Extração dos compostos fenólicos das películas das uvas

Para a extração dos compostos fenólicos a partir das películas das uvas utilizaram- se 5 bagos. As películas foram pesadas e colocadas num almofariz, onde foram maceradas

29 com 10 mL de metanol acidificado. Este procedimento foi repetido 2 vezes. O extrato fenólico foi centrifugado durante 15 minutos a 3000 rotações por minuto. O líquido sobrenadante foi recuperado e guardado em balões volumétricos de 50 mL, perfazendo o mesmo com metanol acidificado, de seguida foram armazenados à temperatura de refrigeração. Todos os extratos foram preparados em triplicado (Downey et al. 2007).

2.3.1. Tonalidade

Foi medida a absorvância do extrato fenólico a 420 e a 520nm, sendo a tonalidade obtida a partir da razão entre a absorvância a 420nm e a absorvância a 520nm, de acordo com OIV (2013).

2.3.2. Intensidade corante

Foi medida a absorvância do extrato fenólico a 420, 520 e 620nm, sendo a intensidade corante obtida a partir da soma das absorvâncias a 420, 520 e 620nm, de acordo com OIV (2013).

2.3.3.Fenóis totais

Para a determinação dos fenóis totais utilizou-se o método de Folin-Ciocalteau, descrito por Barros et al. (2012). Este método consiste numa mistura dos ácidos fosfomolibídico e fosfotungstico, em meio alcalino, de coloração amarela, que na presença de agentes redutores como compostos fenólicos originam óxidos de molibdénio e tunguesténio de coloração azul. A partir da coloração azul é possível determinar o conteúdo em compostos fenólicos existentes na solução, medindo num espetrofotómetro a absorvância a 750nm.

Para a quantificação dos fenóis totais foi necessário construir uma reta de calibração onde se usou como padrões ácido gálico com as seguintes concentrações: 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 e 250 mg/L. Nos tubos de ensaio colocou-se 1 mL de ácido gálico (com as diferentes concentrações), 0,5 mL de reagente de Folin- Ciocalteau, 2 mL da solução de Carbonato de sódio (Na2CO3) e 6,5 mL de H2O destilada

seguido de homogeneização. Os tubos foram colocados num banho-maria a 70ºC durante 30 minutos, seguido de arrefecimento em água corrente e leitura da sua absorvância a 750nm.

30 Para a determinação dos fenóis totais nas amostras efetuou-se o mesmo procedimento com a diferença de que em vez de utilizar padrões de ácido gálico usou-se amostra diluída (50 vezes). Todas as análises foram efetuadas em duplicado. Por interpolação, a partir da reta de calibração calculou- se a concentração de fenóis totais em cada uma das amostras, e os resultados foram expressos em mg ácido gálico/g película.

2.3.4. Orto-difenóis

A determinação do teor em orto-difenóis foi efetuada de acordo com o método descrito por Mateos et al., (2001). Assim, para a construção da reta de calibração, foram preparadas soluções padrão de ácido gálico com diferentes concentrações (5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 e 250 mg/L). Para a construção da reta de calibração dos orto- difenóis colocou-se em tubos de ensaio 4 mL de cada padrão de ácido gálico e 1 mL de molibdato de sódio. Aguardou-se 15 minutos e leu-se a absorvância a 370nm.

No anexo 3 encontra- se a reta de calibração obtida para a determinação da concentração dos orto- difenóis.

Para a determinação dos orto-difenóis das amostras procedeu-se do mesmo modo, substituindo os padrões de ácido gálico pela amostra diluída. Esta análise foi realizada em duplicado, e os resultados foram expressos em mg ácido gálico/g película.

2.3.5.Flavonóides

A determinação do teor em flavonóides dos extratos em estudo foi efetuada de acordo com o descrito por Zhishen et al., (1999). No anexo 4 encontra- se a reta de calibração obtida para a determinação da concentração dos flavonóides.

Para a determinação dos flavonóides nas amostras procedeu-se do modo anteriormente descrito, substituindo os padrões de catequina pela amostra diluída. Esta análise foi realizada em duplicado, e os resultados foram expressos em mg catequina /g película.

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2.3.6. Atividade antioxidante

A atividade antioxidante foi determinada pelo método TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity). Este ensaio permite a quantificação da atividade antioxidante de uma amostra através da sua capacidade em reduzir radicais catiões ABTS•+.

Ao juntar na mistura reacional persulfato de potássio a ABTS (ácido 2,2'-azino- bis (3 - etilbenzotiazolino-6-sulfónico), este último é oxidado ao catião ABTS•+, que possui uma coloração azul escuro. Ao juntar substâncias antioxidantes à mistura, o catião ABTS•+ é reduzido a ABTS, fazendo com que se dê a descoloração da solução inicial.

No presente trabalho foi utilizado um antioxidante sintético o ácido (6-hidroxi- 2,5,7,8-tretametil-2-cromil) fórmico, genericamente designado por Trolox (figura 17).

Figura 17. Princípio do método da capacidade antioxidante (Fonte: Protocolo: Determinação da atividade antioxidante de vinhos e sumos de fruta)

Para a construção da reta de calibração foram adicionados a 6 tubos de ensaio 2 mL da solução de trabalho ABTS• e aos tubos de ensaios de 2 a 6 adicionou-se 200, 150, 100, 50 e 25 μL da solução de trabalho de Trolox 11mM, respetivamente. Por fim, aos tubos de ensaio 1, 3 a 6 adicionou-se 200, 50, 100, 150 e 175 μL de água, respetivamente. O tubo de ensaio 1 é o branco. Após 15 minutos de repouso leu- se a absorvância a 734nm.

No anexo 2 encontra- se a reta de calibração para os cálculos da quantificação da atividade antioxidante.

A percentagem de inibição de cada padrão foi calculada pela seguinte fórmula:

Para a quantificação da atividade antioxidante adicionou-se em 3 tubos de ensaio 2 mL da solução de trabalho de ABTS•, 200, 100 μL de amostra diluída e 100, 150 μL de

32 água para completar o volume dos tubos de ensaio que não continham 2,2 mL. Este ensaio foi realizado em duplicado. Após 15 minutos de espera leu-se a absorvância a 734nm. Por interpolação a partir da reta de calibração, foi determinada a atividade antioxidante das amostras. Os resultados foram expressos em μmol de Trolox/g de película (Ozgen et al., 2006).

2.3.7.Antocianinas totais

Para a quantificação das antocianinas totais foram preparados 2 tubos de ensaio; um dos tubos continha 1 mL da amostra concentrada, 1 mL da solução etanólica a 0,1% HCl concentrado e 10 mL da solução tampão a pH 3,5 e o outro tubo continha 1 mL da amostra diluída, 1 mL da solução etanólica 0,1% HCl concentrado e 10 mL de uma solução de HCl a 2% com pH 0,6 (Lee et al., 2005).

A concentração de antocianinas totais presentes nas amostras calculou-se através da seguinte fórmula: