10. Análise de expressão de antígenos de L (L.) amazonensis
10.2. Expressão de antígenos glicolipídeos em cultura de
amazonensis
Levando-se em consideração que, quando o flebotomíneo pica o hospedeiro mamífero, a primeira etapa da infecção é a invasão de macrófagos por promastigotas de Leishmania spp. e sua posterior transformação para amastigotas, achou-se importante verificar a expressão dos antígenos glicolipídicos reconhecidos pelo mAb LST-2 durante este processo. Assim, formas promastigotas de L. (L.) amazonensis foram incubadas com culturas de macrófagos peritoneais. Após 1 hora de adesão a 23ºC, já se observa macrófagos com parasitas aderidos e macrófagos infectados. Como mostrado na Figura 22, após imunofluorescência indireta utilizando-se o mAb LST-2 os parasitas se apresentam bem fluorescentes. Forte fluorescência pode também ser observada na superfície dos macrófagos que apresentam parasitas aderidos/infectados.
As culturas de macrófagos após a infecção, por 1 hora a 23ºC, foram lavadas com PBS e mantidas a 37ºC em estufa de CO2 por 4 horas. Nestas condições, os parasitas que se encontravam aderidos na superfície do macrófago, foram internalizados. Em seguida, as culturas foram fixadas e analisadas por imunofluorescência com o mAb LST-2.
Figura 22. Imunofluorescência indireta do mAb LST-2 com macrófagos infectados com formas promastigotas de L. (L.)
amazonensis
Monocamadas de macrófagos infectados com formas promastigotas foram mantidas por 1 hora a 23ºC para adesão. As lamínulas foram fixadas e incubadas com o mAb LST-2, conforme descrito no item 14 de Métodos.
A e C: fluorescência (FITC);
B e D: fluorescência (FITC)+ DAPI; Verde: fluorescência (FITC);
Azul:DAPI. Barra: 10 µm.
A
B
C
D
C
D
A
B
C
D
C
D
Como mostrado na Figura 23, observa-se fluorescência em toda a superfície dos macrófagos infectados, e ainda chama a atenção a presença de vesículas fortemente fluorescentes no interior dos macrófagos infectados (setas brancas).
Figura 23. Imunofluorescência indireta do mAb LST-2 com macrófagos infectados com formas promastigotas de L. (L.)
amazonensis
Monocamadas de macrófagos infectados com formas promastigotas foram mantidas por 4 horas em meio RPMI completo após 1 hora de adesão a 23ºC. As lamínulas foram fixadas e submetidas a imunofluorescência indireta com o mAb LST-2, conforme descrito no item 14 de Métodos.
As setas brancas indicam as vesículas fluorescentes e as setas pretas indicam os parasitas infectando o macrófago. Barra: 10 µm.
DISCUSSÃO
Como as leishmanioses ainda são um grave problema de saúde pública no Brasil, e com o contínuo aumento das afecções causadas pelos parasitas das espécies de Leishmania, novas estratégias para o controle dessas endemias são requeridas. Assim, estudos, principalmente voltados à biologia dos parasitas, no sentido de melhor entender as moléculas que fazem parte da superfície desses tripanossomatídeos, podem contribuir para o controle e terapia desta parasitose. No presente estudo, a expressão de fosfolipídeos e glicolipídeos em formas promastigotas de
Leishmania (Leishmania) amazonensis foi analisada, e
comparada com a de amastigotas isolados de lesão de animais infectados, e a de amastigotas axênicos mantidos em cultura.
Para tal estudo foram produzidos e caracterizados dois anticorpos monoclonais, denominados LST-1 e LST-2, específicos para antígenos expressos na forma promastigota.
Inicialmente, a expressão de fosfolipídeos foi analisada em formas promastigotas de L. (L.) amazonensis mantidas em cultura por seis dias. Os fosfolipídeos foram extraídos dos parasitas com mistura de IPA/Hex/água e analisados por cromatografia em camada delgada de alta resolução (HPTLC), corada com reagente de Dittmer-Lester, específico para ligações fosfodiester presentes nos fosfolipídeos. Verificaram-se diferenças significativas no perfil de
fosfolipídeos de parasitas isolados de culturas em fase logarítmica e em fase estacionária de crescimento.
Enquanto as percentagens de IPC, PS, PE e Liso-PI são menores em parasitas na fase logarítmica do que em parasitas em fase estacionária, as percentagens de PI e PC são maiores em parasitas em fase logarítmica em comparação aos parasitas em fase estacionária. Em relação aos glicolipídeos não verificamos variação do perfil cromatográfico de glicolipídeos extraídos de parasitas na fase estacionária e logarítmica.
Com o intuito de produzir anticorpos dirigidos a glicolipídeos de promastigotas de L. (L.) amazonensis, o extrato lipídico total desse tripanossomatídeo foi submetido a uma série de purificações visando o enriquecimento de glicolipídeos e IPC na preparação a ser utilizada como imunógeno. Foram produzidos dois anticorpos monoclonais murinos, da classe IgM, denominados LST-1 e LST-2. Ambos os anticorpos reconhecem fortemente formas promastigotas de L.
(L.) amazonensis por imunofluorescência indireta, e não
apresentam reatividade com formas amastigotas isoladas de lesão de animais infectados com L. (L.) amazonensis.
O anticorpo LST-1, por imunofluorescência indireta, apresentou reatividade com promastigotas de todas as espécies de Leishmania analisadas, tanto do subgênero Leishmania, quanto do subgênero Viannia, isto é, com L. (L.) amazonensis,
mAb LST-1 também apresentou forte reatividade com epimastigotas de Trypanosoma cruzi.
Por cromatografia em camada delgada de alta resolução verificou-se que o antígeno, presente no extrato lipídico de promastigotas de L. (L.) amazonensis, reconhecido pelo mAb LST-1 é visibilizado: i) com primulina, indicando ser um componente lipídico; ii) corado com reagente Dittmer-Lester, indicando a presença de ligações fosfodiester; iii) não é corado pelo reagente de orcinol/H2SO4, indicando que não apresenta resíduos de carboidratos em sua estrutura; e iv) apresentou migração cromatográfica no solvente C:M:metilamina 40% (63:35:10; v/v/v) semelhante a inositol fosforilceramida isolado de Saccharomyces cerevisiae. Ainda, o antígeno reconhecido pelo mAb LST-1 mostrou ser resistente à hidrólise alcalina, condição em que fosfolipídeos derivados de glicerolipídeos (PE, PC, PS, PI, e Liso-PI) são lábeis, permanecendo intactos os derivados de esfingolipídeos. Assim, o IPC foi purificado de formas promastigotas de L. (L.)
amazonensis, por combinações de cromatografias em coluna
sílica gel, cromatografia de troca iônica em DEAE-Sephadex, cromatografia preparativa em camada delgada de alta resolução, e sua composição química confirmada por GC/MS. Inositol foi identificado pelos fragmentos de m/z 305 e 318, esfingosina, pelos fragmentos de m/z 73, 129 e 311, e os ácidos graxos, foram identificados principalmente pelos fragmentos de m/z 74 e 85.
A reatividade de LST-1 com IPC de formas promastigotas de outras espécies de Leishmania e de epimastigotas de T.
cruzi foi confirmada por imunocoloração de cromatografia em
placas de HPTLC com extratos lipídicos totais dos diferentes tripanossomatídeos. O mAb LST-1 apresentou reatividade somente com o componente que apresenta migração cromatográfica de IPC em promastigotas de L. (L.)
amazonensis, L. (L.) major, L. (L.) chagasi, L. (V.) braziliensis e epimastigotas de T. cruzi.
Por imunofluorescência indireta verificou-se que a delipidação de promastigotas de L. (L.) amazonensis com IPA:Hex:água, abole totalmente a reatividade de LST-1 com os parasitas fixados, indicando que os antígenos que apresentam o epítopo reconhecido por esse mAb são totalmente extraídos com esse solvente. O padrão de fluorescência do mAb LST-1 com os promastigotas fixados com formaldeído 2% não é homogêneo, e observa-se vesículas fortemente fluorescentes. Por outro lado, este mAb não é reativo com parasitas não fixados. Esses resultados sugerem que o IPC está críptico na membrana, sendo talvez expresso somente no folheto interno da membrana plasmática, e em vesículas internas do parasita.
Oxidação do inositol fosforilceramida com meta-periodato de sódio 50 mM, pH 4,5, condição que hidroxilas vicinais presentes no inositol são oxidadas, aboliu a reatividade do mAb LST-1 com este antígeno, indicando que o resíduo de inositol é essencial para o reconhecimento pelo mAb LST-1. Como o mAb LST-1 não reconhece PI ou Liso-PI, que apresentam
o inositolfosfato unido a diacilglicerol ou liso-acilglicerol respectivamente, deduz-se que a ceramida também é parte do epitopo reconhecido por este mAb.
O mAb LST-1 foi reativo com promastigotas de todas espécies analisadas de Leishmania, mais especificamente com inositol fosforilceramida. Nestes últimos anos vários autores tem proposto que o IPC está relacionado com processos de formação e transporte de vesículas (Denny & Smith, 2004, Denny et al, 2004; Zhang et al, 2003), e é um constituinte essencial para a formação dos “lipid rafts” em promastigotas de Leishmania, pois é o único esfingolipídeo descrito nestes parasitas, ao contrário de células de mamíferos, onde glicoesfingolipídeos e esfingomielina estão presentes. Trabalhos realizados em nosso laboratório por Yoneyama et al (2005) e Tanaka (2006) mostram que cerca de 80% do IPC de promastigotas de L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis estão presentes em microdomínios resistentes a detergentes não iônicos a 4º C, correspondendo aos ”lipid rafts". Apesar das funções associadas ao IPC, não detectamos IPC em formas amastigotas isoladas de lesão de animais infectados com L.
(L.) amazonensis, tanto pela ausência de um componente corado
com reagente de Dittmer-Lester com migração de IPC, quanto após imunocoloração da placa de HPTLC com o mAb LST-1, indicando que o IPC pode estar ausente ou estar sendo pouco expresso nessas formas do parasita. Zhang et al (2003), demonstraram por “Western blotting” que a expressão da subunidade 2 da enzima serina palmitoiltransferase,
responsável pela síntese da esfingosina, (precursor biossintético do IPC) é alta em promastigotas de L. major na fase logarítmica e início da estacionária, porém “down- regulada” nos parasitas metacíclicos e amastigotas. O que estaria de acordo com nossos resultados sobre a expressão de IPC em L. (L.) amazonensis. Por outro lado, recentemente este mesmo grupo de autores, Zhang et al (2005) descreveu que apesar da subunidade 2 da enzima serina palmitoiltransferase estar "down-regulada em amastigotas de L. major, estes parasitas expressam IPC em concentrações semelhantes aos promastigotas, eles sugerem que os amastigotas utilizam precursores da célula hospedeira. Uma explicação para a diferença de expressão entre o IPC de amastigotas de L. (L.)
amazonensis e L. (L.) major poderia ser devido a alta
expressão de antígenos glicoesfingolipídicos em amastigotas
de L. (L.) amazonensis (antígenos espécie-estágios
específicos, ausentes em promastigotas e em amastigotas de L.
major) que poderiam estar atuando nos microdomínios e na
formação de vesículas no lugar do IPC, em amastigotas de L.
(L.) amazonensis.
Um segundo anticorpo monoclonal, denominado LST-2, foi produzido utilizando como imunógeno a preparação enriquecida de glicolipídeos, e caracterizado. Este anticorpo, da classe IgM, também mostrou ser específico para formas promastigotas de L. (L.) amazonensis.
Por imunocoloração de placas HPTLCs desenvolvidas no solvente C:M:W (25:21:7; v/v/v) verificou-se que o anticorpo
LST-2 reconhece pelo menos 4 componentes glicolipídicos (denominados bandas a, b, c e d) visualizados com primulina e orcinol/H2SO4, indicando que esses antígenos possuem ácidos graxos e cadeias de carboidrato. Os glicolipídeos reconhecidos pelo mAb LST-2, não apresentam caráter acídico, uma vez que quando submetidos à cromatografia de troca iônica DEAE-Sephadex, não são retidos na coluna, sendo eluídos na fração C:M:W (30:60:8; v/v/v), ao contrário do IPC que é eluído da coluna de DEAE-Sephadex com 0,2 M de acetato de sódio em metanol. Os glicolipídeos reativos com LST-2 mostraram-se lábeis à hidrólise alcalina suave, indicando que não são glicoesfingolipídeos como os presentes em amastigotas de L. (L.) amazonensis (Straus et al, 1993), mas sim glicoglicerolipídeos, provavelmente GIPLs.
Nenhuma reatividade do mAb LST-2 foi detectada com os fosfolipídeos PE, PC, PS, PI, Liso-PI, por imunocoloração da cromatografia em placa de HPTLC desenvolvida no C:M:metilamina 40% (63:35:10; v/v/v). O tratamento dos glicolipídeos extraídos de L. (L.) amazonensis com m- periodato 50 mM, pH 4,5, aboliu 95% da reatividade do mAb LST-2, indicando que os resíduos de carboidratos são essenciais para o reconhecimento destes compostos pelo mAb LST-2.
Por imunofluorescência indireta, forte reatividade do mAb LST-2 foi detectada com formas promastigotas de L. (L.)
amazonensis, fixadas ou não com formaldeído 2%. Além disso,
mAb LST-2, aglutinaram, indicando que os antígenos reconhecidos por este anticorpo estão na superfície do parasita. Após delipidação dos promastigotas com IPA:Hex:água, nenhuma reatividade do mAb LST-2 foi observada
por imunofluorescência indireta. Ainda, por
imunofluorescência indireta com LST-2 foi verificado: i) nenhuma reatividade com formas amastigotas de L. (L.)
amazonensis isoladas de lesão, promastigotas de L. (L.)
chagasi, L. (L.) major e epimastigotas de T. cruzi; ii) forte
reatividade com formas amastigotas axênicos de L. (L.)
amazonensis; e iii) fraca fluorescência com promastigotas de
L. (V.) braziliensis. A reatividade de LST-2 com extratos
glicolipídicos de diferentes espécies de Leishmania foi também analisada por RIA e imunocoloração de placas de HPTLC. LST-2 apresentou alta reatividade somente com extratos lipídicos de formas promastigotas e amastigotas axênicos de
L. (L.) amazonensis, mais especificamente com os componentes
glicolipídicos denominados a, b, c e d presentes nestes parasitas. A baixa reatividade detectada em L. (V.)
braziliensis foi devida a presença de glicolipídeos que
comigram com os componentes a e b presentes nos
promastigotas. Os glicolipídeos a, b, c e d são expressos também em amastigotas axênicos de L. (L.) amazonensis, porém ausentes nos outros parasitas e em formas amastigotas isoladas de lesão de animais infectados com L. (L.)
amazonenis. Cabe salientar que o mAb LST-2 apresentou baixa
Leishmania do gênero Viannia analisadas , como L. (V.) guyanensis, L. (V.) panamensis e L. (V.) lainsoni.
Assim, nesta tese, foi mostrado de maneira clara que a expressão de componentes (glico)lipídicos da Leishmania varia com o desenvolvimento e ciclo evolutivo do parasita. Acompanhando-se a diferenciação de formas amastigotas isolados de lesão de hamster infectados com L. (L.)
amazonensis, para promastigotas verificou-se por
imunofluorescência indireta, que enquanto os parasitas não se diferenciaram, nenhuma fluorescência é observada com os mAbs LST-1 e LST-2, mas após 24 horas, no início da diferenciação para formas promastigotas, os parasitas já apresentam fraca fluorescência. Após 48 horas, com a total diferenciação a promastigotas, os parasitas apresentam forte marcação com os mAbs LST-1 e LST-2, como observado para as formas promastigotas mantidas em cultura. Cabe salientar, que padrão de reatividade similar é observado para a expressão do LPG, reconhecido pelo anticorpo VST1, uma vez que LPG não é expresso em amastigotas, e somente após a diferenciação passa a ser expresso em promastigotas (Tanaka, 2002).
O inverso é observado para a expressão de antígenos glicoesfingolipídicos de formas amastigotas de L. (L.)
amazonensis, que são reconhecidos pelo anticorpo monoclonal
ST-4, assim amastigotas apresentam forte fluorescência quando incubados com mAb ST-4, e após diferenciação para promastigotas não são reconhecidos pelo mAb ST-4, uma vez que
esses antígenos glicoesfingolipídicos não são mais expressos na superfície dos promastigotas (Tanaka, 2002).
Nossos resultados, mostram que a expressão de IPC, GIPLs e glicoesfingolipídeos é distinta em amastigotas de lesão, e amastigotas axênicos, indicando que as enzimas envolvidas na síntese desses antígenos, como por exemplo enzimas envolvidas na via biossintética de esfingolipípeos, e glicosiltransferases específicas, devem apresentar mecanismos específicos no controle de suas expressões nos promastigotas, amastigotas axênicos e amastigotas isolados de lesão. Recentemente, Holzer et al (2006) analisando transcriptoma de
L. mexicana mostraram diferenças significantes na expressão
de genes entre amastigotas isolados de lesão e de culturas axênicas, e ainda quando compararam a expressão desses genes em amastigotas axênicos e de lesão em relação aos promastigotas, verificaram que a maioria desses genes que são mais expressos em amastigotas axênicos, apresentam-se em níveis mais elevados em promastigotas, indicando que pelo menos para o controle da expressão desses genes os amastigotas axênicos apresentam características mais semelhantes aos promastigotas.
Uma vez que trabalhos de nosso grupo têm mostrado que GIPLs e GSLs presentes em parasitas estão envolvidos na interação do parasita com o macrófago (Straus et al, 1993; 1997; Suzuki et al, 2002; Tanaka, 2002 e Silveira et al, 2005), analisou-se a localização dos glicolipídeos reconhecidos pelo mAb LST-2 durante a infecção de macrófagos
murinos por formas promastigotas de L. (L.) amazonensis. Verificou-se que macrófagos infectados, com parasitas aderidos ou internalizados em um período de 1 a 4 horas após a infecção, apresentavam-se fortemente fluorescentes com mAb LST-2, sugerindo que glicolipídeos da membrana do parasita, reconhecidos por LST-2, estariam sendo incorporados na membrana do macrófago, sendo endocitados, uma vez que inúmeras vesículas fluorescentes com LST-2 foram visualizadas nos macrófagos. Estudos devem ser prosseguidos visando avaliar a biogênese destas vesículas, bem como o papel na infecção.
Nesta tese ficou evidente que IPC e glicolipídeos são componentes estágio-específicos de formas promastigotas de L.
(L.) amazonensis, sendo que suas expressões são semelhantes
em formas amastigotas axênicas. Verificou-se também que o IPC, esfingolipídeo não encontrado em humanos, é expresso na membrana de L. (L.) chagasi, L. (L.) major, L. (V.)
braziliensis e T. cruzi, sendo assim, enzimas envolvidas no
metabolismo podem ser alvo para drogas contra estas parasitoses. Os anticorpos LST-1 e LST-2 podem ser ferramentas importantes para a melhor caracterização destes lipídeos em outros microorganismos, bem como para o estudo da biogênese de vesículas, e processos de exocitose e endocitose.
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