, P.M. Effect of glycerol incorporation on the
v
iability and fertility of chilled bull semen. Botucatu, 2013 Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.The aim of this study was to evaluate the viability and fertility of bull semen using BotuBov™ extender with or without glycerol refrigerated at 5oC for 24 hours in a passive cooling system (Botu Flex™) and compares it with frozen semen. Sperm parameters were analyzed by CASA and sperm viability was assessed by flow cytometry. For the fertility trial, a pool of spermatozoa of 3 Nellore bulls, with an average age of 30 months, were included in a fixed time artificial insemination (FTAI) program. Ejaculates were divided into three groups, according to the extender: Group (BB with glycerol) BotuBov™ extender with 7% glycerol; Group (BB without glycerol) BotuBov™ extender with glycerol, both (BB with glycerol) and (BB without glycerol) were submitted to cooling at 5oC for 24 hours; and Group (BB) samples frozen with BotuBov™ extender with 7% glycerol. The fertility trial was performed with 762 Nellore cows that were submitted to fixed time artificial insemination (FTAI) and divided into three insemination groups: 278 (BB with glycerol), 268 (BB without glycerol) and 216 (BB). Conception rates were 51%a, 44%ab and 41%b, respectively for (BB with glycerol), (BB without glycerol) and (BB) (p< 0,05). According to the results, it can be concluded that there was a higher spermatic preservation of chilled sample with glycerol at 5oC for 24 hours when compared to the frozen-thawed samples. These results further the prospect of maximizing farm bulls used in natural mating and genetically superior animals that do not have satisfactory levels of freezability be used as semen donors in FTAI programs.
INTRODUÇÃO
A pecuária brasileira é uma atividade de grande importância para a economia do país devido ao seu impacto no PIB nacional. Mesmo assim, apesar do Brasil ser um grande exportador de carne bovina, o setor ainda pode se modernizar e aumentar sua produtividade a partir de novas biotecnologias existentes. A utilização da inseminação artificial em bovinos ainda é muito baixa comparada com o tamanho do rebanho brasileiro.
O Brasil possui o segundo maior rebanho bovino do planeta, suplantado apenas pela Índia, sendo o rebanho bovino brasileiro considerado o maior rebanho comercial do mundo, produzindo no último ano uma média anual de 9,18 milhões de TEC (toneladas equivalentes carcaça), o que faz do Brasil o segundo maior produtor mundial, com 16,2% de toda carne produzida no mundo.
A necessidade de se buscar cada vez mais um aumento nessa produção de carne vem sendo realizada através da melhoria genética dos rebanhos, aumento da utilização de diversas biotecnologias (inseminação artificial, transferência de embriões e a fertilização in vitro) e melhoria das pastagens, dessa forma, possibilitando uma maior disponibilidade de proteína animal.
Uma das biotecnologias mais utilizadas é a inseminação artificial, a qual apresentou um crescimento considerável nos últimos anos. Esta é capaz de acelerar o ganho genético e aumentar a produtividade em um menor espaço de tempo. Entretanto, segundo dados da ASBIA (Associação Brasileira de Inseminação Artificial) constatou que apenas 10% das fêmeas bovinas em idade reprodutiva são inseminadas anualmente no Brasil.
No entanto, um dos principais entraves para a utilização da IATF relaciona-se a baixa taxa de concepção em torno de 40 a 50%, devido a influência multifatorial inerente a esta Biotécnica. Um fator relevante em relação das taxas de fertilidade obtidas, está relacionado a qualidade das doses congeladas, que apresentam grandes variações de resultados entre touros.
Nesse sentido, a utilização de doses de sêmen refrigeradas, por apresentarem menos injúrias decorrentes do processo da congelação, pode contribuir para um aumento nos índices de fertilidade, devido a sua maior integridade, viabilidade e longevidade, fatores estes, importantes para taxas de fecundação in vivo.
HIPÓTESE
Utilização do glicerol em diluidores para refrigeração de sêmen bovino, contribui para um aumento das taxas de prenhez em programas de IATF em relação a utilização do sêmen congelado e ou refrigerado sem a sua presença.
OBJETIVO GERAL
REVISÃO DE LITERATURA
1. Meios Diluidores
A interação entre a célula espermática e o meio diluidor representa um importante fator para a preservação da integridade espermática e habilidade de fecundação (MANJUNATH, et. al.,2002).
A criopreservação causa danos irreversíveis aos espermatozoides, devido à formação de cristais de gelo intracelulares, que afetam a estrutura físico-química da célula. O diluidor e o crioprotetor são utilizados com o intuito de minimizar os efeitos do choque frio e osmótico que ocorrem durante o processo de congelação. Durante este processo a região celular mais afetada são as membranas plasmática e acrossomal, bem como à motilidade progressiva e metabolismo para produção de energia (PICKETT et al. 1987), afetando assim, o tempo de sobrevivência das células no trato reprodutivo da fêmea (VALCARCEL et al, 1996).
O diluidor deve interagir com o sêmen, proporcionando proteção aos diferentes compartimentos celulares durante o resfriamento, congelação e descongelação. Por isso, sua constituição deve garantir nutrição, proteção, balanço eletrolítico (pH e osmolaridade) e inibição bacteriana. Os constituintes básicos dos diluentes são substâncias energéticas, crioprotetores, soluções tampões e antibióticos (SQUIRES et al., 1999; HOLT, 2000). De acordo com Vishwanath e Shannon (2000), para um meio diluente ser completo e eficiente, algumas substâncias são fundamentais na sua composição: substâncias iônicas e aniônicas que mantém a osmolaridade; lipoproteínas ou material de alto peso molecular, como a gema de ovo ou leite, que previnam o choque frio; agentes crioprotetores intracelulares como, glicerol, propanodiol ou dimetilsulfoxido (DMSO); fonte de energia como glicose ou frutose e outros aditivos como enzimas e antibióticos.
manose e trealose, podendo os mesmos serem utilizados em combinações de dois ou três açúcares.
Purdy (2006) afirmou que os crioprotetores penetrantes ou intracelulares são solutos que atuam tanto interna quanto externamente no espermatozoide, desidratando a célula espermática devido ao efluxo de água intracelular para equilibrar o meio extracelular. Esta categoria de crioprotetores penetra na membrana celular por meio de difusão passiva, permanecendo na membrana e no citoplasma, uma vez que, semelhante aos agentes não penetrantes, atua na desidratação celular por meio do seu efeito osmótico, criando um meio hipertônico que induz a saída de água das células espermáticas.
A primeira etapa envolvida na criopreservação espermática representa a diluição das amostras seminais em meios específicos, evitando-se os efeitos deletérios relacionados ao metabolismo espermático e exposição ambiental, garantindo a manutenção do movimento e viabilidade celular (FOOTE, 1982). Em virtude de sua importância, considera-se que os meios diluidores desempenharam o papel mais importante para o estabelecimento da inseminação artificial como prática de manejo reprodutivo em bovinos (HURST, 1953).
Polge (1949), teve sucesso com a congelação de espermatozoides de aves, com a inclusão do glicerol. Imediatamente o glicerol começou a ser utilizado na congelação do sêmen bovino.
KUNDU et al., (2000) hipotetizaram que o mecanismo de ação do glicerol representa a ligação dos átomos de hidrogênio dos grupos hidroxila do glicerol com os átomos de oxigênio dos grupos fosfatos dos fosfolipídios da membrana plasmática dos espermatozoides promovendo assim, uma estabilização da membrana durante o processo de criopreservação.
osmótica e baixa toxicidade em altas concentrações (DAVIS et al., 1963; STEINBACH e FOOTE, 1967), (NAHAS, 1961). Esse diluente se tornou o meio mais usado em todo o mundo para a criopreservação de espermatozoides de touro e de várias outras espécies (IRITANI, 1980).
Bergeron et al. (2007), trabalhando na criopreservação de sêmen bovino com diluentes à base de gema de ovo ou leite, concluíram que, da mesma forma que a gema de ovo, as caseínas do leite reduzem a ligação das proteínas do plasma aos espermatozoides, minimizando a perda de lipídeos da membrana plasmática durante os procedimentos de criopreservação e aumentando a proteção espermática durante a refrigeração e a congelação/descongelação. Ao contrário da gema de ovo, o efeito protetor do leite sobre a célula espermática envolve proteínas ao invés de lipídeos.
No entanto, deve-se atentar para o fato de que os diluentes contendo compostos de origem animal são mais difíceis de padronizar, além do risco adicional da contaminação microbiana. Desta forma, foi proposto como alternativa o uso da lecetina de soja em substituição à gema de ovo, componente este usado no diluente Biociphos-Plus® (GIL, et. al. 2000).
Crepilho et al. (2012) comparando diluentes a base de gema de ovo (Botu-Bov®) e a base de lecitina de soja, observaram que os diluentes a base de lecitina de soja são uma opção para reduzir os risco de biológicos de produtos à base e origem animal no meio diluente, entretanto a utilização de gema de ovo de forma geral apresenta melhores resultados de cinética espermática e integridade de membrana espermática após a descongelação. Resultados semelhantes foram observados por Leite et al. (2010).
2. Princípios da Criopreservação
entorno de 50%. Dessa forma, quando os espermatozoides são mantidos a 5oC, apenas 10% de seu metabolismo é necessário para sua sobrevivência quando comparado à preservação a 38ºC. Portanto, a refrigeração reduz o catabolismo espermático, o que é necessário para a preservação do ejaculado por longos períodos (SQUIRES et al., 1999).
Com a redução da temperatura os lipídios da membrana passam de um estado fluido, no qual as cadeias de ácidos graxos são relativamente desorganizadas, para um estado de gel, em que as cadeias dos ácidos graxos são rígidas e paralelas (AMANN e GRAHAM, 1993).
O sêmen resfriado de 37°C a 5°C a taxa de refrigeração deve ser controlada, principalmente entre 19°C e 8°C, não ultrapassando valores superiores a -0,05°C/min, intervalo este em que pode ocorrer o choque-térmico (MORAN et al., 1992), pois os lipídeos da membrana estão passando pela fase de transição do estado fluido para o gel (STRYER, 1992).
A desorganização no mosaico fluído da membrana, como assimetrias na bicamada lipídica e sua interação com as proteínas devido ao choque térmico, pode provocar alterações nos receptores de membrana, e alterar suas funções. A capacidade fecundante dos espermatozoides pode ser afetada uma vez que a membrana plasmática pode sofrer mudanças na permeabilidade, função e metabolismo (AMANN e GRAHAM, 1993).
Essas alterações são caracterizadas pelo movimento anormal de deslocamento, queda na motilidade espermática, lesões nas membranas, redução do metabolismo e perda das enzimas e outros componentes (AURICH, 2005). Os danos celulares podem ser minimizados pela adição de lipídeos (gema do ovo) ou lipoproteínas (leite) ao diluidor (AMANN e GRAHAM, 1993; GRAHAM, 1996).
A curva de congelação apresenta uma relação direta com os efeitos deletérios impostos aos espermatozoides principalmente nas membranas plasmáticas, pois se a mesma é rápida, não há tempo para que ocorra a desidratação dos espermatozoides, o que possibilita a formação de gelo intracelular, que é prejudicial à célula. Em casos de curva de congelação lenta, haverá a desidratação dos espermatozoides impedindo a formação de gelo intracelular, porém a alta concentração de solutos também pode causar danos à célula (WATSON, 1995).
O processo de reaquecimento da célula após a descongelação também podem causar danos, uma vez que a membrana é submetida a rearranjos estruturais envolvendo lipídios e proteínas e a passagem rápida de água para o interior da célula pode causar o rompimento das membranas (HOLT, 2000; WATSON, 1995). Assim, a fase de descongelação é tão importante quanto à congelação para a sobrevivência da célula.
No entanto mesmo com os avanços tecnológicos ainda há um decréscimo de 50% a 60% da viabilidade da população espermática, uma vez que se observa diversas alterações bioquímicas e estruturais. (WATSON, 1995).
3. Sêmen Bovino Refrigerado
Verberckmoes et al., (2005), sugerem que a utilização do sêmen refrigerado para Bovinos é uma alternativa ao sêmen congelado devido a redução das injúrias decorrentes do processo da congelação. No Brasil a utilização de sêmen refrigerado vem crescendo principalmente devido ao aumento do uso da Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF) (CRESPILHO, 2010).
O sucesso da preservação do sêmen na forma líquida (refrigerado) depende dos procedimentos relacionados à manipulação seminal, destacando o efeito significativo dos meios diluidores para preservação dos espermatozoides (KANNKOFER et al., 2005). A gema de ovo representa uma das principais fontes de proteínas e lipídeos dos meios de manutenção do sêmen no estado líquido (MEDEIROS et al., 2002).
Blesbois et al.,(1999) estudando os efeitos da refrigeração sobre os componentes lipídicos da membrana plasmática de espermatozoides de aves, constaram uma diminuição dos lipídios totais de 820 para 620 µg/109 espermatozoides, após 48 horas de armazenamento a 50C e também uma diminuição dos fosfolipídios de 75 a 60% e concluíram ocorrer uma lise dos lipídios, peroxidação e/ou um metabolismo endógeno dos lipídios da membrana espermática capazes de alterar sua composição, metabolismo e capacidade de fusão.
Para a utilização do sêmen refrigerado, deve-se efetuar uma taxa de refrigeração lenta igual ou inferior a 0,05 ºC/min até os 5oC para evitar os danos causados pelo choque frio. Para isso, pode ser utilizar dispositivos automáticos ou passivos, de tal maneira que a queda da temperatura seja promovida de maneira constante e homogênea (WATSON, 2000; MEDEIROS et al., 2002).
Crespilho et al., (2012) observaram efeito benéfico da adição de crioprotetor sobre a manutenção da motilidade e integridade acrossomal de sêmen ovino refrigerado.
Silva et al., (2012) utilizando um touro nelore de fertilidade comprovada, compararam amostras de sêmen congelada, contendo 16x106/ espermatozoides moveis, com amostras refrigeradas (32x106;64x106 espermatozoides) em meio diluidor Bovimix® (Nutricell, Campinas-SP) e constataram que não houve diferença estatística entre as taxas de concepção para os grupo testados.
4. Inseminação Artificial em Tempo Fixo
A inseminação artificial em tempo fixo (IATF) é uma biotécnica que visa aumentar a produtividade dos rebanhos de cria. Gottschall et al. (2008), evidenciam que a IATF permite antecipar a concepção e a parição dentro das respectivas estações reprodutivas, além de aumentar a probabilidade de nova prenhez na estação subsequente e concentrar os nascimentos.
A IATF cresceu significativamente no Brasil nos últimos anos e estima-se que foram efetuados aproximadamente cinco milhões de protocolos de IATF em 2010, com crescimento de cerca de 30% em relação a 2009 (Rocha, 2011). Esses valores levaram o Brasil a ser considerado o maior mercado de IATF do mundo, e a tendência é crescer ainda mais (Morgan, 2011).
Vários protocolos podem ser utilizados para o emprego da IATF em bovinos. Segundo Bó et al. (2002) e Baruselli et al.(2006), os protocolos para a IATF objetivam induzir a emergência de uma nova onda de crescimento folicular, controlar a duração do crescimento do folículo até o estágio pré-ovulatório dos animais tratados e induzir ovulação sincronizada.
Os principais fatores que afetam o sucesso da IATF são o custo do sêmen, o custo da inseminação e o sucesso do processo.
No entanto, os padrões de acasalamento sazonais em alguns países, como Nova Zelândia, Austrália e em menor escala, na Irlanda, permitem a distribuição de sêmen na forma líquida. A vantagem imediata deste processo é que o menor número de espermatozoides podem ser utilizados em uma única unidade de reprodução. No entanto, esta forma de armazenagem não tem flexibilidade comparado ao sêmen congelado.
congelado e resultaram em taxas de não retorno ao cio aos 57 dias de 51.7% e 50.4% respectivamente.
Fujita et. al. (2013), compararam amostras de sêmen refrigerados a 5°C/ 24 horas e congeladas com diluidor único a base de gema de ovo sem e com glicerol respectivamente. As analises subjetiva da motilidade espermática mostraram resultados de 85 e 50% para amostras refrigeradas e congeladas. A fertilidade foi testada em programas de IATF e foram obtidas taxa de prenhez de 48,9 e 46,9 para os grupos refrigerados e congelados respectivamente, não sendo observado diferença (p>0,05).
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PAPER QUE SERÁ ENVIADO À REVISTA THERIOGENOLOGY- ISSN 0093-691X
EFEITO DA INCORPORAÇÃO DO GLICEROL SOBRE A VIABILIDADE E FERTILIDADE DO SÊMEN BOVINO REFRIGERADO.
Papa, P.M.a; Maziero, R.R.D. a; Guasti, P.N. a Junqueira, C.R.b; Dell’Aqua Freitas, C.P.a; Papa, F.O.a; Vianna, F.P.b; Dell’Aqua Junior, J.A.a
a Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, Brasil. b Médicos Veterinários autônomos.
E-mail:dellaquajunior@uol.com.br
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, São Paulo, 18610-970, (14) 38802119, Fax: (14) 38802119, Botucatu, São Paulo, Brasil.
RESUMO
crio), 268 para (BB s/ crio) e 216 para (BB). Os índices de concepção foram de 51%a,44%ab e 41%b respectivamente para (BB c/ crio), (BB s/ crio) e (BB) (p< 0,05). A partir dos resultados alcançados pode-se concluir que houve uma melhor preservação espermática das amostras mantida sob refrigeração com crioprotetor glicerol à 5°C/24horas, quando comparado com a amostra congelada. Esses resultados promovem a perspectiva da maximização de touros da fazenda utilizados em monta natural e animais geneticamente superiores que não apresentam índices de congelabilidade satisfatórios serem utilizados como doadores de sêmen em programas de IATF.
Palavras chave: bovino, sêmen, refrigerado, inseminação artificial com tempo fixo.
1. INTRODUÇÃO
Dentre as biotecnologias utilizadas a inseminação artificial destaca-se como eficiente e importante na melhoria genética dos rebanhos.
Antes do processo de congelação e descongelação a inseminação artificial era realizada tão somente com amostras de sêmen na forma liquida. Entretanto com a descoberta dos agentes crioprotetores e avanços na produção de meios diluidores, gradativamente a utilização de sêmen bovino fresco ou refrigerado foi abandonada em virtude dos evidentes benefícios relacionados à criopreservação [1].
O sêmen criopreservado geralmente fornece menores taxas de fertilidade em relação ao sêmen fresco, quando números similares de espermatozoides móveis são comparados. Essa queda da fertilidade pode ser justificada pelas mudanças de temperatura durante o processo de congelação, o estresse osmótico e toxico pela exposição aos crioprotetores e a formação de cristais de gelo [2].
O processo de criopreservação das células espermáticas resulta na diminuição da fertilidade quando comparado com sêmen fresco. Este prejuízo surge da combinação de dois aspectos, perda da viabilidade espermática ou danos na capacidade funcional dos espermatozoides sobreviventes [2].
O sucesso da preservação do sêmen na forma líquida (refrigerado) depende dos procedimentos relacionados à manipulação seminal, destacando o efeito significativo dos meios diluidores para preservação dos espermatozoides [4].
Apesar de terem descoberto as qualidades crioprotetoras do glicerol há sete décadas, ainda hoje, pouco se sabe a respeito sua real ação sobre os espermatozoides [5].
Alguns autores, sugerem que o glicerol poderia interagir com espermatozoides bovinos, sendo metabolizado e convertido em um estoque extra de glicose, que seria utilizado posteriormente durante o processo de fertilização [6,7].
A hipótese que o mecanismo de proteção desta molécula o glicerol se deve à capacidade de ligação dos átomos de hidrogênio dos grupos hidroxila com os átomos de oxigênio dos grupos fosfato das membranas do espermatozoide, promovendo assim a estabilização da membrana durante o processo de criopreservação [8].
O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito da refrigeração do sêmen bovino em diluidor com ou sem crioprotetor glicerol e do sêmen congelado, sobre os parâmetros espermáticos in vitro e nos índices de fertilidade em programas de IATF.
2. MATERIAL E MÉTODOS
Todos os reagentes utilizados neste experimento foram adquiridos da Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO.)
2.1. Animais, processamento das amostras e protocolo IATF
localizada no estado de São Paulo. Durante os meses de outubro de 2011 a abril de 2012. Foram utilizados 30 touros Bos taurus indicus, raça Nelore, com idades entre 24 a 30 meses pertencentes a Fazenda e Haras Braido, município de Cerqueira Cesar- SP, para as análises in vitro. Para o teste de fertilidade foram utilizados 3 touros Bos taurus indicus, raça Nelore e 762 vacas Bos taurus indicus, raça Nelore, multíparas e lactantes (60 a 90 dias pós parto) com escore de condição corporal 2,5 e 3,5 (escala de 1,0 a 5,0) localizada em Fazenda São Marcos no Mato Grosso.
As amostras seminais utilizadas foram obtidas através de eletroejaculação. Os ejaculados foram colhidos e avaliados subjetivamente no ato da colheita quanto a motilidade total, vigor, concentração espermática e posteriormente a morfologia com o uso da microscopia de interferência digital. Os touros foram considerados aptos ao experimento apenas quando apresentaram no mínimo 80% de células moveis totais, vigor 3 (1-5), concentração espermática superior a 2 bilhões por ejaculado e porcentagem de defeitos maiores e menores inferior a 20 e 10%, respectivamente. Após a triagem inicial cada ejaculado foi fracionado em quatro alíquotas que foram divididas da seguinte forma. 1- Fresco (sem diluidor), 2- Diluidor BotuBov® (Botupharma Ltda, Botucatu, São Paulo, Brasil) contendo 7% de crioprotetor (Glicerol-Merck®), 3- Diluidor BotuBov® sem o crioprotetor, 4- Diluidor BotuBov® contendo 7% de crioprotetor. A concentração espermática nas amostras diluídas foi ajustada para 40 milhões de espermatozoides totais por mL de diluidor e envasadas em palhetas francesas de 0,5 mL (IMV® Tecnologies L’Aigle Cedex, France) em todos os grupos estudados. Posteriormente, as amostras 2 e 3 foram acondicionadas em container de refrigeração passiva modelo (Botuflex®-BotupharmaLtda, Botucatu, São Paulo, Brasil), por 24 horas. Esse dispositivo realiza uma curva de refrigeração de aproximadamente 0,05oC/min, estabilizando sua temperatura a 5oC. A alíquota 4 foi submetida ao processo de congelação, de acordo com [9].
Tecnopec, São Paulo, Brasil), 150 mg de Hormônio Folículo Estimulante, FSH (Folltropin®, Tecnopec, São Paulo, Brasil) 1 mg de benzoato estradiol, (Estrogin®, Farmavet, São Paulo, Brasil) e remoção dos implantes. As inseminações foram realizadas de 48 a 52 horas após a retirada dos dispositivos de progesterona. Os índices de concepção foram determinados por palpação retal e ultra-sonografia aos 60 dias pós-IATF.
2.2. Análises Espermáticas
As amostras seminais foram avaliadas no momento da chegada do laboratório (Fresco) e 24 horas após o processo de refrigeração (Refrigerado) e no grupo congelado, após a descongelação (37ºC/30 segundos). Para tal, uma alíquota de cada amostra foi depositada em tubo Eppendorf® de 1,5 mL, incubada em “banho-seco” a 37°C por 5 minutos antes das análises. Para as seguintes variáveis:
2.2.1. Avaliação da Cinética Espermática
Tabela 1 – Metodologia da análise computadorizada (CASA) da cinética espermática de bovinos.
Parâmetros Ajustado para
Número de frames 30
Contraste mínimo 60 pixels
Tamanho mínimo da célula 6 pixels
Contraste para célula 60 pixels
Linearidade 70%
Média mínima para VAP < 40 µm/s
Mínimo VAP para células progressivas < 30 µm/s Mínimo VSL para células lentas < 20 µm/s Tamanho de cabeças estáticas 0,30 a 7,89 Intensidade de cabeças estáticas 0,41 a 1,19 Elongação de cabeças estáticas 96 – 0
Magnificação 1,95
Temperatura 37oC
Abreviaturas: VAP, velocidade de trajeto; VSL, velocidade linear.
2.2.2. Avaliação das características avaliadas por Citometria de Fluxo
Para as análises de citometria de fluxo, foi utilizado o equipamento BD LSR Fortessa (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA) equipado com lasers: azul 488-nm, 100 mW, vermelho 640-488-nm, 40 mW e violeta 405-488-nm, 100 mW. Os dados foram avaliados pelos programas BD FACSDiva™ software v6.1 e WinList 6.0 (Verify software house). As amostras foram analisadas a uma taxa de aquisiçãode 800 eventos /segundo e foram adquiridas 10000 células por amostra. Os debris celulares e partículas foram excluídos da aquisição e análise pelos ajustes no thresold e pela marcação com Hoescht 33342 (100µg/mL) excitado pelo laser violeta.
2.2.2.1. Avaliação simultânea das membranas plasmática e acrossomal
Para cada amostra de 200 µL de sêmen diluído em TALP-PVA na concentração de 5x106 espermatozóides/mL foram adicionados 5 µL de H3342 (100µg/mL), 5 µL de IP (50µg/mL) e 1 µL de FITC-PSA (100µg/mL), e então homogeneizados e incubados por 15 minutos ao abrigo da luz à 37ºC [10].
2.2.2.2. Avaliação da capacitação espermática
Amostras de sêmen foram diluídas em TALP-PVA na concentração de 1x106 espermatozóides/mL então adicionou-se 5 µL de H3342 (100µg/mL), 5 µL de IP (50µg/mL) e incubados por 10min, após esse período 6 µL do anticorpo antifosfotirosina (100 μg/mL-CLONE PY-20, F0426 – Sigma), previamente diluído em uma solução super saturada de O-Phospho-L-tyrosine (P9405, Sigma) de modo que a concentração final do anticorpo fosse 2 µg/mL,foi adicionado a amostra e incubado por mais 5 minutos nas mesmas condições de acordo com [11].
2.2.2.3. Avaliação da peroxidação das membranas espermáticas
Este ensaio foi realizado utilizando a probe C11-BODYPY (D-3861; Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, EUA). Em uma aliquota de 100 µL do sêmen diluído em TALP a uma concentração de 10x106 espermatozoides/mL foi acrescido mais 399,5μL de TALP, fixando a concentração de 1x106 espermatozoides 0,5μL da sonda C11BODIPY581/591 foi adicionada incubando-se a amostra (1mg/mL - Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, EUA) por 20 minutos à 37ºC. Após o período de incubação a amostra foi centrifugada a 300g por 5 min e ressuspendida para 500 µL, e então, foram adicionados 5 µL de IP (50µg/mL) e 5 µL de Hoechst (100µg/mL). A amostra foi novamente incubada por 10 minutos a 37ºC [12].
2.2.2.4. Índice de Fragmentação de DNA
dissódico, 0,790g de Tris-HCl, 4,380g NaCl em 500 mL água deionizada, pH 7.4) na concentração de 1 x 106 espermatozoides/mL foi adicionado 400 μL de solução detergente ácida (2,19 g NaCI, HCI 1,0 mL de 2N solução, 0,25 mL Triton-X, em qsp. 250 ml de água deionizada, pH 1,8), incubadas por 30 segundos e então acrescido 1mL de solução corante de laranja de acridina (AO; 3,8869 g de ácido cítrico mono-hidratado, 8,9429 g Na2HPO4, 4,3850g NaCI, 0,1700g de EDTA dissódico, 4 μg/ml de solução laranja de acridina – 1 mg/mL, em qsp. 500 ml de água, pH 6.0), incubadas por mais 30 segundo ao abrigo da luz. As amostras foram então analisadas por citometria de fluxo em 5 minutos e os dados gerados foram analisados pelo software WinList 6.0 (Verify software house). O índice de fragmentação de DNA (IDF) foi gerado a partir da análise de 10.000 células marcadas com laranja de acridina. O IDF é a proporção, expressa em porcentagem do DNA do espermatozoide, do DNA fragmentado (fluorescência vermelha) dividida pela fluorescência total, ou seja, a soma do DNA fragmentado (fluorescência vermelha) com o DNA não fragmentado (fluorescência verde).
2.2.2.5. Concentração de espécies reativas de oxigênio
Para esta análise foi utilizada a sonda 5-(and-6) -carboxy-2’,7’ -dichlorodihydro-fluoresceindiacetate (carboxy-H2DCFDA; Molecular Probes) de acordo com Guthrie e Welch (2006). As sondas DCFDA (20µM), iodeto de propídio (50µg/mL) e Hoescht 33342 (100µg/mL) foram adicionados a amostra de sêmen diluído em TALP-PVA na concentração de 5x106 espermatozóides/mL. Esta mistura foi incubada a 25º.C por 60 minutos ao abrigo da luz.
2.3. Experimento 1: Avaliação das características seminais in vitro de sêmen fresco, refrigerado e congelado de bovinos
1- Fresco, sem diluidor
2- Diluído em BotuBov® com 7% de Glicerol, para refrigeração = BB C/Crio 3- Diluído em BotuBov® sem Glicerol, para refrigeração = BB S/Crio
4- Diluído em BotuBov® com 7% de Glicerol, para congelação = BB
Posteriormente as amostras foram acondicionadas conforme descrito no item 2.1. A amostra a fresco foi acondicionada em um tubo falcon de 15 mL em caixa isotérmica para transporte até o laboratório. As alíquotas 2 e 3 foram colocadas em container BotuFlex® destinado a refrigeração do sêmen e as amostras destinas a congelação foram dispostas em uma caixa de isopor previamente refrigerada a 5oC e posteriormente congeladas. As análises espermáticas foram efetuadas nos momentos descrito no item 2.1. e os parâmetros espermáticos aferidos conforme descrição no item 2.2.
2.4. Experimento 2: Teste de fertilidade utilizando sêmen refrigerado e congelado de bovinos.
Para o teste de fertilidade foi utilizado um pool de ejaculados de 3 touros. Após a homogeneização dos ejaculados o pool foi dividido em 3 partes, duas destinadas a refrigeração em diluidor com ou sem crioprotetor e uma para congelação, conforme já descrito no item 2.1, este procedimento foi realizado duas vezes com os mesmo animais, devido as IATF serem efetuadas em 2 etapas.
2.5. Análise Estatística
Todas as análises estatísticas foram efetuadas através do programa Instat 5.0 (GraphPad Software Inc, USA). Para as análises in vitro das características espermáticas foi realizado o teste de variância (ANOVA) seguido do teste de Tukey, quando necessário. Já para a avaliação dos resultados do teste de fertilidade utilizou-se o teste Exato de Fisher. Todas os resultados foram consideradas significativas quando p<0,05.
3. Resultados
Experimento 1
Tabela 2 – Valores médios e erro padrão das variáveis da cinética espermática analisadas pelo CASA, de amostras do sêmen Fresco, Refrigerado 5oC/24h e congelado de bovinos.
Variáveis Fresco Refrigerado Congelado
BB C/Crio BB S/Crio BB
MT (%) 89,9 ± 0,9a 89,7 ± 0,9a 88,4 ± 1,0a 76,3 ± 1,6b MP (%) 69,9 ± 1,1a 58,3 ± 1,5b 65,2 ± 1,7a 58,2 ± 1,6b VAP (µm/s) 96,3 ± 2,8a 101,1 ± 4,1a 92,7 ± 3,7a 78,4 ± 1,9b VSL (µm/s) 81,3 ±2,1a 76,1 ± 2,3a 76,2 ± 2,0a 65,7 ± 1,6b VCL (µm/s) 147,1 ± 5,0b 174,7 ± 7,6a 148,8 ± 6,7b 121,8 ± 3,3c ALH (µm) 5,3 ± 0,2b 6,8 ± 0,3a 5,6 ± 0,3b 4,8 ± 0,1b BCF (Hz) 31,6 ± 0,6a 26,0 ± 0,9b 30,5 ± 1,0a 31,6 ± 0,8a STR (%) 83,5 ± 0,6a 76,2 ± 1,1b 81,8 ± 1,1a 84,1 ± 0,7a LIN (%) 58,2 ± 1,1a 47,1 ± 1,0b 55,2 ± 1,4a 57,0 ± 1,0a RAP (%) 87,4 ± 1,2a 86,0 ± 1,3a 84,4 ± 1,4a 71,3 ± 1,7b
abc Letras diferentes na mesma linha diferem estatisticamente entre si p<0,05.
Motilidade Total (MT), Motilidade Progressiva (MP), Velocidade de Trajeto (VAP), Velocidade Progressiva (VSL), Velocidade Curvilinear (VCL), Amplitude do deslocamento Lateral de Cabeça (ALH), Freqüência de Batimentos de Cauda (BCF), Retilinearidade (STR), Linearidade (LIN), Espermatozóides Rápidos (RAP).
BB = Diluidor BotuBov; BB C/Crio = BB com crioprotetor; BB S/Crio = BB sem crioprotetor.
Tabela 3 – Valores médios e erro padrão das variáveis analisadas por Citômetro de fluxo, de amostras do sêmen Fresco, Refrigerado 5oC/24h e Congelado de bovinos.
Variáveis Fresco Refrigerado Congelado BB C/Crio BB S/Crio BB
PL (%) 5,5±0,7 6,4±0,9 7,6±1,1 4,6±0,8 ROS (%) 5,1±1,0 5,4±0,8 6,2±1,0 6,3±0,9 IMPA (%) 73,7±2,6a 76,5±2,2a 76,1±2,2a 40,7±1,9b CAP (%) 1,3±0,1 1,5±0,1 1,5±0,1 2,2±0,3 DNA (%) 0,9±0,1a 1,2±0,1a 1,1±0,1a 1,6±0,1b
abLetras diferentes na mesma linha diferem estatisticamente entre si, p<0,05,
Espermatozóides Íntegros; com Peroxidação Lipídica (PL), Estresse Oxidativo (ROS), Membrana Acrossomal e Plasmática (IMPA), Capacitados (CAP), Fragmentação de Cromatina (DNA), BB = Diluidor BotuBov; BB C/Crio = BB com crioprotetor; BB S/Crio = BB sem crioprotetor.
Experimento 2
Analisando os dados obtidos no teste de fertilidade, foi observado que a taxa de prenhez foi significativamente superior no grupo refrigerado com glicerol em relação aos índices encontrados nas vacas inseminadas com sêmen congelado. E os animais que foram inseminados com sêmen refrigerado sem a presença do glicerol apresentaram valores similares entre os outros dois grupos estudados, conforme descrição (tabela 4).
Tabela 4 – Número de animais e porcentagem da taxa de prenhez aos 60 dias pós IATF, de amostras do sêmen Refrigerado com ou sem crioprotetor à 5oC/24h e
Congelado de bovinos.
Grupos Taxa de Prenhez
BB C/Crio 142/278 (51,0)a
BB S/Crio 119/268 (44,0)ab
BB Congelado 88/216 (41,0)b
ab Letras diferentes na mesma coluna diferem estatisticamente entre si p<0,05.
4. DISCUSSÃO
Apesar de Polge et al., [5] terem descoberto as qualidades crioprotetoras do glicerol há sete décadas, ainda hoje, pouco se sabe a respeito de sua real função sobre os espermatazoides.
Mann e Write, [6] e Mohri e Masaki, [7], sugerem que o glicerol pode interagir com espermatozoides bovinos, sendo metabolizado e convertido em um estoque extra de glicose, que seria utilizado posteriormente durante o processo de fertilização.
Nesse sentido, a utilização do glicerol em diluidores destinados a refrigeração de espermatozóides bovinos, poderiam apresentar melhores taxas de fertilidade em relação aos refrigerados sem esse crioprotetor, adicionalmente este tipo de preservação espermática na forma líquida contendo o glicerol, também apresentaria vantagens em relação ao procedimento da congelação (utilizando o glicerol como crioprotetor), uma vez que a quantidade de lesões a ultra-estrutura espermática é menor no processo da refrigeração.
A queda acentuada dos parâmetros espermáticos ocorrida nas amostras congeladas era esperada, pois vários autores já haviam constatado resultados semelhantes que são causados pelos danos nos espermatozoides e que podem ser ultra-estruturais, físicos, bioquímicos ou funcionais [2,14,15,16,17]. Corroborando com os achados deste experimento onde a porcentagem de células com as membranas plasmáticas e acrossomal intactas, foram significativamente menores nas amostras que foram submetidas ao processo de congelação. Januskauskas et al., [18] verificaram que mudanças da membrana pode estar relacionadas a danos do DNA após criopreservação do sêmen bovino pois encontraram correlação significativa entre a porcentagem de células com desnaturação do DNA, mensurada pela acridina laranja. Este achado também foi observado no presente trabalho, haja vista que a fragmentação do DNA foi maior nas amostras que foram congeladas.
Os resultados apresentados na tabela 2 mostram uma similaridade entre as amostras refrigeradas com e sem crioprotetor por 24 horas de refrigeração a 5°C em relação ao sêmen fresco. Entretanto estas de um modo geral apresentaram resultados superiores às congeladas.
Quando se compara as amostras com e sem crioprotetores observa-se uma queda da motilidade progressiva do grupo refrigerado com glicerol em relação às demais e semelhante as congeladas. Isto deve ter ocorrido em função da presença do glicerol nestes meios por possuir alta osmolaridade, o que pode ter causado uma desidratação celular concomitantemente com uma alta viscosidade do meio PARKS e GRAHAM [20]; WATSON, [15], bem como a densidade do meio pode interferir na velocidade espermática diminuindo a amplitude flagelar MORTINER [21], enquanto que Hirai et al., [22] descreveram que a velocidade dos espermatozoides é inversamente proporcional a viscosidade do meio. Celegnini et. al. [17] observaram superioridade das variáveis de velocidade quando comparou a congelação com o meio BotuBov® considerado denso (gema de ovo + glicerol) com o meio Bioxcell® com menor densidade (lecitina de soja) enquanto que Chacur et al., [23] também comparando BotuBov®, Tris, BotuBov Egg Free na criopreservação e observaram melhores resultados das motilidades e velocidades do meio BotuBov Egg Free e concluíram que estaria ligado a menor densidade do diluidor. Resultados semelhantes foram obtidos por Crespilho et. al. [24] que analisando amostras de sêmen refrigeradas de bovinos por 24 e 48 horas obteve menores índices de motilidade progressiva e maior lineralinadade espermática do meio BotuBov Lecitina de soja em relação ao diluidor TRIS e concluiu que os resultados observados estariam confirmando os obtidos por Celegnini et. al. [17].
No presente trabalho os resultados de VAP e VSL foram inferiores no grupo de amostras congeladas em relação aos demais, e isto está ligado às injurias ocasionados pelo processo de congelação [17,24,23].
mesmo não foi observado para o grupo congelado, pois o processo de criopreservação deve ter promovido danos celulares significativos e irreversíveis. Segundo Vestegen et al., [25] o VCL e o ALH tem mostrado grande correlação com a taxa de fecundação in vitro de oócitos. Essa alteração da característica da viabilidade espermática foi evidenciada para amplitude do deslocamento lateral de cabeça (ALH) onde as refrigeradas apresentaram características de lateralização diferentes para os grupos com e sem glicerol, ajudando os achados, uma vez que o glicerol pode ser o responsável por essa mudança. Já nas amostras congeladas essa característica fica difícil de ser visualizada, pois essas amostras sofreram o processo de congelação. Os resultados observados aos de Celegnini et. al. [17] e diferentes de O’Cornell et al., [26] que não observaram diferenças de ALH entre sêmen fresco e criopreservado. Os valores obtidos foram contrastantes aos obtidos por Arruda et al., [27] que afirmou quanto maior o valor numérico do ALH se traduz em pior qualidade espermática.
Para os resultados de BCF, foram encontrados resultados intrigantes, pois as amostras refrigeradas com glicerol apresentaram os menores valores quando comparadas aos demais grupos, isto pode ter ocorrido possivelmente pelo direcionamento do gasto de ATP para as reações bioquímicas ocorridas em uma provável gliconeogenese no sentido de promover um aporte adicional de energia para célula, processo este descrito por Mann & Write,[6], entretanto esse fenômeno não foi observado nas amostras congeladas, provavelmente devido ao processo da criocapacitação que se instala em espermatozoides descongelados, dessa forma, estes podem estar apresentando um gasto aumentado de ATP devido ao início do processo de hiperativação em que o metabolismo celular é maior. Esse estado criocapacitado não foi visualizado pelo teste utilizado no presente experimento, que evidencia momentos mais tardios do processo de capacitação. Segundo Vestengen et al., [25] as crioinjúrias causadas nos espermatozoides durante os processos de refrigeração e principalmente congelação podem levar as células espermáticas a apresentar lesões compatíveis a capacitação e que comprometem a longevidade espermática.
espermática, resultados semelhantes aos encontrados por Celegnini [17] e que haviam sido esclarecidos por Mortiner [21] afirmando que a densidade do meio pode influenciar na velocidade espermática e Hirai et al., [22] que a velocidade e diretamente proporcional a viscosidade do meio.
Os resultados de espermatozoides rápidos (RAP) no grupo congelado novamente apresenta resultados inferiores, devido ao processo de congelação e danos espermáticos na ultraestrutura e nas características física, bioquímicas e ou funcionais [15,2,17].
Quanto ao índice de integridade de cromatina as amostras refrigeradas foram superiores as congeladas e esta diferença se deve ao processo de criopreservação que pode incrementar as lesões apresentadas. De acordo com Bochenek et al., [28] pode existir correlação negativa entre os danos da estrutura da cromotina e fertilidade de sêmen congelado de touros.
Em relação aos índices de concepção, observados neste experimento foi verificado que a taxa de fertilidade no grupo congelado foi similar a observada nas amostras refrigeradas sem presença do glicerol, esse achado corroboram com observados por Fujita et. al. [29]. Entretanto, nas amostras refrigeradas com glicerol foi observado índices superiores aos observados no grupo congelado, resultados semelhantes aos obtidos por Crespilho et. al. [24]. Ratificando que a presença do glicerol na refrigeração de sêmen bovino é uma estratégia necessária para incrementar as taxas de prenhez em programas IATF.
5. CONCLUSÃO
animais geneticamente superiores, os quais o sêmen não suporta bem o processo da congelação em programas de IATF.
Agradecimentos
A Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo – FAPESP pelo apoio financeiro e a empresa Botupharma® pelo fornecimento dos meios diluidores.
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CONCLUSÕES GERAIS
ANEXO – NORMAS PARA PUBLICAÇÃO NA REVISTA THERIOGENOLOGY – ISSN 0093-691X
THERIOGENOLOGY - GUIDE FOR AUTHORS
INTRODUCTION
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Theriogenology is an international, peer-reviewed journal that publishes papers regarding the study of reproduction in domestic and non-domestic mammals, birds, reptiles, and fish. Theriogenology publishes only material that has never been previously published and is not currently being considered for publication elsewhere; the exception would be limited disclosure (e.g. publication of an abstract or in the proceedings of a scientific conference, with limited circulation).
Types of article
1. Original Research Papers (Regular Papers) 2. Review Articles
3. Technical Notes
Original Research Papers should report the results of original research. The material should not have been previously published elsewhere, except in a preliminary form. Review Articles should cover subjects within the scope of the journal that are of active current interest. They are usually invited, but prospective Authors may contact the Editors with proposals.
Technical Notes are concise, comprehensive descriptions of technical aspects of innovative methods (that will not be subsequently published as a full-length paper). The entire submitted manuscript typically should not exceed approximately 12 double-spaced pages.
Page Charges
Ethics in Publishing
For information on Ethics in Publishing and Ethical guidelines for journal publication seehttp://www.elsevier.com/publishingethics and http://www.elsevier.com/ethicalguidelin es
Policy and Ethics
The work described in your article must have been carried out in accordance with The Code of Ethics of the World Medical Association (Declaration of Helsinki) for
experiments involving
humanshttp://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html; EU Directive
2010/63/EU for animal
experimentshttp://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/legislation_en.htm; Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals http://www.icmje.org. This must be stated at an appropriate point in the article. Unnecessary cruelty in animal experimentation is not acceptable to the Editors of Theriogenology.
Conflict of Interest
All authors are requested to disclose any actual or potential conflict of interest including any financial, personal or other relationships with other people or organizations within three years of beginning the submitted work that could inappropriately influence, or be perceived to influence, their work. See alsohttp://www.elsevier.com/conflictsofinterest Submission Declaration
Submission of an article implies that the work described has not been published previously (except in the form of an abstract or as part of a published lecture or academic thesis), that it is not under current consideration for publication elsewhere, that its publication is approved by all authors and tacitly or explicitly by the responsible authorities where the work was carried out, and that, if accepted, it will not be published elsewhere in the same form, in English or in any other language, without the written consent of the copyright-holder.
Contributors
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Authorship
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