Modulação do estresse agudo e crônico sobre os níveis de expressão da NOS no hipocampo de ratos Wistar

Texto

(1)1. UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA MESTRADO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS. MÁRCIA LEITE DOS SANTOS. MODULAÇÃO DO ESTRESSE AGUDO E CRÔNICO SOBRE OS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DA NOS NO HIPOCAMPO DE RATOS WISTAR.. SÃO CRISTÓVÃO 2014.

(2) 2. MÁRCIA LEITE DOS SANTOS. MODULAÇÃO DO ESTRESSE AGUDO E CRÔNICO SOBRE OS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DA NOS NO HIPOCAMPO DE RATOS WISTAR.. Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal de Sergipe como requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.. Orientador : Prof. Dr. Murilo Marchioro Co-orientador: Profª Drª Sandra Lauton dos Santos. SÃO CRISTÓVÃO 2014.

(3) iv. FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE. S237m. Santos, Márcia Leite dos Modulação do estresse agudo e crônico sobre os níveis de expressão da nos no hipocampo de ratos Wistar / Márcia Leite dos Santos ; orientador Murilo Marchioro – São Cristóvão, 2014. 42 f. : il. Dissertação (mestrado em Ciências Universidade Federal de Sergipe, 2014.. O. Fisiológicas). –. 1. Hipocampo. 2. Estresse por contenção. 3. Óxido nítrico. I. Marchioro, Murilo, orient. II. Título. CDU: 612.821.2.

(4) v. MÁRCIA LEITE DOS SANTOS. MODULAÇÃO DO ESTRESSE AGUDO E CRÔNICO SOBRE OS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DA NOS NO HIPOCAMPO DE RATOS WISTAR.. Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal de Sergipe como requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.. Orientador: Prof. Dr. Murilo Marchioro Co-Orientador: Profª Drª Sandra Lautondos Santos. ______________________________________________________ 1º Examinador: Prof. Dr. Murilo Marchioro. ______________________________________________________ 2º Examinador: Prof. Dr. José Ronaldo dos Santos. ______________________________________________________ 3º Examinador: Prof. Dr. Waldecy de Lucca Junior.

(5) vi. Dedico aos meus pais..

(6) vii. AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a força suprema que rege todo o Universo. Se eu não acreditasse no poder dessa força, não teria de modo algum, chegado até aqui. Agradeço a minha avó Dona Nina (in memoriam), por como matriarca da família ter sido sempre um exemplo de superação, de garra e persistência. Aos meus pais José Bispo e Magna por nunca deixarem de ser meu porto seguro. Por sempre acreditarem em mim, mesmo sem me entender. Pelo esforço e por uma vida totalmente dedicada ao bem estar e ao crescimento de seus filhos. Aos meus irmãos Márcio e Marcelo por ser sempre meu encontro com a alegria, por me ensinarem a ver a vida cada um a seu modo. Aos meus sobrinhos Raphael, Lorena, Caio e Heitor por ser minha fonte da juventude. Minhas horas com vocês são o “elixir” da vida eterna e trazem a paz para a minha alma. Agradeço também, ao professor Dr. Murilo Marchioro pela paciência, pelos ensinamentos e pela oportunidade. Nunca esquecerei que foi com o senhor que dei meus primeiros passos nas ciências. Obrigada por tudo. Agradeço ao Dr. José Ronaldo dos Santos por me ajudar em muitas das fases mais difíceis do mundo acadêmico. Obrigada por me apresentar o mundo das neurociências. Agradeço a Professora Dr.ª Sandra Lauton, por acreditar no meu projeto e pelo suporte experimental sem o qual eu não conseguiria terminar o presente trabalho. Obrigada por acreditar na realização de um bom trabalho. Ao amigo, companheiro de trabalho e de reflexão sobre a vida, Thassio Ricardo Ribeiro Mesquita, sem o qual eu não teria concluído varias etapas do presente trabalho. Muito obrigada por ser o homem maduro e determinado, pela competência de trabalho, e pela forma como reage diante aos desafios, com superação, altivez e excelência no que faz. Agradeço a amiga, Msc. Lívia Lins que compartilhou comigo grandes e difíceis momentos durante esses dois anos. Crescemos muito durante o mestrado e sei que você vai, sem duvida alguma, chegar onde quer na vida. Você é um exemplo de conduta e de persistência. Será para sempre lembrada como uma grande aliada. Obrigada por toda ajuda e disponibilidade em todas as fases desse trabalho e a cima de tudo pela amizade. Ao aluno do curso de Biologia, Ariel da Graça, como o nome já diz, um anjo enviado pelos céus para me ajudar. Obrigada por ser meu braço direito nessa jornada. Por nunca me faltar e por como aluno de iniciação cientifica, cumprir com todas as obrigações e as.

(7) viii. não obrigações de trabalho. Por ser um exemplo de parceria e de caráter. E pelo amigo que se mostrou. A todos os amigos da primeira turma do PROCFIS, em especial a Rangel Bonfim, Valeria Alves Fernandes, Elis Cristina, Larissa Rezende e Ana Roseli. Pela amizade, pelas conversas e debates em meio aos corredores do Departamento de Fisiologia da UFS, sobre as incertezas e certezas da vida. Tenho certeza que serão grandes pesquisadores. Agradeço a CAPES/FAPITEC pelo apoio financeiro. E por fim, mas não menos importantes agradeço a todos os professores do PROCFIS, grandes mestres, grandes naquilo que fazem.. Meu muito... OBRIGADA..

(8) ix. “O período de maior ganho em conhecimento e experiência é o período mais difícil da vida de alguém.” (Dalai Lama).

(9) x. RESUMO Modulação do estresse agudo e crônico sobre os níveis de expressão da NOS no hipocampo de ratos Wistar. Márcia Leite dos Santos, São Cristovão-2014. A reação cerebral ao estresse desenvolve-se ativando o eixo hipotalâmico-pituitárioadrenal. O hipocampo está associado ao aprendizado espacial, memória contextual e atua regulando a atividade desse eixo. De modo que o óxido nítrico, considerado um neurotransmissor atípico, participa do processo de consolidação da memória e aprendizagem, porém tem intima relação com o processo de neurotoxicidade responsável pelo desencadeamento de cascatas de morte neuronal. O presente trabalho buscou investigar os efeitos do estresse a curto e longo prazo sobre os níveis de NO no hipocampo, utilizando o modelo experimental de contenção em ratos Wistar. Foi verificado que determinadas áreas hipocampais foram mais suscetíveis a lesões pela produção de NO, sendo elas a CA2 e o Giro Denteado. A região dorsal dessas áreas é mais expressiva junto a marcações diaforásicas e possivelmente também sofrem mais com os efeitos do estresse em longo prazo. Percebe-se que o estresse agudo não é capaz de produzir efeitos significativos sobre a produção do NO, no tocante a promover danos a homeostasia hipocampal. Provavelmente o NO produzido no estresse crônico seja mantido pela via da isoforma i-NOS. Sendo que o estresse em longo prazo é determinante para as taxas de produção de NO, deletérias ao sistema hipocampal.. PALAVRAS CHAVES: hipocampo, estresse por contenção, óxido nítrico..

(10) xi. ABSTRACT Modulation of acute and chronic stress on NOS expression levels in the rat hippocampus. Márcia Leite dos Santos, São Cristovão-2014. Cerebral response to stress involves the activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis. The hippocampus is associated with spatial learning, contextual memory and regulates this axis activation. Nitric oxide (NO) is considered an atypical neurotransmitter and participates in the process of memory consolidation and learning, although it is also associated with the neurotoxicity responsible for the activation of the neuronal death cascades. The aim of the present study was to evaluate the short- and long-term effects of stress on NO levels in the rat hippocampus, inducing stress by restraint. We verified that the hippocampal areas CA2 and dentate gyrus seem to be more susceptible to lesions by NO production. The dorsal region of these areas is the most expressive of NO, and possibly the one more damaged by long-term stress. We could observe that acute stress does not significantly alter the production of NO. It is likely that NO produced in the chronic stress protocol is maintained by the induced NOsynthase. Long-term stress is a determinant factor in NO production, which can be harmful to the hippocampus.. KEYWORDS: hippocampus, restraint stress, nitric oxide..

(11) xii. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Diagrama esquemático do eixo Hipotálamico-Pituitário-Adrenal (HPA), descrevendo a regulação e o feedback negativo(-) do cortisol por via dos receptores de glicocorticoides (RGs).......................................................................................................3. Figura 2. Fotomicrografia da formação hipocampal corada com Nissl. Secção coronal que mostra o giro denteado (DG), áreas CA1, CA2, CA3 do Hipocampo. Hemisfério esquerdo de rato.................................................................................................................5. Figura 3. Aparelho de contenção para rato. Adaptado de Gamaro et.al. (1998) e Gameiro et.al. (2006). a. Aparelho de contenção aberto. Vista do alto. b. Aparelho de contenção com orifício de abertura do tubo ocluído pelo mecanismo de fechamento. Vista frontal....................................... .............................................................................11. Figura 4. Cortes corados com a técnica NADPH diaforase e montados em lâmina permanente.......................................................................................................................13. Figura 5. a. Isolamento de hipocampo por dissecação de hemisférios cerebrais; b. Hipocampo direito e esquerdo isolados...........................................................................14. Figura 6. Neurônios do tipo I no hipocampo de animal do grupo teste estresse crônico.............................................................................................................................18. Figura 7. Neurônio Tipo I em destaque no Hipocampo de animal do grupo teste estresse crônico................................................................................................................18. Figura 8. Hipocampo de animal grupo controle estresse crônico. Em destaque, pode-se observar o neurônio do tipo II marcado com NADPH-diaforase....................................19. Figura 9. Relação dos neurônios Tipo I no hipocampo de ratos Wistar, submetidos ao protocolo de estresse agudo e crônico por contenção......................................................20.

(12) xiii. Figura 10. Relação dos neurônios Tipo II no hipocampo de ratos Wistar submetidos ao protocolo de estresse agudo e crônico por contenção......................................................21. Figura 11: Relação dos neurônios Tipo II no hipocampo de ratos Wistar nas diferentes áreas hipocampais. a. CA1. b. CA2. c. CA3. d. GD (giro denteado), submetidos ao protocolo de estresse agudo e crônico por contenção......................................................23. Figura 12. Relação dos neurônios Tipo I e II no hipocampo de ratos Wistar submetidos ao protocolo de estresse agudo e crônico por contenção. Análise de cortes da região septal do hipocampo. a. Relação para neurônios tipo I. b. Relação para neurônios tipo II.......................................................................................................................................25. Figura 13: Relação dos neurônios Tipo I e II no hipocampo de ratos Wistar submetidos ao protocolo de estresse agudo e crônico por contenção. Análise de cortes da região dorsal do hipocampo. a. Relação para neurônios tipo I. b. Relação para neurônios tipo II.......................................................................................................................................26. Figura 14: Determinação da expressão proteica da enzima Óxido Nítrico Sintase Neuronal. (nNOS). em. hipocampo. de. ratos. submetidos. à. estresse. de. contenção.........................................................................................................................28. Figura 15: Determinação da expressão proteica da enzima Óxido Nítrico Sintase Neuronal Fosforilada (p-nNOSser852) em hipocampo de ratos submetidos à estresse de contenção.........................................................................................................................30. Figura 16: Determinação da expressão proteica da enzima Óxido Nítrico Sintase Induzida (i-NOS) em hipocampo de ratos submetidos à estresse de contenção.............32.

(13) xiv. LISTA DEABREVIATURAS ACTH – Adrenocorticotropina ANOVA- Análise de Variância CA - Corno de Ammon CEPA- Comitê de Ética, Pesquisa e Experimentação Animal COBEA – Colégio Brasileiro de Experimentação Animal DMF –N, N-dimetilformamida EDTA – Ácido Étilenodiamino Tetra-Acético EPM – Erro Padrão da Média HPA – Hipotalâmico Pituitário Adrenal NADPH-d – Nicotinamida Adenina Dinucleotideo Fosfato – diaforase NBT – Nitroblue Tetrazolium NO – Óxido Nítrico NOS- Óxido Nítrico Sintase PB – Tampão Fosfato PBS - Tampão Fosfato Salino pH – Potencial Hidrogeniônico PMSF – Fluoreto de Fenilmetanossulfonil RGs – Receptores Glicocorticoides RMs – Receptores Mineralocorticoides SDS – Disulfeto de Sódio SNC – Sistema Nervoso Central TBS – Tris Base Salina.

(14) xv. SUMÁRIO. 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 1 2 REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................. 2 2.1 ANATOMIA E FISIOLOGIA DO ESTRESSE ...................................................... 2 2.2 FORMAÇÃO HIPOCAMPAL E ESTRESSE ........................................................ 4 2.3 ESTRESSE E ÓXIDO NÍTRICO ........................................................................... 6 2.4 NEURÔNIOS DIAFORASE POSITIVOS (NITRÉRGICOS) ................................ 7 3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 9 3.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................. 9 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................. 9 4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................10 4.1 ANIMAIS .............................................................................................................10 4.2 ESTRESSE POR IMOBILIZAÇÃO......................................................................10 4.3 PERFUSÕES DOS ANIMAIS E PREPARO DAS AMOSTRAS PARA TÉCNICA HISTOQUÍMICA NADPH DIAFORASE ..................................................................12 4.4 HISTOQUÍMICA PARA NADPH DIAFORASE .................................................12 4.4.1 PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS ......................................................................12 4.4.2 ANÁLISE DE DADOS PARA CONTAGEM NEURONAL EM CORTES CORADOS COM A TÉCNICA NADPH DIAFORASE .............................................13 4.5 PREPARAÇÃO DO TECIDO PARA QUANTIFICAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO E EXPRESSÃO PROTEICA ......................................................................................14.

(15) xvi. 4.6 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE HIPOCAMPO PARA WESTERN BLOT...............................................................................................................................14 4.6.1 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO TOTAL DE PROTEÍNAS ........... 15 4.6.2 DETERMINAÇÃO DA EXPRESSÃO PROTEICA POR WESTERN BLOT .... 15 4.7 ANÁLISES ESTATÍSTICA .................................................................................. 16 4.7.1 ANÁLISE ESTATÍSTICA PARA HISTOQUÍMICA NADPH DIAFORASE ................................................................................................................................... 16 4.7.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA PARA WESTERN BLOT........................................ 17 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 17 5.1 MORFOLOGIA DOS NEURÔNIOS NADPH DIAFORASE ............................... 17 5.2 DISTRIBUIÇÕES DOS NEURÔNIOS NADPH DIAFORASE ............................ 19 5.2.1 NÚMERO TOTAL DE NEURÔNIOS TIPO I E TIPO II ................................... 19 5.2.2 DISTRIBUIÇÃO DE NEURÔNIOS TIPO II NAS ÁREAS HIPOCAMPAIS ................................................................................................................................... 22 5.2.3 RELAÇÃO ENTRE O NÚMERO DE NEURÔNIOS TIPO I E TIPO II ENTRE A REGIÃO ANATÔMICA SEPTAL E TEMPORAL DO HIPOCAMPO ...................... 24 5.3 QUANTIFICAÇÕES DA NOS POR WESTERN BLOT NO HIPOCAMPO ........ 27 5.3.1 EXPRESSÃO DA ISOFORMA nNOS ............................................................... 27 5.3.2 EXPRESSÃO DA ISOFORMA p-nNOSser852 ..................................................... 29 5.3.3 EXPRESSÃO DA ISOFORMA i-NOS .............................................................. 31 6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 33 REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 34 APÊNDICE A - PLANILHA PARA PLOTAGEM DAS MÉDIAS DE NEURÔNIOS ENCONTRADOS NAS ÁREAS HIPOCAMPAIS ESTUDADAS...............................40 ANEXO A – DECLARAÇÃO DO CEPA/UFS.............................................................41.

(16) 1. 1 INTRODUÇÃO. O cérebro é alvo de diferentes estressores devido a sua sensibilidade e condições degenerativas induzidas pelo estresse (PAJOVIC et al., 2006). A resposta fisiológica a um estressor, seja ele físico ou psicológico, é um mecanismo protetor e adaptativo para manter o equilíbrio homeostático do organismo. O estresse desencadeia uma série de processos neurológicos e hormonais dentro do cérebro e dos sistemas orgânicos (BEKRIS et al., 2005). Uma das reações cerebrais ao estresse se dá pela ativação do eixo hipotalâmicopituitário-adrenal (HPA). O hipotálamo secreta o fator liberador de corticotropina, o qual estimula a síntese e liberação de adrenocorticotropina (ACTH) pela hipófise anterior, que por sua vez, estimula a síntese e liberação de cortisol em humanos e corticosterona em roedores. Estes glicocorticoides afetam o comportamento agindo nos receptores glicocorticóides e minerolocorticóides de diferentes regiões cerebrais, entre elas o hipocampo (JOCA; FERREIRA; GUIMARÃES 2007). O hipocampo tem sido associado ao aprendizado espacial e memória contextual. Também atua sobre o estresse a nível cerebral, regulando a atividade do eixo hipotálamo-pituitário-adrenal (HERNAN et al., 2005). Existem indícios que o hipocampo exerce um efeito protetor no cérebro quando o indivíduo está sobre estresse repetitivo (JOELS, 2001). No entanto, a exposição à estressores induz remodelamento dendrítico em células piramidais hipocampais e diminuição da neurogênese no giro denteado do hipocampo. Tais alterações morfológicas parecem ser mediadas pelo aumento de corticosteroides que acompanha os eventos de estresse, já que a remoção das adrenais previne a inibição da neurogênese induzida pelo estresse (BAIN; DWYER; RUSAK, 2004). Em relação aos neurotransmissores, sabe-se que algumas substâncias, tais como o óxido nítrico (NO), podem apresentar neurotoxicidade em situação de estresse. O NO atua na regulação de importantes vias do Sistema Nervoso Central (SNC). Segundo Schuman e Madison (1991), o NO participa do aprendizado e da formação de memória, além de mediar respostas excitatórias a certos aminoácidos..

(17) 2. Sendo assim, mostra-se de grande interesse a investigação dos efeitos do estresse a curto e longo prazo sobre os níveis de NO no hipocampo utilizando o modelo de contenção em ratos Wistar.. 2 REVISÃO DE LITERATURA. 2.1 ANATOMIA E FISIOLOGIA DO ESTRESSE O estresse pode ser definido como “desgaste por uso prolongado”, que pode ser provocado por diversos fatores estressores, tais como o frio ou calor intenso, a fome, o sono e a contensão (CARRASCO; VAN DE KAR, 2003). A resposta fisiológica a um estressor, seja ele físico ou psicológico, é um mecanismo protetor e adaptativo para manter o equilíbrio homeostático do organismo. O estresse desencadeia uma série de processos neurológicos e hormonais no cérebro e nos sistemas orgânicos. A duração e a intensidade do estresse podem provocar efeitos de curto e longo prazo. Um estressor pode romper a homeostasia até o ponto em que a adaptação a ele fracassa, resultando em um processo patológico (BEKRIS et al., 2005). Em 1936, Hans Selye descreveu uma teoria de adaptação na qual “o organismo responde inespecificamente a qualquer demanda a ele imposta”, essa teoria ficou conhecida como “síndrome à adaptação geral”. Selye delimitou três fases: a primeira é a de alarme, resposta aguda a agressão, durante essa fase há a ativação de resposta de “fuga ou luta”, na qual ocorre liberação de catecolaminas e o início da resposta do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH). A segunda fase é a de resistência na qual o organismo se adapta ao estressor nocivo e a atividade do cortisol ainda está aumentada. Persistindo a exposição ao agressor, ocorre o terceiro estágio que é a exaustão. Durante esse estágio a atividade do glicocorticóide aumenta e provoca alterações nos sistemas orgânicos, levando-o à morte (JOCA; FERREIRA; GUIMARÃES, 2007). As respostas fisiológicas ao estresse são mediadas pelo cérebro através de uma complexa rede de mensagens eletroquímicas. Seley, em seus estudos, delineou o papel da glândula hipófise na estimulação do córtex adrenal, via hormônio ACTH, abrindo desta forma, o caminho para o conceito de eixo hipotalâmico-pituitária-adrenal (HPA) como eixo hormonal do estresse. A amígdala e o hipocampo, envolvidas pela elaboração das emoções, são estruturas límbicas consideradas moduladoras do eixo.

(18) 3. HPA, dessa forma esse eixo pode ser considerado límbico-hipotalamo-pituitaria-adrenal (BAIN; DWYER; RUSAK, 2004; JOCA; FERREIRA; GUIMARÃES, 2007). O cérebro reage ao estresse ativando o eixo HPA. Os neurônios dos núcleos paraventriculares do hipotálamo secreta fator liberador de corticotropina, o qual estimula a síntese e liberação de adrenocorticotropina (ACTH) pela hipófise anterior, esta por sua vez, estimula a síntese e liberação de cortisol em humanos e corticosterona em roedores. Estes glicocorticoides exercem efeito no metabolismo e afetam o comportamento agindo nos receptores glicocorticóides e mineralocorticóides de diferentes regiões cerebrais (JOCA; FERREIRA; GUIMARÃES, 2007). A cortisona (em roedores) pode também exercer um feedback negativo no eixo HPA, atuando sobre receptores de glicocorticóide situados no hipocampo, onde sua concentração é muito alta, bem como no hipotálamo e na hipófise, inibindo assim, a secreção de ACTH (JOCA; FERREIRA; GUIMARÃES, 2007). Embora os glicocorticoides regulem a função de quase todos os tecidos do corpo, o efeito fisiológico mais conhecido desses hormônios é a regulação do metabolismo energético, como mostrado na figura 1 (JURUENA; CLEARE; PARIANTE, 2004).. Figura 1. Diagrama esquemático do eixo Hipotálamico-Pituitário-Adrenal (HPA), descrevendo a regulação e o feedback negativo (-) do cortisol por via dos receptores de glicocorticoides (RGs). (adaptado de JURUENA; CLEARE; PARIANTE, 2004)..

(19) 4. 2.2 FORMAÇÃO HIPOCAMPAL E ESTRESSE. O hipocampo é uma estrutura cerebral que tem sido associado ao aprendizado espacial, memória contextual e resposta cerebral ao estresse, devido à regulação da atividade do eixo hipotálamo-pituitário-adrenal (HERNAN et al., 2005). Existem indícios que o hipocampo exerce um efeito protetor no cérebro quando o indivíduo está sobre efeito do estimulo estressor (JOELS, 2001). Ele é ativado por diferentes estressores e participa do processamento de informações sobre eventos ameaçadores. Há uma grande densidade de receptores para glicocorticóides no hipocampo que, quando ativados inibem a atividade do eixo HPA, limitando a resposta ao estimulo estressor. Além disso, essa estrutura cerebral quando exposta de forma repetitiva a níveis elevados de glicocorticóides pode ter efeito deletério à sua estrutura e função (JOCA; FERREIRA; GUIMARÃES, 2007). Exposição a estressores sejam eles físicos ou psicológicos, como novidade ou problemas sociais, induz remodelamento dendrítico em células piramidais hipocampais e diminuição da neurogênese no giro denteado do hipocampo. Tais alterações morfológicas parecem ser mediadas pelo aumento de corticosteróides que acompanha os eventos de estresse, já que a remoção das adrenais previne a inibição da neurogênese induzida pelo estresse (AXELSON et al., 1992). Joca et al. (2007) afirmam que eventos estressantes teriam um efeito neurotóxico sobre o hipocampo, provavelmente mediados pelo aumento de GCs, predispondo ao desenvolvimento da depressão. Desde meados do século XX, os cientistas que estudam a memória e o cérebro têm se concentrado no hipocampo como a estrutura fundamental para a memória recente para fatos e eventos (GIL et al., 2009). Nas últimas duas décadas, tornou-se evidente que as áreas que formam a região hipocampal também desempenham um papel crítico na memória. Sendo caracteristico a cada área uma determinada função na circuitaria do sistema (BURWELL; AGSTER, 2008). A figura 2, mostra a visão geral da anatomia funcional das estruturas que suportam a memória episódica do cérebro de mamíferos..

(20) 5. Figura 2. Fotomicrografia da formação hipocampal corada com a técnica de Nissl. Secção coronal que mostra o giro denteado (DG), áreas Corno de Ammon 1 (CA1), Corno de Ammon 2 (CA2), Corno de Ammon 3 (CA3) do Hipocampo e suas sete camadas: camada granular (gcl), camada molecular (ml), estrato lacunoso molecular (slm), estrato oriens (so) estrato piramidal (sp), estrato radiato (sr), camada de células de Purkinje (pcl) (PAXINOS, 2004). Hemisfério esquerdo de rato. (BURWELL; AGSTER, 2008).. O hipocampo estende-se ao longo do assoalho do corno temporal dos ventrículos laterais, dividindo-se em áreas chamadas CA1, CA2 e CA3. As iniciais “C” e “A” maiúsculas referem-se á abreviatura de Corno de Ammon (LORENTE DE NÓ, 1934). Além disso, pode-se dividir o hipocampo em sete camadas: camada granular (gcl), camada molecular (ml), estrato lacunoso molecular (slm), estrato oriens (so) estrato piramidal não estratificado (sp), estrato radiato (sr), camada de células de Purkinje (pcl) (PAXINOS, 2004). Como mostra a figura a figura 2. O hipocampo juntamente com o giro denteado e os córtices transicionais associativos (córtex entorrinal e subicular), constitui a formação hipocampal. Assim chamada, pois essa unidade morfofuncional tem todas as suas estruturas acima citadas como parte do sistema límbico e estão conectadas por um sistema de conexões predominantemente excitatórias chamadas conjuntamente de “via trissináptica” (LORENTE DE NÓ, 1934)..

(21) 6. 2.3 ÓXIDO NÍTRICO E ESTRESSE. O óxido nítrico (NO) é um gás tóxico, instável, e constitui uma das menores e mais simples moléculas biossintetizadas. É um radical livre, gasoso, inorgânico e incolor (WEAVER et al., 2005). Vem sendo considerado em estudos recentes como um neurotransmissor atípico. Alguns estudos apontam o envolvimento desse gás em várias patologias como, depressão e transtornos obsessivos (HAMID et al.,1993; BAGASRA et al., 1995; BUTTERY et al., 1996; VODOVOTZ et al., 1996). No cérebro o NO participa do aprendizado e da memória, além de poder mediar respostas excitatórias a certos aminoácidos (SCHUMAN; MADISON, 1991). Estudos prévios apontam que o NO tem efeito modulador em diferentes processos de memória e aprendizagem. Vodovotz et al. (1996) demonstraram que o bloqueio da síntese de NO causa prejuízo a memória, tanto no processo de aquisição quanto no de recuperação. Zhou et al. (2007), relataram que a inibição da síntese de NO causa diminuição da memória e diminuição do nível de hormônio cortical liberado. O NO tem importante participação no controle do HPA (STARKMAN et al., 1992). A síntese do NO resulta da oxidação de um dos dois nitrogênios guanidino da Larginina, que é convertida em L-citrulina. Esta reação é catalisada pela enzima NO sintase (NOS) (MARLLETA,1993; MONCADA, 1991). Estudos de análise da sequencia de aminoácidos revelaram que as isoformas da NOS representam uma família e são produtos de três genes distintos. Assim, as isoformas da NOS são agrupadas em duas categorias, a NOS constitutiva (c-NOS), dependente de íons cálcio (Ca++) e de calmodulina, que está envolvida na sinalização celular, e a NOS induzível (i-NOS), produzida por macrófagos e outras células ativadas por citocinas (MARLLETA, 1994; MONCADA, 1991). A c-NOS e a i-NOS diferem quanto ao peso molecular, à forma de ativação e à capacidade de síntese de NO (MARLLETA, 1994). A isoforma constitutiva compreende a NOS neuronal (n-NOS, tipo I), presente normalmente nos neurônios (BREDT; SNYDER, 1989; KNOWLES, 1989), e a NOS endotelial (e-NOS, tipo III), presente normalmente nas células endoteliais vasculares (MONCADA, 1991) e nas plaquetas (RADOMSKI, 1990). A c-NOS produz pequenas quantidades de NO, da ordem de nano ou picomols, e sua ativação depende da interação com a calmodulina, que, por sua vez, é controlada pelos níveis de Ca++ (MARLLETA, 1994; MONCADA, 1991)..

(22) 7. A i-NOS não é expressa sob condições normais, é induzida por citocinas e endotoxinas em uma variedade de células (MONCADA, 1991). Esta isoforma requer algumas horas para ser expressa, mas, uma vez sintetizada, libera quantidades maiores de NO que a c-NOS e a produção deste continua indefinidamente até que a L-arginina ou os co-fatores necessários para sua síntese sejam totalmente consumidos ou ocorra a morte celular (DUSTING; MACDONALD, 1995). Estudos com neurônios que contêm a forma constitutiva de NOS, demonstraram que em situações de estresse é desencadeada uma ação neurotóxica. Essa neurotoxicidade é promovida pela formação de peroxinitrito e liberação de íons ferro, causando aumento de lesões no DNA e inibição da síntese desta biomolécula (WEAVER, 2005).. 2.4 NEURÔNIOS DIAFORASE POSITIVOS (NITRÉRGICOS). Como já anunciado, a produção de NO em células de mamíferos, pode ocorrer pela conversão da L-arginina em L-citrulina pela ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS). Como a NOS requer nicotinamida adenina dinucleotideo fosfato (NADPH) e O2 para a produção de NO, células nitrérgicas (que produzem NO), podem ser identificadas através da reação histoquímica da NADPH-diaforase (NADPH-d), indicadora da atividade catalítica da NOS (GONZALEZ-HERNANDEZ et al., 1996; GABBOT; BACON, 1996). Corroborando com esse fato, foi demonstraram a perda completa da coloração característica da marcação histoquímica por NADPH-d em células do sistema nervoso de ratos transgênicos “knockdown” para um gene funcional responsável pela produção de NOS neuronal, fornecendo apoio para a co-localização da NOS e junto a NADPH-d (HUANG et al., 1993). Foi também verificado por Hilbig et al. (2001), que diferentes isoformas da NOS podem expressar atividade para NADPH-d. Tem sido relatado para o córtex cerebral de macaco Cebus apella e em outros mamiferos que neurônios NADPH-d-positivos podem ser divididos em dois tipos distintos. Sendo eles classificados como neuronios do Tipo I e neurônios do Tipo II (YAN et al, 1996.; FRANCA et al, 1997; BARONE; KENNEDY, 2000). Os do Tipo I têm um soma relativamente grande, preenchido por uma marcação diaforase intensa que delimita bem o soma e seus prolongamentos. Esses neurônios.

(23) 8. possuem uma marcação parecida com as demonstradas com a técnica de Golgi que utiliza impregnação com prata para marcação morfologica de neurônios. Estes neurônios estão distribuídos ao longo do córtex, mas principalmente na substância branca subcortical e nas camadas corticais supragranulares (GABBOTT; BACON, 1996; CRUZ-RIZZOLO et al., 2006) Neurônios do tipo II são mais numerosos, menores, com fraca atividade NADPH-d, possuem tamanhos variantes entre médios e pequenos, com coloração pouco forte e possuem pouca quantidade de prolongamentos dendríticos. Estão distribuídos em maior parte nas camadas corticais do macaco Cebus apella (CRUZ-RIZZOLO et al., 2006). Estas células também foram encontrados na formação hipocampal de primatas (SOBREVIELA; MUFSON, 1995) e na amígdala (BRADY et al, 1992), indicando a ampla natureza desses neurônios no telencéfalo..

(24) 9. 3 OBJETIVOS. 3.1 OBJETIVO GERAL Avaliar os efeitos do estresse agudo e crônico pelo modelo de contenção sobre o sistema nitrérgico no hipocampo de ratos Wistar adultos.. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Quantificar o número de neurônios diaforase positivos no hipocampo de ratos controle e estressados. - Quantificar a expressão da nNOS, iNOS, p-nNOS no hipocampo de ratos controle e estressados. -Comparar os modelos de estresse agudo e crônico por contenção, sobre os níveis de modulação da NOS no hipocampo de ratos Wistar adultos..

(25) 10. 4 MATERIAL E MÉTODOS. 4.1 ANIMAIS Os experimentos foram realizados com 48 ratos Wistar, divididos em quatro grupos (Controle Agudo, Estresse agudo; Controle Crônico, Estresse Crônico), com peso de 200-350g, com idade em torno das dezesseis semanas. Os animais foram fornecidos pelo biotério central da UFS e mantidos em grupos de quatro ratos em caixas plásticas padrão no biotério setorial do Departamento de Fisiologia, até serem utilizados para os experimentos no Laboratório de Neurofisiologia. Durante sua estadia no biotério setorial, os ratos tiveram livre acesso à água e ração própria para roedores. A temperatura foi mantida a 24 0C com ciclo claro-escuro natural. Depois de utilizados, os corpos dos animais foram acondicionados em sacos plásticos vedados e depositados no freezer do biotério setorial do Departamento de Fisiologia, até serem recolhidos pelo serviço de coleta da instituição. Os animais utilizados foram tratados de acordo com as normas éticas para a pesquisa animal, desenvolvidas pelo Comitê de Ética em Pesquisa e Experimentação Animal da Universidade Federal de Sergipe (CEPA-UFS), sob o protocolo CEPA #76/2010 (ANEXO A).. 4.2 ESTRESSE POR IMOBILIZAÇÃO. Neste trabalho foi utilizado o modelo de estresse por imobilização adaptado de Gamaro et al. (1998) e Gameiro et al. (2006). De acordo com este protocolo, os ratos foram confinados em tubos de PVC, de aproximadamente 24 cm de comprimento por 6 cm de diâmetro, cujo comprimento e diâmetro é ajustado para o tamanho de cada rato por um dispositivo que oclui o orifício de abertura do tubo, de modo que os mesmos foram impedidos de se movimentar (Figura 3). Os animais passaram por um período de uma semana de ambientação de 30min manipulados diariamente pelo pesquisador. Foram utilizados regimes de confinamento: estresse crônico (6 horas por dia, durante 15 dias) e estresse agudo (1 hora, sessão única). Segundo Magarinõs et.al (1997) as taxas dos hormônios ACTH e corticosterona dos animais mantidos em contenção são significativamente mais elevadas quando comparadas com aquelas dos.

(26) 11. animais controle, mantidos em suas gaiolas padrão. Estabelecendo assim um bom protocolo para indução de estresse crônico e agudo.. a.. b.. Figura 3. Aparelho de contenção para rato. Adaptado de Gamaro et al. (1998) e Gameiro et al. (2006). a. Aparelho de contenção aberto. Vista do alto. b. Aparelho de contenção com orifício de abertura do tubo ocluído pelo mecanismo de fechamento. Vista Frontal.. Após 20 minutos do fim da exposição ao aparelho de contenção, ao fim do 15ª dia de regime de confinamento para o estresse crônico e da sessão única de 1hora para o estresse agudo, os animais seguiram então, para os procedimentos metodológicos específicos a cada técnica aplicada..

(27) 12. 4.3 PERFUSÕES DOS ANIMAIS E PREPARO DAS AMOSTRAS PARA TÉCNICA HISTOQUÍMICA NADPH DIAFORASE. Vinte minutos após passarem pelos procedimentos de estresse por imobilização, de acordo com o grupo experimental a qual se enquadravam, os animais foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal (1 mL/100g de peso corporal) de ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), e em seguida perfundidos transcardialmente com solução de tampão fosfato salino (PBS) (0,1 M, pH= 7,2-7,4) durante 5 minutos para que os seus vasos sanguíneos fossem lavados. Depois se introduziu o fluxo de paraformoldeído (0,1 M) a 4% em tampão fosfato (PB) durante 20 minutos. Os cérebros dos animais foram então extraídos das caixas cranianas e reservados em PB (0,1 M).. 4.4 HISTOQUÍMICA PARA NADPH DIAFORASE. Logo após a perfusão os cérebros foram fatiados no vibrátomo na espessura de 70µm, sempre banhados em tampão fosfato (PB) 0,1M. Seguiu-se com as lavagens das fatias com Tris-HCl a 0,1M em pH 8,0 (3 lavagens de 5 minutos), em seguida lavou-se as fatias com Triton X-100 a 0,5% (3 lavagens de 5 minutos). eApós as devidas lavagens as fatias foram incubadas em 2 mL de meio, que constitui-se de 1966µL de Triton X-100 0,5% em pH 8,7µL de nitroblue tetrazolium (NBT) à 0,25 mg/ml em DMF e 17µL de β-NADPH a 0,83 mg/ml em H2O. As fatias foram incubadas em estufa comum, durante 80 minutos, a 37°C, sendo que a cada 30 minutos eram observados se a marcação das amostras apresentava-se satisfatória. Com obtenção das amostras na coloração roxa, a reação foi interrompida com a lavagem dos cortes com tampão fosfato PB 0,1M (3 vezes por 5 minutos).. 4.4.1 PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS. Os cortes foram montados em lâminas gelatinizadas, e permaneceram durante um intervalo de trinta minutos à uma hora em câmera úmida para que se fixassem na lâmina. Passada esta etapa os cortes foram desidratados, com níveis crescentes de álcool (70%, 80%, 90% e 100%) por cinco minutos cada, descorados parcialmente com um banho de xilol (cinco minutos) e montados com meio permanente Eukitt® (SIGMA) entre lâmina e lamínula, como mostra a figura 4..

(28) 13. Figura 4: Cortes corados com a técnica NADPH diaforase e montados em lâmina permanente.. 4.4.2 CONTAGEM CÉLULAS NEURONAIS EM CORTES CORADOS COM A TÉCNICA NADPH DIAFORASE. Os dados foram analisados utilizando o microscópio óptico Olympus modelo CX21FS, com câmera digital para microscopia (CMOS chip DCM130E) acoplada à objetiva com auxílio do software de aquisição ScopePhoto® 3.1 (ScopeTek). Foi analisado também, da mesma forma digital, as características qualitativas dos neurônios do Tipo I e II no córtex do hipocampo dos animais testes e controle. Cada animal forneceu seis fatias ao longo do seu eixo septo-temporal, que foram avaliadas quanto à marcação para NADPH diaforase no hipocampo. Das seis fatias obtidas foram utilizadas três da região septal hipocampal e três da região temporal hipocampal. Em cada fatia o hipocampo foi identificado e classificado em áreas CA1, CA2, CA3 e Giro Denteado de acordo com Paxinos (2004). Para cada área hipocampal foi contabilizado o número de neuronios Tipo I e Tipo II. Esse procedimento foi efetuado com a amostra de todos os animais utilizados nesse estudo. As áreas hipocampais foram totalmente vizualizadas e tiveram os números neuronais contabilizados em toda sua extensão. Para análise inicial, as médias da soma dos números de neuronios das três fatias de cada região septo-temporal, marcadas pela técnica diaforase, foi plotada em uma planilha feita no programa Excel 2007® (APÊNDICE A), para posterior análise estátistica e comparação entre os grupos..

(29) 14. 4.5. PREPARAÇÕES. DO. TECIDO. PARA. QUANTIFICAÇÃO. DA. CONCENTRAÇÃO E EXPRESSÃO PROTEICA. Após a eutanasia dos animais por decapitação (n=32), os cérebros dos mesmos foram extraídos da caixa craniana. Sendo os dois hemisférios cerebrais dissecados para extração do hipocampo isolado (Figura 5).. a.. b.. 5 cm Figura 5: a. Isolamento de hipocampo por dissecação de hemisférios cerebrais; b. Hipocampo direito e esquerdo isolados. Escala figura b.: (5 cm).. Desse modo, o hipocampo do hemisfério cerebral direito seguiu para a preparação do homogeneizado conforme se procede para a técnica de Western Blot. E o hipocampo do hemisfério cerebral esquerdo foi reservado à -80Cº, para posterior utilização.. 4.6 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE HIPOCAMPO PARA WESTERN BLOT. Os hipocampos retirados do hemisfério cerebral direito dos grupos tratados segundo o protocolo de estresse agudo e crônico, foram rapidamente removidos e imersos em uma solução salina tamponada com Tris-Base (TBS) contendo (mM): 50 Tris-Base; 150 NaCl, pH 7,4. Posteriormente, em banho de gelo, os tecidos foram homogeneizados (Dremel 300 ®) na presença de tampão de lise contendo (mM): 150 NaCl; 50 Tris 50; 5 EDTA; 2Na; 1 MgCl2, pH 8,0 acrescido de 100 mM Dithiothreitol, 1% Nonidet P40, 0,3% de Triton X-100, 0,5% de SDS, cocktail de inibidores de.

(30) 15. proteases (SigmaFast ®, Sigma), 100 mM PMSF e de inibidores de fosfatases, 10 mM Na4P2O7, 10 mM Na3VO4 e 100 mM NaF. Os tecidos foram homogeneizados a uma proporção de 100 mg/mL de tampão de lise. Após o processamento, as amostras foram centrifugadas a 15.000 rpm (Neofuge 15R, HEAL FORCE®, China) por 15 minutos à 4ºC. O sobrenadante foi aliquotado e congelado a -80ºC para posterior utilização.. 4.6.1 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO TOTAL DE PROTEÍNAS. A concentração total de proteínas foi determinada pelo método de Lowry et al. (1951). Resumidamente, as amostras foram diluídas 10 vezes e adicionadas NaOH 0,5 M. Após 15 minutos de incubação, adicionou-se em cada amostra, uma solução composta por: 2% Na2CO3, 1% CuSO4 e 2% KNaC4H4O6•4H2O, na proporção de 100:1:1. Ao final foi adicionado o reagente de Folin diluído 2 vezes. Após incubação por 30 minutos, foi realizada a leitura no comprimento de onda de 630nm em leitora enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (ELx800, BIOTEK Instruments®, EUA). Para confecção da curva de proteína padrão, utilizou-se albumina bovina (Sigma-Aldrich®) em várias concentrações.. 4.6.2 DETERMINAÇÃO DA EXPRESSÃO PROTEICA POR WESTERN BLOT. As amostras foram diluídas em tampão da amostra (Tris HCl/SDS pH=6.8, 3% Glycerol, 1% SDS, 0.6% β-mercaptoetanol, Azul de Bromofenol) e aquecidas à 98°C por 5 minutos. Para separação, foram aplicados 60 µg de proteína em gel de SDS-PAGE (do inglês sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) a 10%. Após serem separadas em gel de poliacrilamida, as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Millipore®, EUA) com poros de 0,44 μm. A qualidade da transferência foi monitorada através da coloração da membrana com solução de Ponceau 0,3%. A membrana foi então lavada em solução salina tamponada com Tris-Base acrescido com 0.05% de Tween 20% (TBS-T) e colocada por 1 à 2 horas em solução de bloqueio (4% de albumina em TBS-T). Após o bloqueio, a membrana foi incubada em temperatura de 6-8ºC, com o anticorpo primário específico diluído em 1% de albumina em TBS-T, overnight..

(31) 16. Os seguintes anticorpos primários foram utilizados: anti-nNOS / anti-iNOS (1:1000; policlonal feito em coelho; Santa Cruz Biotechnology Inc - Santa Cruz, CA, EUA) e anti-pnNOSSer852 / anti-GAPDH (1:1000; policlonal feito em cabra; Santa Cruz Biotechnology Inc. - Santa Cruz, CA, EUA). Em seguida, a membrana foi lavada três vezes com TBS-T durante 5 minutos e incubada por 2 horas com o anticorpo secundário conjugado a peroxidase (HRP) (1:5000, anti-goat IgG-HRP ou anti-rabbit IgG-HRP, Sigma, St. Louis, MO) diluído em 1% de albumina em TBS-T. Após o período de incubação, a membrana foi novamente lavada por mais três vezes em TBS-T, durante 5 minutos. As bandas proteicas foram detectadas por uma reação de quimioluminescência (Luminata strong™ - Western HRP substrate, Merck-Millipore, Darmstad, Germany) e a intensidade das mesmas foi avaliada por análise densitométrica, através do software ImageJ 1.38x (NIH). Para os experimentos acima citados, foram utilizados o sistema Mini Protean IIITetracell e Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell (BIORAD®, CA, EUA).. 4.7 ANÁLISES ESTATÍSTICA. 4.7.1 ANÁLISE ESTATÍSTICA PARA HISTOQUÍMICA NADPH DIAFORASE. A contagem foi feita manualmente, de modo a contabilizar neurônios do Tipo I e II nas determinadas áreas do hipocampo. Com os dados coletados, observados pela quantidade de neurônios Tipo I e II, procurou-se comparar os dados entre os animais teste e seus respectivos controles, e entre o grupo teste agudo e teste crônico. Os resultados foram expressos a partir da média ± o Erro Padrão da Média (EPM) e a diferença entre os valores dos grupos experimentais e grupos controle, foi avaliada pela ANOVA one-way, seguidas do post-hoc de Tukey para comparação entre os grupos. Valores de p<0,05 e p<0,01 foram considerados como significativos. Foi utilizado o programa SPSS 18.0 para as devidas análises..

(32) 17. 4.7.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA PARA WESTERN BLOT. Os cálculos e análises dos resultados obtidos foram analisados pelo software Prism 5.1 (GraphPad, San Diego, CA, EUA). Os resultados de expressão proteica obtida, através do western blot foram normalizados pelo resultado do GAPDH de cada amostra sendo expressos em média ± EPM e adotado o teste de ANOVA one-way, seguido por post-hoc de Bonferroni para comparação entres os grupos. Para efeito estatístico foram considerados significativos os valores que apresentavam p<0,05.. 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 MORFOLOGIA DOS NEURÔNIOS NADPH DIAFORASE As NOS estão distribuídas no SNC de uma variedade de espécies, e, sua localização pode estar relacionada a varias funções (BLOTTNER; GROZDANOVIC; GOSSRAU, 1995). Como já dito no presente trabalho, os neurônios que expressam as NOS podem ser marcados com a técnica de NADPH diaforase. Constatamos a diferenciação morfologica entre os neurônios do Tipo I e do Tipo II no hipocampo de ratos estressados agudamente e cronicamente, assim como já verificado por Sobreviela e Mufson (1995). Pode-se notar que no hipocampo dos animais estudados que os neurônios Tipo I, possuem visualmente uma maior arborização dendrítica e uma impregnação diaforásica maior, tanto nos animais controle quanto nos teste dos dois protocolos de estresse, em relação aos neurônios do Tipo II dos mesmos animais, como pode ser visto na figura 6, 7 e 8..

(33) 18. (50µm) m) µµµm). Figura 6. Neurônios do tipo I no hipocampo de animal do grupo teste estresse crônico. Em destaque (seta: ), pode-se observar os neurônio do tipo I marcado com NADPHdiaforase. Objetiva: 40X.. (15µm) Figura 7. Neurônio Tipo I em destaque no hipocampo de animal do grupo teste estresse crônico. Objetiva 100x.. Os neurônios do Tipo II apresentam aparentemente uma coloração menos intensa, menor tamanho, e feixes de arborizações dendriticas menos expressivas (Figura 8). Visualmente também se apresentam em maior número no hipocampo..

(34) 19. (60µm) Figura 8. Hipocampo de animal grupo controle estresse crônico. Em destaque (seta: pode-se observar o neurônio do tipo II marcado com NADPH-diaforase. Objetiva: 40X.. ),. Após visualização e caracterização dos neurônios no hipocampo, seguiu-se a contagem dos neurônios marcados com a técnica e sua relação de expressão entre os animais que passaram pelo protocolo do estresse agudo e estresse crônico.. 5.2 DISTRIBUIÇÕES DOS NEURÔNIOS NADPH DIAFORASE. 5.2.1 NÚMERO TOTAL DE NEURÔNIOS TIPO I E TIPO II . Neurônios do Tipo I observados no hipocampo. Como pode ser visto na figura 9, não houve diferença significativa no número total de neurônios Tipo I no hipocampo dos animais submetidos a estresse agudo e crônico e seus respectivos controles. Isso pode indicar que os neurônios NOS positivos, talvez necessitem de um tempo maior de submissão ao estresse para que possam desencadear essa expressão..

(35) 20. Relação de neurônios Tipo I marcados pela técnica de NADPH-DIAFORASE.. Figura 9. Gráfico da relação dos neurônios Tipo I no hipocampo de ratos Wistar, submetidos ao protocolo de estresse agudo e crônico por contenção, marcados pela técnica de NADPH-d. n=4.. . Neurônios do Tipo II observados no hipocampo. A análise da contagem de neurônios do Tipo II possibilitou verificar uma diferença significativa (p<0,05) existente na quantidade desses neurônios no hipocampo entre animais estressados cronicamente, seu respectivo controle e entre o grupo submetido ao protocolo de estresse agudo. Essa diferença pode ser observada na figura 10. As células em questão possuem um menor grau de expressão diaforásica (Figura 8) e, portanto o protocolo de estresse crônico aos quais os animais foram submetidos já possibilitaria uma maior marcação desse tipo neuronal. Esse fato nos remete a vertente que o estresse crônico atuaria aumentando a expressão da NOS e possivelmente a expressão elevada de NO em consequência do prolongamento do estado de estresse do modelo estudado. O que pode estar diretamente envolvido com a condição fisiológica de desordem a qual superprodução de NO está intimamente ligada..

(36) 21. Relação de neurônios Tipo II marcados pela técnica de NADPH-DIAFORASE.. Figura 10. Gráfico da relação dos neurônios Tipo II no hipocampo de ratos Wistar submetidos ao protocolo de estresse agudo e crônico por contenção, marcados pela técnica de NADPH-d. *p<0,05 quando comparado com todos os grupos. n=4.. Como observado não houve diferenças significativas em relação aos neurônios diaforásicos do Tipo I no hipocampo, fato este que nos permite uma maior atenção sobre a avaliação dos neurônios do Tipo II nas determinadas áreas hipocampais estudadas. Tem sido relatado que o padrão de expressão de NOS no hipocampo, usando a histoquímica NADPH diaforase para células piramidais e células da camada granular, apresentam índices elevados em estágios iniciais de desenvolvimento e que esta coloração diminui em neurônios maduros que passam a exibir uma coloração mais fraca para NOS (BREDT; SNYDER, 1994; YAN; RIBACK, 1997). Esse fato corrobora com o achado de diferenças significativas apenas para neurônios do Tipo II no hipocampo dos animais estudados, que como já ditas são células altamente marcadas pela coloração diaforasica, que aparecem em fases mais tardias da vida do animal mesmo sob o protocolo de estresse crônico por contenção..

(37) 22. 5.2.2 DISTRIBUIÇÃO DE NEURÔNIOS TIPO II NAS ÁREAS HIPOCAMPAIS. O hipocampo está criticamente envolvido na formação da memória, podendo operar como uma unidade integrada ou como partes isoladas, sendo responsável também por diferentes funções dentro da consolidação da memória (MAY-BRITT; MOSER, 1998). Como anteriormente exposto não houve diferenças significativas entre a expressão dos neurônios Tipo I e o estado agudo e crônico do estresse fisiológico (Figura 9), a investigação proposta passou então a verificar se existem diferenças na expressão de neurônios diaforásicos do Tipo II nas áreas hipocampais CA1, CA2, CA3 e giro denteado. A figura 11 (a, c) apresenta os gráficos que nos mostram que na área CA1 e CA3 não encontramos diferenças significativas entre o número de neurônios diaforásicos do Tipo II nos grupos tratados sob o protocolo de estresse agudo e crônico e seus respectivos controles, bem como entre os estressados agudamente e cronicamente (Figura 11 a, 11 c). O número de neurônios do Tipo II nessas áreas demonstrou valores muito próximos. Mostrando que para essas determinadas áreas os diferentes tratamentos não tiveram impacto sobre a expressão da NOS..

(38) 23 Relação de neurônios Tipo II marcados pela técnica de NADPHDIAFORASE nas diferentes áreas cerebrais. a.. b.. c.. d.. Figura 11. Gráficos da relação dos neurônios Tipo II no hipocampo de ratos Wistar nas diferentes áreas hipocampais. a. CA1. b. CA2. c. CA3. d. GD (giro denteado), submetidos ao protocolo de estresse agudo e crônico por contenção. *p<0,05 quando comparado com todos os grupos. #p<0,05 quando comparado com o controle do grupo crônico. n=4.. No entanto, tem sido relatado que a marcação de neurônios positivos para NOS ou seu marcador, NADPH diaforase, são escassos na camada piramidal de CA1 e CA2 em situações basais (VALTSCHANOFF et al., 1993; YAN; RIBACK, 1997), mostrando que o aumento de produção de células diaforase positivas em CA2 são eventos próprios do estresse a longo prazo..

(39) 24. Nossos resultados demonstraram que na área CA2 houve um aumento significativo na expressão de neurônios tipo II em animais estressados cronicamente quando comparados aos seus controles, o que nos sugere que existe uma diferença na expressão de NOS entre as áreas hipocampais, uma vez que não foi observada diferença significativa em CA1 e CA3. No entanto, não houve diferença significativa na expressão destes neurônios entre os animais submetidos ao estresse agudo e ao estresse crônico. Desta forma, é necessário o desenvolvimento de estudos que busquem identificar os mecanismos responsáveis por estas diferenças, uma vez que não existem dados na literatura acerca disto, e que nos permita determinar a relação entre o aumento da expressão destes neurônios com uma determinada modulação fisiológica. Na região do Giro Denteado do hipocampo verificou-se uma diferença significativa entre neurônios Tipo II nos animais tratados cronicamente quando comparados com todos os grupos. Demonstrando que essa área de importante participação na consolidação da memória estaria sofrendo grandes efeitos sob a condição de estresse crônico.. 5.2.3 RELAÇÃO ENTRE O NÚMERO DE NEURÔNIOS TIPO I E TIPO II ENTRE A REGIÃO ANATÔMICA SEPTAL E TEMPORAL DO HIPOCAMPO. Evidências recentes sugerem que o hipocampo é funcionalmente diferenciado ao longo do seu eixo septo temporal ou dorsoventral. As conexões corticais e subcorticais do hipocampo dorsal e ventral são diferentes, com informação proveniente dos córtices sensoriais que entram principalmente vias da região dorsal de dois terços ou três quartos do giro denteado (MAY-BRITT; MOSER,1998). Ratos podem adquirir memoria espacial se pequenos blocos de tecido dentro do giro denteado são poupados em grandes lesões, porém se grandes blocos de tecido forem removidos no final da região ventral, eles não são capazes de sustentar a aprendizagem espacial (GABBOTT; BACON, 1996). Nos primatas, o hipocampo posterior (correspondente ao hipocampo dorsal de roedores), parece ser mais importante do que a região anterior para a codificação da memória espacial e certas formas de memória não espacial (GABBOTT; BACON, 1996; MAY-BRITT; MOSER, 1998)..

(40) 25. A formação hipocampal ventral (ou anterior), em certo ponto deconectada do resto da estrutura, tanto em termos de ligações intra-hipocampal e extra-hipocampal, pode executar funções que são qualitativamente diferentes e independentes aos da formação hipocampal dorsal (MAY-BRITT; MOSER, 1998). Avaliando esses aspectos morfológicos do hipocampo foi verificado que na região mais anterior do hipocampo, chamada anatomicamente de região septal do hipocampo, existem diferenças entre a expressão de Neurônios Tipo I e Tipo II como mostra a figura 12. Sendo que mais uma vez a expressão de neurônios Tipo I não foi significativa em nenhum dos grupos na região septal do hipocampo (Figura 12 a.). Por outro lado a taxa dos neurônios do Tipo II em animais estressados cronicamente quando comparados tanto com seu respectivo controle, quanto com o grupo de animais estressados agudamente, mostrou-se bem maior (Figura 12 b.).. Número de neurônios Tipo I e II da região septal do hipocampo marcados pela técnica de NADPH-DIAFORASE. a.. b.. Figura 12. Número de neurônios Tipo I e II no hipocampo de ratos Wistar submetidos ao protocolo de estresse agudo e crônico por contenção. Análise de cortes da região septal do hipocampo. a. Relação para neurônios tipo I. b. Relação para neurônios tipo II. p**<0,01 quando comparado com todos os grupos. n=4..

(41) 26. Seguindo a mesma linha de pensamento foi feita a avaliação da expressão de neurônios Tipo I e Tipo II para a região dorsal do hipocampo (Figura 13), de modo que, novamente, a avaliação dos neurônios do Tipo I (Figura 13 a.) não apresentou diferenças significativas entre o grupo teste estresse crônico, grupo teste estresse agudo e seus respectivos controles. Mostrando mais uma vez que os neurônios que mais expressam a NOS de acordo com a técnica da NADPH diaforase, não mostram diferenças quantitativas em relação ao aumento do número de células nos diferentes tratamentos e nas diferentes regiões anatômicas do hipocampo.. Número de neurônios Tipo I e II da região dorsal do hipocampo marcados pela técnica de NADPH-DIAFORASE. a.. b.. Figura 13. Número dos neurônios Tipo I e II no hipocampo de ratos Wistar submetidos ao protocolo de estresse agudo e crônico por contenção. Análise de cortes da região dorsal do hipocampo. a. Relação para neurônios tipo I. b. Relação para neurônios tipo II. p*<0,05 quando comparado com todos os grupos. n=4.. Já na avaliação do número de neurônios Tipo II na região dorsal (Figura 12 b.) do hipocampo, verificamos um aumento significativo (p<0,01) para o grupo de animais estressados cronicamente quando comparados ao grupo de animais estressados agudamente e os respectivos grupos controle. O número de células encontrado na porção dorsal do hipocampo foi numericamente menor do que nas fatias analisadas do.

(42) 27. hipocampo. septal.. Porém a. diferença. de. expressão. entre os grupos foi. significativamente maior, mostrando mais uma vez que o tratamento crônico dos animais parece estimular uma maior expressão de células com potencialidade de produzir NO. Como se pode perceber a partir das análises feitas, o tratamento crônico demonstra um aumento de forma significativa com relação à expressão de neurônios diaforásicos do Tipo II, neurônios que em sua constituição são considerados nitrérgicos. O estresse a longo prazo parece, de forma fisiológica, está envolvido na maior expressão de NOS, fato esse, explorado através da técnica de Western Blot.. 5.3 QUANTIFICAÇÕES DA NOS POR WESTERN BLOT NO HIPOCAMPO. A técnica possibilita a determinação da quantidade proteica, mensurada em valores quantitativos. Dessa forma conseguimos deduzir se ocorre aumento ou diminuição das NOS, presentes no hipocampo após o protocolo de estresse agudo e crônico utilizado. Os resultados das análises dos níveis de expressão das três isoformas estudadas das NOS confirmaram a presença da nNOS, p-nNOS e i-NOS no hipocampo de ratos (Figuras 14, 15 e 16).. 5.3.1 EXPRESSÃO ISOFORMA nNOS. A nNOS é expressa constitutivamente no cérebro, portanto nossa avaliação dos níveis dessa NOS consistiu em verificar os níveis de expressão desta enzima de acordo com os tratamentos dos protocolos de estresse agudo e crônico. Como visualizado na figura 14, o grupo de animais estresse crônico mostrou um aumento significativo na expressão da nNOS quando comparado com seu respectivo grupo controle (p<0,05) e também mostrou aumento significativo quando comparado ao grupo estresse agudo (p<0,01). Este fato corrobora os dados obtidos nos estudos de histoquímica para diaforase, os quais mostraram um relativo aumento de neurônios nitrérgicos em áreas determinadas do hipocampo. De fato, já é sabido, que o estresse crônico aumenta as expressões de NOS, mas no presente estudo percebemos que o.

(43) 28. estresse agudo parece ainda não exercer efeito significativo sobre essa expressão nitrérgica.. Figura 14. Determinação da expressão proteica da enzima Óxido Nítrico Sintase Neuronal (nNOS) em hipocampo de ratos submetidos à estresse de contenção. Os valores apresentados foram expressos em unidades arbitrarias (u.a.) e estão representados em média ± e.p.m. Grupo controle agudo (Ctr. Agu. – n=7), Grupo estresse agudo (Str. Agu. – n=7), Grupo controle crônico (Ctr. Crôn. – n=5), Grupo estresse crônico (Str. Crôn. – n=6). *p<0,05, **P<0,01..

(44) 29. 5.3.2 EXPRESSÃO DA ISOFORMA p-nNOSser852 A medição da expressão de p-nNOSser852 nos indica o estado de ativação ou inativação da nNos no tecido. A isoforma p-nNOSser852 é a forma da NOS fosforilada que se da pela medida do sítio Serina 852, que constitui o sítio de inativação da proteína. Ou seja, em níveis mais elevados da p-nNOSser852 estamos na verdade mensurando a inativação da nNOS. Na figura 15 está representada a determinação da expressão da nNOS fosforilada no resíduo de Serina na posição 852 (p-nNOSSer852), conhecido, quando fosforilado, causar inativação desta enzima. Nas medidas realizadas foram detectadas reduções significativas (p<0,05) na expressão da p-nNOSSer852 nos hipocampos isolados dos animais estressados agudo e cronicamente quando comparados aos seus respectivos controles. Não observamos variação de ativação relacionando o grupo estresse agudo com o grupo estresse crônico. Este fato indica que nos dois tratamentos ocorre ativação da nNOS, e que a via de produção de oxido nítrico endógena está continuamente ativada. Contudo, o aumento de NO no estresse crônico pode ser modulado através da ativação de outra isoforma de NOS, já que o aumento da expressão da forma ativada da nNOS não muda, tanto para o grupo estresse crônico, quanto para o grupo estresse agudo. A alteração entre os estados de ativação ocorre apenas entre os grupos teste e seus respectivos controles (Figura 15)..

(45) 30. Figura 15. Determinação da expressão proteica da enzima Óxido Nítrico Sintase Neuronal Fosforilada (p-nNOS ser852) em hipocampo de ratos submetidos à estresse de contenção. Os valores apresentados foram expressos em unidades arbitrarias (u.a.) e estão representados em média ± e.p.m. Grupo controle agudo (Ctr. Agu. – n=4), Grupo estresse agudo (Str. Agu. – n=5), Grupo controle crônico (Ctr. Crôn. – n=6), Grupo estresse crônico (Str. Crôn. – n=5). *p<0,05..

(46) 31. 5.3.3 EXPRESSÃO DA ISOFORMA i-NOS. A isoforma i-NOS é conhecida por ser uma isoforma expressa naturalmente em neurônios, e sua atividade traz uma contribuição expressiva para a quantidade de NO produzida nestas células. Deste modo, identificar a expressão de i-NOS em animais submetidos ao estresse por contenção mostra-se de grande importância para tentarmos correlacionar à ativação dos neurônios nitrérgicos com a isoforma de NOS que contribui para a produção desta molécula, bem como, correlacionar a expressão desta isoforma de acordo com a duração do estado de estresse por contenção. Como pode ser observado na figura 16, houve aumento significativo da expressão da isoforma i-NOS entre o grupo estresse crônico e seu respectivo controle, este fato demonstra que, no estresse crônico, possivelmente, há uma produção aumentada de NO por esta via de produção. Nesta figura, podemos ainda verificar que o grupo crônico quando comparado ao grupo estressado agudamente, apresenta, também o nível de expressão da isoforma iNOS aumentada. O que nos indica que, provavelmente, o estresse a longo prazo tem uma relação íntima com altos níveis de NO. A literatura mostra que a produção de NO pela i-NOS é maior quando comparado com a produção pelas demais isoformas de NOS conhecidas. Segundo Dusting e Macdonald (1995) essa isoforma requer algumas horas para ser expressa, mas, uma vez sintetizada, sintetiza quantidades de NO, em concentrações molares maiores que as isoformas c-NOS. Os efeitos deletérios o NO são desencadeados através de uma ação tóxica devido à reação do NO com o ânion superóxido (O2-) resultam na formação de peroxinitrito (ONOO-), um poderoso oxidante de proteínas. O ONOO - aumentando efetivamente a ação tóxica do NO e do O2– (BECKMAN; KOPPENOL,1996). Os efeitos deletérios do estresse crônico assim se relacionam com os efeitos deletérios da maior produção de NO pela via da i-NOS. Efeitos estes que ainda não são desencadeados em curto prazo no estresse agudo..

(47) 32. Figura 16. Determinação da expressão proteica da enzima Óxido Nítrico Sintase Induzida (i-NOS) em hipocampo de ratos submetidos à estresse de contenção. Os valores apresentados foram expressos em unidades arbitrarias (u.a.) e estão representados em média ± e.p.m. Grupo controle agudo (Ctr. Agu. – n=5), Grupo estresse agudo (Str. Agu. – n=7), Grupo controle crônico (Ctr. Crôn. – n=5), Grupo estresse crônico (Str. Crôn. – n=6). *p<0,05..

(48) 33. 6 CONCLUSÃO - A produção de NO se dá por outra via que não a da p-nNOSser852.. - O desfavorecimento à homeostasia da circuitaria hipocampal pelo aumento da produção de NO, provavelmente, se dá através da via de produção da i-NOS.. - O estresse agudo não é capaz de produzir efeitos significativos sobre a produção do NO, no tocante a promover danos a homeostasia hipocampal..