EXPRESSÃO DA ISOFORMA i-NOS

A isoforma i-NOS é conhecida por ser uma isoforma expressa naturalmente em neurônios, e sua atividade traz uma contribuição expressiva para a quantidade de NO produzida nestas células. Deste modo, identificar a expressão de i-NOS em animais submetidos ao estresse por contenção mostra-se de grande importância para tentarmos correlacionar à ativação dos neurônios nitrérgicos com a isoforma de NOS que contribui para a produção desta molécula, bem como, correlacionar a expressão desta isoforma de acordo com a duração do estado de estresse por contenção.

Como pode ser observado na figura 16, houve aumento significativo da expressão da isoforma i-NOS entre o grupo estresse crônico e seu respectivo controle, este fato demonstra que, no estresse crônico, possivelmente, há uma produção aumentada de NO por esta via de produção.

Nesta figura, podemos ainda verificar que o grupo crônico quando comparado ao grupo estressado agudamente, apresenta, também o nível de expressão da isoforma i- NOS aumentada. O que nos indica que, provavelmente, o estresse a longo prazo tem uma relação íntima com altos níveis de NO. A literatura mostra que a produção de NO pela i-NOS é maior quando comparado com a produção pelas demais isoformas de NOS conhecidas. Segundo Dusting e Macdonald (1995) essa isoforma requer algumas horas para ser expressa, mas, uma vez sintetizada, sintetiza quantidades de NO, em concentrações molares maiores que as isoformas c-NOS.

Os efeitos deletérios o NO são desencadeados através de uma ação tóxica devido à reação do NO com o ânion superóxido (O2-) resultam na formação de peroxinitrito (ONOO-), um poderoso oxidante de proteínas. O ONOO- aumentando efetivamente a ação tóxica do NO e do O2– (BECKMAN; KOPPENOL,1996).

Os efeitos deletérios do estresse crônico assim se relacionam com os efeitos deletérios da maior produção de NO pela via da i-NOS. Efeitos estes que ainda não são desencadeados em curto prazo no estresse agudo.

Figura 16. Determinação da expressão proteica da enzima Óxido Nítrico Sintase Induzida (i-NOS) em hipocampo de ratos submetidos à estresse de contenção. Os valores apresentados foram expressos em unidades arbitrarias (u.a.) e estão representados em média ± e.p.m. Grupo controle agudo (Ctr. Agu. – n=5), Grupo estresse agudo (Str. Agu. – n=7), Grupo controle crônico (Ctr. Crôn. – n=5), Grupo estresse crônico (Str. Crôn. – n=6). *p<0,05.

6 CONCLUSÃO

- A produção de NO se dá por outra via que não a da p-nNOSser852.

- O desfavorecimento à homeostasia da circuitaria hipocampal pelo aumento da produção de NO, provavelmente, se dá através da via de produção da i-NOS.

- O estresse agudo não é capaz de produzir efeitos significativos sobre a produção do NO, no tocante a promover danos a homeostasia hipocampal.

REFÊRENCIAS

AXELSON, D. A., DORAISWAMY, P. M., BOYKO, O. B., RODRIGO, E. P., MCDONALD, W. M., RITCHIE, J. C. In vivo assessment of pituitary volume with magnetic resonance imaging and systematic stereology: relationship to dexamethasone suppression test results in patients. Psychiatry Res. 44(1):63 70.1992.

BAGASRA, O. Activation of inducible form of Inducible nitric oxide synthase in the brains of patients with multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 12041-5. 1995.

BAIN, M. J., DWYER, S. M., RUSAK, B. Restraint Stress Hippocampal Cell Proliferation Differently in Rats and Mice. Neuroscience Letters. 368:7-10. 2004.

BARONE, P., KENNEDY, H. Non-uniformity of neocortex: areal heterogeneity of NADPH-diaphorase reactive neurons in adult macaque monkeys. Cereb. Cortex 10:160–174. 2000.

BECKMAN, J.S., KOPPENOL, W.H. Nitric oxide, superoxide, and peroxinitrite: the good, the bad, and the ugly. Am. J. Physiol. 271: 1424-1459. 1996.

BEKRIS, S., ANTONIOU, K., DASKAS, S., PAPADOPOULOU-DAIFOTI, Z. Behavioural and neurochemical effects induced by chronic mild stress applied to two different rat strains. Behavioural Brain Research 161: 45–59. 2005.

BLOTTNER D., GROZDANOVIC, Z., GOSSRAU, R. Histochemistry of nitric oxide synthase in the nervous system. Histochemical Journal. 27: 785-811, 1995.

BRADY, D.R., CAREY, R.G., MUFSON, E.J. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-diaphorase (NADPH-d) profiles in the amygdala of human and New World monkey (Saimiri sciureus). Brain Res. 577:236–248. 1992.

BREDT, D.S., SNYDER, S.H. Transient nitric oxide synthase neurons in embryonic cerebral cortical plate, sensory ganglia, and olfactory epithelium. Rev. Neuron, 13:301–313. 1994.

BREDT, D.S., SNYDER, S.H. Nitric oxide mediates glutamate-linked enhancement of cGMP levels in the cerebellum. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86: 930-936, 1989.

BURWELL, R.D., AGSTER, K.L. Learning and Memory: A Comprehensive Reference. Memory Systems. 3:47-66. 2008.

BUTTERY, L.D.K. Inducible nitric oxide synthase is present witjin human atherosclerotic lesions and promotes the formation and activity of peroxinitrite. Lab. Invest. 85: 75-7. 1996.

CARRASCO, G., VAN DE KAR LD. Neuroendocrine Pharmacology of Stress. Eur. J. Pharmacol. 463: 235–272. 2003.

CRUZ-RIZZOLO, R. J., HORTA-JÚNIOR, B. J. A. C., BITTENCOURT, J. C., ERVOLINO E. A., OLIVEIRA J. A. A., CASATTI, C.A. Distribution of NADPH- diaphorase-positive neurons in the prefrontal cortex of the Cebus monkey. Brain Reserch. 1 0 8 3: 1 1 8 – 1 3 3. 2006.

DUSTING, G.J., MACDONALD, P.S. Endogenous nitric oxide in cardiovascular disease and transplantation. Ann. Med. 27: 395-406, 1995.

FRANCA, J.G., NASCIMENTO, J.L., PICANCO-DINIZ, C.W., QUARESMA, J.A., SILVA, A.L. NADPH-diaphorase activity in area 17 of the squirrel monkey visual cortex: neuropil pattern, cell morphology and laminar distribution. Braz. J. Med. Biol. Res. 30:1093–1105. 1997.

GABBOTT, P.L., BACON, S.J. Local circuit neurons in the medial prefrontal cortex in the monkey: II. Quantitative areal and laminar distributions. J. Comp. Neurol. 364:609–636. 1996.

GABBOTT, P.L.A.; BACON, S.J. Localisation of NADPH diaphorase activity and NOS immnoreactivit in astroglia in normal adult rat brain. Brain Research, 28:791- 814. 1996.

GAMARO GD, XAVIER MH, DENARDIN JD, PILGER JA, ELY DR, FERREIRA MB. The effects of acute and repeated restraint stress on the nociceptive response in rats. Physiol. Behavior. 63:693–725. 1998.

GAMEIRO, G. H., GAMEIRO, P. H. ANDRADE, A. S., PEREIRA, L. F. ARTHURI, M. T., MARCONDES, F. K., VEIGA, M. C. F. Nociception- and anxiety-like behavior in rats submitted to different periods of restraint stress. Physiology & Behavior. 87(4):643-649. 2006.

GIL, V., BICHLER, Z., LEE, J., K., SEIRA, O., LLORENS, F., BRIBIAN, A., MORALES. M., CLAVEROL-TINTURE, E., SORIANO, E., SUMOY, L., ZHENG., B., DEL RI´O, J.A. Developmental Expression of the Oligodendrocyte Myelin Glycoprotein in the Mouse Telencephalon. Cerebral Córtex. 210(20):1769-1779. 2009.

GONZALEZ-HERNANDEZ, T.; DE LA CRUZ, A.P.; MANTOLAN-SARMIENTO, B. Histochemical and immnohistochemical detection of neurons that produce nitric oxide : Effect of different fixative parameters and immunoreactivit against non- neuronal NOS antisera. The Journal of Histochemistry and Citochemistry, 112:877- 913. 1996.

HAMID, Q. Induction of nitric oxide synthase is asthma. Lance. 342: 1510-3, 1993.

HERMAN J. P.; CULLINAN, W. E. Neurocircuitry of stress: central control of the hypothalamus-pituitary-adrenal axis. Trends Neurosci, 234: 238-247. 1997.

HERMAN, J. P., OSTRANDER, M. M., MUELLER, N. K., FIGUEIREDO, H. Limbic system mechanisms of stress regulation: Hypothalamo–pituitary–adrenocortical axis. Neuropsychopharmacol Biol. Psychiatry. 29(8):1201–1213. 2005.

HILBIG, H., FRANKE, H., BIDMON, H., ILLES, P. Nitric oxide synthase isoenzymes during in vitro development of rat neuronal and human non-neuronal cells. Neurosci. Letters. 297: 9–12. 2001.

HUANG, P.L., DAWSON, T.M., BREDT, D.S., SNYDER, S.H., FISHMAN, M.C. Targeted disruption of the neuronal nitric oxide synthase gene. Cell. 75: 1273– 1286. 1993.

JOCA, S. R. L.¸ FERREIRA, F. R., GUIMARAES, F. S.. Modulation of stress consequences by hippocampal monoaminergic, glutamatergic and nitrergic neurotransmitter systems. Stress. Physiol. Behavior .10(3): 227–249. 2007.

JOELS M. Corticosteroid actions in the hippocampus. J. Neuroendocrinol. 13(8):657–669. 2001.

JURUENA, M.F., CLEARE, J.A., PARIANTE, M.C. The Hypothalamic Pituitary Adrenal axis, Glucocorticoid receptor function and relevance to depression. Revista Brasileira de Pisquiatria. 263: 189-201, 2004.

KATZOFF, AYELET; BEN-GEDALYA, T.; HURWITZ, I.; MILLER, N.; SUSSWEIN, Y. Z.; SUSSWEIN, ABRAHAM J. Nitric Oxide Signals That Aplysia Have Attempted to Eat, a Necessary Component of Memory Formation After Learning That Food Is Inedible. J. Neurophysiol, 67: 257-269. 2006.

KNOWLES, R.G. Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 5159-62, 1989.

LORENTE DE NÓ, R. Studies on the structure of the cerebralcortex II. Continuation of the study of the Ammonic system. J. Psychol Neural. 46:113-117, 1934.

LOWRY, O.H.; ROSENBROUGH, N.J.; FARR, A.L.; RANDALL, R.J. Protein measurement with the Folin Phenol Reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275.1951.

MAGARIÑOS A. M.; VERDUGO J.M.; MCEWEN B.S. Chronic stress alters synaptic terminal structure in hippocampus. Proc. Natl. Acad. Sci., 69: 346-357. 1997.

MARLETTA, M.A. Nitric oxide synthase structure and mechanism. J.Biol.Chem. 268(17): 1231-1234, 1993.

MAY-BRITT, M, MOSER, E.I. Functional Differentiation in the Hippocampus. Hippocampus. 8:608–619. 1998.

MONCADA, S. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology. Pharmacol. Reviews, 43(2): 109-122, 1991.

NATHAN, C.; XIE, Q. W. Regulation of biosynthesis of nitric oxide. J. Biol. Chem. 76: 231-239. 1994.

PAJOVIC, S. B., STOJILJKOVIC, V., GAVRILOVIC, L. J., DRONJAK, S., KANAZIR, D.T.. Ateration in Hippocampal Antioxidant Enzime Activities and Sympatho-Adrenomedullary System of Rats in Response to Different Stress Models. Physiol. Res. 55: 453-460. 2006.

PAXINOS, G. The rat nervous system. Academic Press. 3ª Ed. Oval Road. London. 2004.

PRAST, H.; PHILIPPU, A. Nitric oxide as modulator of neuronal function. Progress Neurobiology, 89: 346-352. 2001.

RADOMSKI, M.W. An L-arginine: nitric oxide pathway present in human platelets regulates aggregation. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 87: 5193-5200, 1990.

SCHUMAN, E. M.; MADISON, D. V. A requirement for the intercellular messenger nitric oxide in long-term potentiation. Science, 286:675-689. 1991.

SELYE H. A syndrome produced by diverse nocuous agents. Nature. 25: 143:151 1936.

SOBREVIELA, T., MUFSON, E.J. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-diaphorase/nitric oxide synthase profiles in the human hippocampal formation and perirhinal cortex. J. Comp. Neurol. 358:440–464.1995.

STARKMAN M. N.; GEBARSKI S.S.; BERENT S.; SCHTEINGART D. E. Hipocampal formation volume, memory dysfunction, and cortisol levels in patients with Cushing’s syndrome. Biol. Psychiatry. 125. 372-381. 1992.

VAID, R.R., YEE, B.K., RAWLINS, J.N.P. AND TOTTERDELL, S. NADPH- diaphorase reactive pyramidal neurons in Ammon’s horn and the subiculum in the rat hippocampal formation. Brain Res. 733:31–40. 1996.

VALTSCHANOFF, J.G., WEINBERG, R.J., KHARAZIA, V.N., NAKANE, M. AND SCHMIDT, H.H. Neurons in rat hippocampus that synthesize nitric oxide, J. Comp. Neurol. 331:111–121. 1993.

VANPRAAG, H.; SCHINDER A. F.; CHISTIE B.; TONI N.; PALMER T. D.; GAGE F. H. Functional neurogenesis in the adult hippocampus. Nature. 378: 876-883. 2002.

VODOVOTZ, Y. Inducible nitric oxide synthase in tanglebearing neurons of patients with Alzheimer’s disease. J. Exp. Med., 33: 1425-33. 1996.

WEAVER, J., PORASUPHATANA, S., TSAI, P., POU, S., ROMAN, L.J., ROSEN, G.M. A comparative study of neuronal and inducible nitric oxide synthases: Generation of nitric oxide, superoxide, and hydrogen peroxide. Biochimica et Biophysica Acta. 1726:302 – 308. 2005.

YAN, X.-X., RIBACK, C.E. Prenatal development of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-diaphorase activity in the human hippocampal formation. Hippocampus, 7:215– 231. 1997.

ZHOU, Q.G., HU, Y., HUA, Y., HU, M., LUO, C.X., HAN, X., ZHU, X.J., WANG, B., XU, J.S., ZHU, D.Y. Neuronal nitric oxide synthase contributes to chronic stressinduced depression by suppressing hippocampal neurogenesis. J. Neurochem. 103:1843-1854. 2007.

APÊNDICE A

PLANILHA PARA PLOTAGEM DAS MÉDIAS DE NEURÔNIOS ENCONTRADOS NAS ÁREAS HIPOCAMPAIS ESTUDADAS.

*rato crônico#

Neurônios Tipo I

Estresse

Crônico Hipocampo Septal Hipocampo Ventral

Animal Grupo CA1 CA2 CA3 GD CA1 CA2 CA3 GD

*RC1 TESTE *RC2 CONTROLE *RC3 TESTE *RC4 CONTROLE *RC5 TESTE *RC6 CONTROLE *RC7 TESTE *RC8 CONTROLE Neurônios Tipo II Estresse

Crônico Hipocampo Septal Hipocampo Ventral

Animal Grupo CA1 CA2 CA3 GD CA1 CA2 CA3 GD

*RC1 TESTE *RC2 CONTROLE *RC3 TESTE *RC4 CONTROLE *RC5 TESTE *RC6 CONTROLE *RC7 TESTE *RC8 CONTROLE

ANEXO A