Universidade de Trás-os-Montes e Alto-Douro
Estudo de parâmetros químicos e bioquímicos de
castas tintas cultivadas na Região Demarcada do
Douro
Ana Filipa Cachaço Santos
Dissertação de Mestrado em Biotecnologia e Qualidade Alimentar
Orientadora: Professora Doutora Ana Isabel Ramos Novo Amorim Barros Co-orientadora: Professora Doutora Maria Fernanda Gil Cosme Martins
I
Universidade de Trás-os-Montes e Alto-Douro
Estudo de parâmetros químicos e bioquímicos de
castas tintas cultivadas na Região Demarcada do
Douro
Ana Filipa Cachaço Santos
Dissertação de Mestrado em Biotecnologia e Qualidade Alimentar
Composição de júri:
Presidente: Professor Doutor António Inês Vogais: Professora Doutora Ana Barros
Professora Doutora Eunice Bacelar
II
Agradecimentos
Em primeiro lugar quero agradecer aos meus pais e irmã, pela compreensão, incentivo e carinho, porque sem eles nada teria sido possível.
Quero agradecer à Tânia, pelo apoio e motivação e também ao resto da família que de uma forma ou de outra contribuiu para e elaboração deste trabalho.
Agradeço à Professora Doutora Ana Novo Barros, professora e orientadora, por todo o apoio, pela sua disponibilidade, paciência, simpatia e pelo conhecimento que me transmitiu.
À Professora Doutora Fernanda Cosme, professora e Co-orientadora, pelo auxílio, disponibilidade, paciência, simpatia e conhecimento.
Às minhas companheiras de laboratório, Carolina Gonçalves e Patrícia Nunes, que sem elas não tinha conseguido concluir o trabalho com sucesso. Obrigada pelas palavras ditas, apoio, brincadeiras, paciência, amizade e compreensão.
Aos meus grandes amigos Maria Cunha, Carlos Marques, Sílvia Martins, Rui Costa, Miguel Magalhães, Carla Sobreira e Irene Gouvinhas pelo encorajamento, pelas palavras de ânimo nos momentos em que mais precisei e pela amizade.
Agradeço também à Professora Doutora Paula Lopes e à empresa Sogrape vinhos S.A, por me ter cedido as amostras de uvas.
À dona Palmira e ao senhor Carlos por terem cedido soluções e algum material.
Obrigada a todas as pessoas que contribuíram de forma positiva para a elaboração deste trabalho.
III
Índice geral
Agradecimentos II
Índice de tabelas VI
Índice de figuras VII
Lista de abreviaturas IX
Resumo X
Abstract XI
Capitulo I- Revisão bibliográfica 1
1.1. Enquadramento temático 2
1.2. Produção de vinho 2
1.3. Região Demarcada do Douro 4
1.3.1. O solo 8
1.3.2. O clima 8
1.4. Castas autorizadas e castas recomendadas 8
1.5. Castas tintas cultivadas na Região Demarcada do Douro 9
1.5.1. Alicante Bouschet 9 1.5.2. Cabernet Sauvignon 10 1.5.3. Merlot Noir 11 1.5.4. Rufete 12 1.5.5. Sousão 13 1.5.6. Pinot Noir 14 1.5.7. Donzelinho Tinto 14 1.6. Compostos fenólicos 15 1.6.1. Flavonóides 16
IV
1.7. Composição fenólica do vinho 20
1.8. Atividade antioxidante 22
1.9. Objetivos do trabalho 25
Capitulo II- Material e métodos 26
2.1. Amostragem 27
2.2. Caracterização enológica das castas 28
2.2.1. Extração do mosto das uvas 28
2.2.2. Acidez total 28
2.2.3. pH 28
2.2.4. Grau Brix 28
2.2.5.Álcool provável 28
2.3. Composição fenólica dos extratos das películas das uvas 28
2.3.1. Tonalidade 29 2.3.2. Intensidade corante 29 2.3.3. Fenóis totais 29 2.3.4. Orto- difenóis 30 2.3.5. Flavonóides 30 2.3.6. Atividade antioxidante 31 2.3.7. Antocianinas totais 32
2.4. Tratamento estatístico dos dados 32
Capitulo III- Resultados e discussão 33
3.1. Caracterização do mosto das castas tintas 34
3.2. Antocianinas totais, tonalidade e intensidade corante 36
V 3.4. Correlação entre a atividade antioxidante e alguns parâmetros avaliados,
orto-difenóis, fenóis totais e flavonóides 40
3.5. Análise em componentes principais 42
Capitulo IV- Conclusões e perspetivas futuras 44
4.1. Conclusões e perspetivas futuras 45
Capitulo V- Referências bibliográficas 46
VI
Índice de Tabelas
Tabela 1- Castas tintas autorizadas
9
Tabela 2 – Estrutura dos flavonóides e sub-classes
18
Tabela 3 – Estrutura dos ácidos benzóicos mais abundantes nas uvas
19
Tabela 4 – Estrutura dos ácidos cinâmicos mais abundantes nas uvas
19
Tabela 5 – Coordenadas do local de vindima
27
Tabela 6- Peso, volume de mosto, pH, ºBrix, acidez total e álcool provável do mosto das sete castas em estudo cultivadas na Região Demarcada do Douro
(vindima 2012 e 2013) 34
Tabela 7- Antocianinas totais, tonalidade e intensidade corante do extrato fenólico das películas das sete castas em estudo cultivadas na Região Demarcada do Douro
(vindima de 2012 e 2013) 37
Tabela 8- Fenóis totais, flavonóides, orto-difenóis e atividade antioxidante do extrato fenólico das películas das sete castas em estudo cultivadas na Região Demarcada do Douro (vindima de 2012 e 2013)
VII
Índice de Figuras
Figura 1- Produção mundial de vinho entre os anos de 2000 e 2014 2
Figura 2- Produção de vinho em Portugal para cada região demarcada 3
Figura 3- Consumo mundial de vinho 4
Figura 4- Consumo de vinho em Portugal 4
Figura 5- Mapa da Região Demarcada do Douro, com as três sub-regiões
indicadas 6
Figura 6- Mapa da Região Demarcada do Douro, destacando-se a sub-região do
baixo corgo 7
Figura 7- Casta Alicante Bouschet 10
Figura 8- Casta Cabernet Sauvignon 11
Figura 9- Casta Merlot Noir 12
Figura 10- Casta Rufete 13
Figura 11- Casta Sousão 13
Figura 12- Casta Pinot Noir 14
Figura 13- Casta Donzelinho Tinto 15
Figura 14- Estrutura base dos flavonóides 16
Figura 15- Estrutura do resveratrol 20
Figura 16- Mecanismo da atividade antioxidante dos compostos fenólicos 24
VIII Figura 18- Correlação entre a atividade antioxidante o os fenóis totais 40
Figura 19- Correlação entre a atividade antioxidante e os orto-difenóis 41
Figura 20- Correlação entre a atividade antioxidante e os flavonóides 41
Figura 21- Projeção das castas tintas após análise em componentes principais dos parâmetros analisados (fenóis totais, atividade antioxidante, flavonóides e orto- difenóis) de dois anos de colheita
IX
Lista de abreviaturas
ABTS 2,2'-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) sal diamónio INE Instituto Nacional de Estatística
IVV Instituto da Vinha e do Vinho
OIV International Organization of Vine and Wine OMS Organização Mundial de Saúde
X
Resumo
Os compostos fenólicos têm um papel muito importante em enologia devido à sua contribuição de forma direta para as propriedades organoléticas do vinho e também pela sua participação em diversas reações químicas durante o processo de vinificação e de envelhecimento, que originam novos compostos com propriedades organoléticas. Neste sentido, estudaram-se sete castas tintas, Alicante Bouschet, Cabernet Sauvignon, Merlot Noir, Pinot Noir, Donzelinho Tinto, Rufete e Sousão, cultivadas na Região Demarcada do Douro, da vindima de 2012 e 2013, utilizadas para a produção de vinho, quanto à sua composição fenólica e atividade antioxidante. Foram determinados neste estudo os parâmetros químicos como: fenóis totais, flavonóides, orto-difenóis e antocianinas totais, bem como a atividade antioxidante; os parâmetros físico-químicos tais como: cor, pH, peso de bagos, ºBrix, acidez total, açúcares totais e álcool provável; foram ainda determinadas as correlações entre a atividade antioxidante e os parâmetros relativos à composição fenólica das sete castas tintas cultivadas na Região Demarcada do Douro. Dos resultados obtidos concluiu-se que na vindima de 2012 a casta Alicante Bouschet foi a que apresentou os valores mais elevados quanto à atividade antioxidante, orto-difenóis e flavonóides. Em contrapartida, a casta Donzelinho Tinto foi a que apresentou valores mais baixos em todos os parâmetros químicos analisados. Na vindima de 2013, verificou-se novamente que a casta Alicante Bouschet foi a que apreverificou-sentou os valores mais elevados relativamente à atividade antioxidante, orto-difenóis e fenóis totais, por sua vez as castas Merlot Noir e Donzelinho Tinto apresentaram os valores mais baixos de entre todos os parâmetros químicos analisados. Relativamente aos parâmetros pH, ºBrix e açúcares totais a casta que apresentou os resultados mais elevados foi a Rufete na vindima de 2012, enquanto o mosto da casta Pinot Noir apresentou os valores mais baixos. Na vindima de 2013 os resultados variaram muito entre si, sendo o mosto da casta Rufete o que apresentou o valor de pH mais elevado, e por sua vez o ºBrix mais baixo. De um modo geral pode concluir-se, que no ano de vindima de 2013 os valores dos parâmetros estudados foram mais elevados que os da vindima de 2012, o que poderá estar relacionado com as condições climáticas desses anos, uma vez que sendo os compostos fenólicos metabolitos secundários, são fortemente influenciados por estas condições.
Palavras-Chave:
Compostos fenólicos, atividade antioxidante,
Douro, castas tintas, castas recomendadas e castas autorizadas.XI
Abstract
Phenolic compounds play an important role in oenology once they have a direct contribution on wine organoleptic properties, but also because they participate in various chemical reactions during the winemaking and aging process, rising new compounds with sensory properties. Therefore, we studied seven red grape varieties, namely Alicante Bouschet, Cabernet Sauvignon, Merlot Noir, Pinot Noir, Donzelinho Tinto, Rufete and Sousão, grown in Douro Region, during the harvest of 2012 and 2013, all of them used for wine production, concerning their phenolic composition and antioxidant activity. In this work, some chemical parameters were determined, such as total phenols, flavonoids,
ortho-diphenols and anthocyanins, as well as antioxidant activity; physico-chemical
parameters, such as: color, pH, grape berry weight, °Brix, total acidity, total sugars and estimated alcohol degree. The correlations between antioxidant activity and the others phenolic compounds from the seven different grape varieties grown in the Douro Region were also determined. The results demonstrated that in 2012 vintage Alicante Bouschet grape variety was the one with the highest values for antioxidant activity, ortho-diphenols and flavonoids. In contrast, Donzelinho Tinto grape variety showed the lowest values for all chemical parameters analyzed. In 2013 vintage, Alicante Bouschet grape variety continued to be the one with the highest values for the antioxidant activity, ortho-diphenols and total phenols, however, Merlot Noir and Donzelinho Tinto grape varieties presented the lowest values for all chemical parameters analyzed. Regarding pH, °Brix and total sugars, the grape that showed the highest values was Rufete in the 2012 vintage, while Pinot Noir presented the lowest values. In 2013 harvest, results varied greatly wherein the Rufete grape variety presented the highest pH value and the lowest °Brix. In general it can be concluded that in the 2013 vintage the values of the parameters studied were higher than those of the vintage 2012, which may be related to climatic conditions of those years, since phenolic compounds are secondary metabolites, they are strongly influenced by these conditions.
Keywords: Phenolic compounds, antioxidant activity, Douro red grape varieties, recommended varieties; authorized varieties.
1
Capítulo I
2
1.1.Enquadramento temático
Em Portugal, destacam-se várias regiões vitivinícolas, bem como um número elevado de castas, cuja qualidade e tipicidade resulta da diversidade e adaptação às várias regiões em que são cultivadas, nomeadamente condições climatéricas e geológicas.
A videira é, sob o ponto de vista económico, uma das espécies produtoras de frutos mais importante no mundo, com diferentes utilidades, desde a produção de vinho, de uva de mesa, de uvas passas e de diversos compostos orgânicos.
A uva é um fruto muito consumido, rico em diversos minerais e vitaminas, e ainda lhe são atribuídas propriedades antioxidantes e anticancerígenas. É uma das frutas que possui mais hidratos de carbono, sendo no entanto o seu teor calórico elevado. Contém resveratrol, que é um composto antioxidante e anticancerígeno, ao qual lhe são atribuídas diversas propriedades curativas desde a antiguidade.
O vinho é uma das bebidas alcoólicas, mais consumidas no mundo, sendo que o seu consumo moderado pode trazer benefícios para a saúde (OMS, 2015).
1.2.Produção de vinho
Entre os anos de 2000 e 2014, a produção mundial de vinho tem vindo a diminuir. Os maiores produtores de vinho a nível mundial são a África do Sul, o Chile, a Austrália, a França, a Itália, a Argentina e a China, como mostra a figura 1.
Figura 1. Produção mundial de vinho entre os anos de 2000 e 2014 (OIV, 2014)
França Itália Espanha Estados Unidos Argentina Austrália China África do Sul Chile Alemanha Portugal Roménia Grécia Brasil Outros
3 O volume de produção de vinho em Portugal depende muito da região, do tipo de castas e, ainda, das práticas culturais. O facto de existir em Portugal uma predominância do minifúndio na cultura da vinha, explica a existência de um elevado número de pequenos produtores e empresários em nome individual (IVV, 2015).
A Região Demarcada do Douro é a região mais produtiva em Portugal, como se pode verificar na Figura 2. Esta tem um mercado associado a vinhos generosos marcadamente voltado para a exportação, sendo por isso a região vitivinícola com maior reconhecimento internacional (IVV, 2015).
Figura 2- Produção de vinho em Portugal para cada região demarcada (hL) (IVV, IP 2015). Relativamente ao consumo de vinho a nível mundial, verifica -se que entre 2000 e 2007 houve um crescimento notável, apresentando um pico máximo de consumo em 2007, observando-se a partir daí um decréscimo até 2009. Entre os anos de 2009 e 2014 o consumo mundial de vinho manteve-se constante, como mostra a Figura 3. Os dados disponíveis mostram uma consolidação do consumo global, em cerca de 243 MhL.
4 Figura 3- Consumo mundial de vinho (MhL) (OIV, 2014).
Analisando a figura 4, verifica-se que a tendência do consumo de vinho nos últimos anos tem sido para um decréscimo, estimando-se nos anos de 2011/2012 os valores mais elevados (4994 hL x 1000), por sua vez os anos de 2012/2013 exibiram os valores mais baixos (4164 hL x 1000) relativamente aos restantes anos em estudo.
Figura 4. Consumo de vinho em Portugal (estatísticas agrícolas de 2014, INE)
1.3. Região Demarcada do Douro
A Região Demarcada do Douro é a mais antiga e foi a primeira região demarcada e regulamentada do mundo (Pereira, 1998; Almeida, 2010).
5 O Alto Douro Vinhateiro foi classificado como Património Mundial pela UNESCO, em Dezembro de 2001. Tal como mencionado no texto da sua candidatura submetido à UNESCO: “O Alto Douro Vinhateiro é uma zona particularmente representativa da paisagem que carateriza a vasta Região Demarcada do Douro, a mais antiga região vitícola regulamentada do mundo. A paisagem cultural do Alto Douro combina a natureza monumental do vale do rio Douro, feito de encostas íngremes e solos pobres e acidentados, com a ação ancestral e contínua do Homem, adaptando o espaço às necessidades agrícolas de tipo mediterrâneo que a região suporta. Esta relação íntima entre a atividade humana e a natureza permitiu criar um ecossistema de valor único, onde as características do terreno são aproveitadas de forma exemplar, com a modelação da paisagem em socalcos, preservando-a da erosão e permitindo o cultivo da vinha. A região produz o famoso vinho do Porto, representando o principal vetor de dinamização da tecnologia, da cultura, das tradições e da economia local. O grande investimento humano nesta paisagem de singular beleza tornou possível a fixação das populações desde a longínqua ocupação romana, e dele resultou uma realidade viva e em evolução, ao mesmo tempo testemunho do passado e motor do futuro, solidamente ancorado na otimização dos recursos naturais e na preservação dos ambientes….” (Aguiar, 2002; UNESCO, 2015).
A região vitivinícola designada por Região Demarcada do Douro é uma das regiões vinhateiras mais relevantes, abonadas e conhecidas a nível mundial (Climaco, et
al., 2012).
O Vinho do Porto é o principal produto da Região Demarcada do Douro, que apresenta uma qualidade elevada, o que levou a que a região ganhasse alguma notabilidade. Na altura os vinhos de mesa produzidos eram classificados como subprodutos (vinho remanescente das uvas não passível de ser transformado em Vinho do Porto). Só no final da década de noventa é que se transformou numa região produtora, não só do Vinho do Porto, mas também de vinhos altamente estimados no mercado nacional e internacional (http:// dourowinetourism.com, 2015; Jones, 2013).
6 A bacia hidrográfica do rio Douro abrange, em território português, os distritos de Vila Real, Porto, Bragança, Aveiro, Viseu e Guarda (Vitor e Monzón, 1999). Devido às grandes diferenças meso climáticas, influenciadas quer por diferentes altitudes, quer pelo maior ou menor afastamento do mar, a região do Douro é subdividida segundo três sub-regiões (figura 5): o Baixo-Corgo, o Cima-Corgo e o Douro Superior (Magalhães, 2008).
Figura 5. Mapa da Região Demarcada do Douro com as três sub-regiões indicadas: baixo corgo (esquerda), cima corgo (centro) e douro superior (direita) (aldeiasdeouro.com, Julho 2015).
O Baixo Corgo abrange toda a bacia interior da Região Demarcada do Douro, desde Barqueiros até à linha meridiana que passa pela foz do rio Corgo, como se pode visualizar na figura 6 (Filipe et al., 1998).Esta zona é a mais ocidental das sub-regiões e, embora seja a mais pequena das três sub-regiões com uma área de 45.000 ha, é aquela em que a vitivinicultura assume maior importância relativa e maior densidade de vinha, que corresponde a cerca de 14.501 ha. Devido à maior abundância de chuvas e aos solos geralmente mais profundos, esta apresenta grande potencialidade para a produção de vinhos DOC Douro, que a maior parte das vezes são de alta qualidade. É também, onde existem as maiores altitudes surgindo nomeadamente rochas metamórficas (Magalhães, 2008).
7 Figura 6. Mapa da Região Demarcada do Douro, onde está destacada a sub região do baixo corgo (infovini, Maio 2015)
O Cima Corgo vai desde a linha meridiana, mencionada anteriormente, até à linha que atravessa o Cachão da Valeira – S. João da Pesqueira, apresentando uma menor importância de área cultivada de vinha, em relação à região do Baixo Corgo (Filipe et al., 1998). Esta é a parte central da região Demarcada do Douro e é considerada o coração da região, devido às boas condições para a produção de uvas de melhor qualidade. Possui 95.000 ha de área geográfica, dos quais 20.915 ha são ocupados por vinha. As condições climáticas, associadas à disposição com forte pendência das encostas sobre rios e ribeiras e ao menor potencial produtivo unitário, possibilitam a elaboração dos melhores vinhos do Porto e também de vinhos de consumo DOC Douro (Quaternaire & Universidade Católica Portuguesa, 2007).
O Douro Superior segue desde o Cachão da Valeira até à fronteira com Espanha (Barca d´Alva), é a maior e mais oriental das sub-regiões. Esta é menos acidentada, quando comparada com as duas sub – regiões já citadas, pois apresenta encostas vulgarmente mais suaves e vales menos fundos (Filipe et al., 1998). Exibe uma tendência crescente devido ao seu elevado potencial, não só devido à qualidade das uvas aí produzidas, mas também porque se presta a uma maior eficácia da mecanização. Apresenta cerca de 110.000 ha de área geográfica, dos quais 10.197 ha são ocupados por vinha (Brito, 1997).
8
1.3.1. O Solo
A Região Demarcada do Douro é uma zona com características morfológicas, geológicas e climatéricas muito peculiares, que, aliadas com a ação secular do homem no solo e na vinha, tem permitido produzir uvas e vinhos de excecional qualidade.
No que respeita à geologia, o solo da Região Demarcada do Douro é predominantemente em xisto, que é uma característica muito importante para a cultura da vinha, pois confere uma melhor qualidade aos vinhos que os solos graníticos (Quaternaire e Universidade Católica Portuguesa, 2007).
1.3.2. O Clima
O clima, tipicamente mediterrânico, quente e seco no Verão, que confere características semidesérticas, propicia, no limite de cultura para a videira, a produção de bons vinhos do Porto e vinhos de consumo de alta qualidade, sobretudo tintos (Quaternaire e Universidade Católica Portuguesa, 2007; Magalhães, 2008).
As três sub-regiões durienses têm particularidades climatéricas diferentes, sendo o Baixo Corgo a região mais húmida, com um défice hídrico moderado; no Cima Corgo e no Douro Superior, o défice hídrico no Verão varia entre moderado e elevado, respetivamente (Pereira, 2000).
Dentro da região, é possível constatar três situações climatéricas relativamente distintas que face aos seus aspetos contrastantes serviram de base à criação das sub-regiões. Por sua vez, em cada sub-região surgem fatores meso climáticos associados às diferenças de altitude, exposição, declive e proximidades de cursos de água que originam microzonas com variações sensíveis, as quais, só por si, criam potencialidades distintas para a produção de vinhos generosos, vinhos espumantes e vinhos de mesa (Ribeiro, 1987).
1.4. Castas autorizadas e castas recomendadas
As castas utilizadas em Portugal para a produção de vinhos variam de acordo com as características inerentes a cada uma das regiões vitivinícolas, quer seja a nível de solo ou a nível de condições climatéricas. As castas recomendadas são aquelas que pelo seu potencial biológico e tecnológico contribuem de forma decisiva para a obtenção de vinhos de alta qualidade e marcada tipicidade desde que exploradas racionalmente e em condições ecológicas que lhes sejam propiciais (Oliveira e Pinho, 1993).
9 As castas autorizadas (tabela 1) são aquelas que pelo seu potencial biológico, tecnológico e peso de produção, são capazes de, em determinadas condições e percentagens, concorrer positivamente para a defesa económica das produções de boa qualidade sem, contudo, agredirem e muito menos mascarar a personalidade das castas recomendadas integradas no encepamento e sempre em maior percentagem (Oliveira e Pinho, 1993).
Apesar de existir um elevado número de castas autorizadas por região, o número de castas comummente utilizado é bastante inferior e varia de uma região para outra.
Tabela 1. Castas tintas autorizadas
Castas Tintas Autorizadas
Boas Regulares Medíocres Más
Mourisco de semente Alvarelhão Alicante Bouschet Aramon Sousão Casculho Alvarelhão-Ceitão Carignan Tinta Bastardinha Castelã Espadeiro Carrega Tinto Tinta Carvalha Concieira Petit Bouschet Gonçalo Pires Touriga Fêmea Jaen Tinta Aguiar Grand Noir
Lourela Tinta Mesquita Grangeal Moreto Tinta Pereira Mondet Pinot Noir Tinta Pomar Nevoeira
Baga Roseira Patorra
Cidadelhe Varejoa Português Azul
Tinta Tabuaço Preto Martinho
Engomada Santareno
Tinta Martins São-Saul
Melra Sevilhão
Tinta Penajóia Tinta Lameira
Tinto sem Nome Malandra
Tinta Fontes Valdosa Malvasia Preta
Método de Pontuação das Parcelas de Vinha, da Região Demarcada do Douro, Dezembro 2008
1.5. Castas tintas cultivadas na Região Demarcada do Douro
1.5.1. Alicante Bouschet
A casta Alicante Bouschet (figura 7) foi criada por Henry Bouschet, entre 1865 e 1885; nasceu em França, mas pode dizer-se que é uma casta portuguesa por adoção, tendo esta chegado ao Alentejo em 1900. É resultante do cruzamento entre castas Petit Bouschet e Grenache. É uma casta tintureira (http://www.inrb.pt/inia/informacao-tecnica/ampelografia/alicante-bouschet), sendo os seus cachos grandes, com formato tronco-cónico, alados e muito fechados. Os bagos da uva são negros e a sua polpa
10 encontra-se corada de vermelho, por se tratar de uma casta tintureira (http://www.alentejana.com.br/castas-int.php?c=44).
Esta casta produz vinhos de ótima qualidade, dado às condições climáticas onde está implementada, que são caraterizadas por possuírem invernos frios e verões quentes e secos; solos profundos e não muito pobres com disponibilidade de água suficiente ao longo de todo o ciclo vegetativo (http://www.alentejana.com.br/castas-int.php?c=44). Em condições ideais de maturação origina vinhos muito carregados de cor (retintos), ricos em substâncias fenólicas (encorpados) com aromas vinosos bem evidentes, lembrando compota de ameixa bem madura (http://www.inrb.pt/inia/informacao-tecnica/ampelografia/alicante-bouschet).
Figura 7. Casta Alicante Bouschet (Vinhos Portimão, Junho 2015).
1.5.2. Cabernet Sauvignon
A casta Cabernet Sauvignon (figura 8) é a casta Vitis vinífera de maior prestígio no mundo e é cultivada em todas as regiões produtoras de vinho. Muitas pessoas referem-se a ela como referem-sendo a "rainha das uvas tintas". A sua origem está associada à região de Bordeaux, e é resultado do cruzamento entre as castas: Cabernet Franc e Sauvignon Blanc (http://www.guiadovinho.com.br/leiamais.php?id=112).
Esta casta é fácil de cultivar, por se adaptar muito bem aos diferentes solos e climas, à exceção dos extremos (quente e frio). Apresenta bagos escuros e pequenos (preto e violeta profundo), com película muito grossa e pouca polpa. Tem maturação
11 tardia o que ajuda na concentração de aromas e é resistente à podridão pelo excesso de precipitação (http://www.guiadovinho.com.br/leiamais.php?id=112).
Pode dizer-se que a casta Cabernet Sauvignon apresenta aromas e sabores marcantes, e fáceis de reconhecer. Os aromas primários são: frutas vermelhas (cereja, amora, morango), frutas pretas (groselha preta, ameixa, mirtilo), especiarias (pimentas em pó, cravo), amadeirados resinosos (cedro, lápis e caixa de charuto), amadeirados queimados (tostado, defumado, café, torrefação), herbáceos (menta, hortelã). Dependendo do estilo e da região, ainda podemos encontrar: alcaçuz, anis e pimentão (http://www.guiadovinho.com.br/leiamais.php?id=112).
Figura 8. Casta Cabernet Sauvignon (IVV, Junho 2015).
1.5.3. Merlot Noir
A casta Merlot Noir (figura 9) é também uma das castas V. vinífera mais cultivadas no mundo com enorme prestígio; nem sempre foi assim, sendo que durante muito tempo era conhecida apenas como "a outra tinta de Bordeaux" (http://www.guiadovinho.com.br/leiamais.php?id=104).
A casta Merlot Noir é uma casta com alguma controvérsia, dado que não existe consenso sobre o cultivo, tempo de maturação e data ideal de vindima. Existem duas orientações distintas. A primeira, encabeçada pelo enólogo Michael Rolland, diz que a uva desta casta deve ser colhida o mais tarde possível, concentrando os açúcares e os compostos fenólicos. Já na opinião de Christian Moueix e Jean-Claude Berrouet (Petrus) a colheita tardia prejudica a acidez, super valoriza os aromas frutados deixando os vinhos
12 pesados, carnudos em detrimento da elegância, frescura e longevidade (http://www.guiadovinho.com.br/leiamais.php?id=104).
Os vinhos produzidos com a casta Merlot Noir apresentam quanto ao aspeto uma coloração vermelho-violáceo, quanto ao olfato, não apresentam aroma pronunciado típico como o que sucede com os vinhos produzidos com a casta Cabernet Sauvignon. Gustativamente, ele impressiona pelo equilíbrio e maciez (Rizzon et al.,2003).
Figura 9. Casta Merlot Noir (Wines, Junho 2015).
1.5.4. Rufete
A casta Rufete (figura 10), também conhecida por Tinta Pinheira, é essencialmente cultivada nas regiões do Douro e do Dão, sobretudo nas sub-regiões de Pinhel, Figueira de Castelo Rodrigo e Cova da Beira. É uma casta produtiva (http://www.enoteca.pt/content/rufete).
O cacho é pequeno a médio, compacto, de pedúnculo curto e muito lenhificado. O bago é de tamanho médio, com película de espessura média e apresenta uma média facilidade de destacamento. As grainhas são grandes, herbáceas e em número médio. Apresenta uma maturação média (http://www.inrb.pt/inia/informacao-tecnica/ampelografia/rufete-t).
Esta casta raramente produz vinhos de elevada qualidade, no entanto, se atingir o período de maturação ideal (sensivelmente no fim de Outubro) consegue produzir vinhos encorpados, aromáticos e capazes de permanecer muitos anos em garrafa. A casta Rufete só produz bons vinhos em microclimas específicos, como por exemplo em Pinhel, por
13 isso é utilizada, a maioria das vezes, na produção de vinhos de lote (http://www.enoteca.pt/content/rufete).
Figura 10. Casta Rufete (Vinho da ordem, Junho 2015).
1.5.5. Sousão
A origem da casta Sousão (figura 11), é inegavelmente do Minho, região onde é reconhecida pelo nome Vinhão. Mas responde igualmente pelos nomes Tinto Nacional, Negrão, Pé de Perdiz, Espadeiro Preto, Espadeiro de Basto, Tinta Antiga e Tinta de Parada. É a cor que verdadeiramente singulariza e diferencia esta casta nacional. Por natureza dá origem a vinhos escuros, opacos, fechados, quase impenetráveis à luz. Foram estas características tão peculiares que a tornaram apetecível no Douro, a segunda região de adoção desta casta tão original. Perdeu admiradores ao longo da história, mas hoje assiste-se a um revivalismo da casta, a novas plantações, a novos vinhos extremes da casta (http://www.quintadopopa.com/pt/quinta/vinha/sousao/).
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1.5.6. Pinot Noir
Para muitos, a casta Pinot Noir é a casta mais sublime e elegante que existe. A casta Pinot Noir (figura 12) é uma casta tinta, originária da França. Por ser tão antiga, a Pinot Noir originou toda uma família de uvas: Pinot Gris e Pinot Blanc. Além disso, segundo recentes estudos de genética, verificaram que 16 castas distintas têm a Pinot Noir na sua origem, dentre elas: Chardonnay, Gamay, Melon de Bourgogne (Muscadet) e Auxerrois (Malbec). O cultivo em outras partes do mundo só começou na década de 1990 [Nova Zelândia, Estados Unidos (Califórnia, Oregon) e Austrália].
A casta Pinot Noir não se adapta em qualquer região, porque é muito difícil de cultivar. Para muitos apreciadores só existe uma região que vale a pena, a Borgonha.
Apresenta cachos pequenos e de cor violeta profunda, os seus bagos também são pequenos, redondos, delicados e de película fina. Necessita de clima fresco bem equilibrado. Floresce e amadurece mais cedo. O excesso de frio produz vinhos pálidos e de sabores pobres. O excesso de calor sobre amadurece a Pinot Noir, provocando sabores e aromas excessivamente tostados e de geleias, afastando a elegância marcante (http://www.guiadovinho.com.br/leiamais.php?id=125).
Figura 12. Casta Pinot Noir (Vinho Emprosa, Junho 2015).
1.5.7. Donzelinho Tinto
Existem três Donzelinhos oficialmente reconhecidos: o branco, o roxo e o tinto (rosado). A casta Donzelinho Tinto (figura 13) é encontrado ocasionalmente em vinhas velhas mistas no Douro, onde resiste ao oídio, mas produz colheitas pobres e origina vinhos finos e pálidos (Mayson, 2005).
15 Figura 13. Casta Donzelinho Tinto (Agroportal, Junho 2015).
1.6. Compostos Fenólicos
Os compostos fenólicos são metabolitos secundários que se encontram amplamente distribuídos no reino vegetal. Ocorrem naturalmente em plantas (Anklam, 1998) nas quais a natureza e a quantidade destes compostos é variável nas diferentes partes da planta, como folhas, flores, frutos, caules e sementes (Seigler, 2000) desempenhando um papel relevante no seu desenvolvimento e multiplicação (Popa et al., 2002; Bravo, 1998).
Os polifenóis atuam na eliminação de radicais livres, proteção contra a radiação ultravioleta, agentes patogénicos e predadores (Lata, 2009). Podem também atuar como fitoalexinas, polinizadores e agentes antioxidantes (Naczk et al., 2006), contribuindo também para a coloração da planta e resistência a condições adversas.
Os polifenóis têm bastantes utilizações industriais sendo aproveitados como corantes naturais, conservantes para alimentos, produção de tintas e cosméticos (Ignat et
al., 2011).
Quimicamente, os compostos fenólicos são caraterizados por possuírem um ou mais anéis aromáticos ligados a um ou mais grupos hidroxilo (Ribéreau-Gayon, et al., 2006; Moreno-Arribas e Polo, 2009). Estas estruturas alteram de moléculas de fenóis simples a polímeros complexos de alta massa molecular (Balasundram et al., 2006).
Os compostos fenólicos podem ser classificados em duas classes: os flavonóides e os não-flavonóides (Cadenas e Packer,2002).
16
1.6.1. Flavonóides
Os flavonóides são compostos de baixo peso molecular que possuem uma estrutura geral em C6-C3-C6, sendo caraterizados pela presença de dois anéis benzénicos
(A e B) ligados através de um anel pirano (Shahidi e Naczk, 1995; Iwashina 2000). O esqueleto C15 dos flavonóides é biogeneticamente derivado do fenilpropano (C6-C3) e de
três unidades de acetato (C6) (Middleton e Kandaswarni, 1993). Estes encontram-se na
natureza sob a forma de glicosídeos, formando-se através da união de resíduos de D-glucose à posição 3 do anel C ou à posição 5 ou 7 do anel A, sendo os açúcares ligados ao anel B raros e os da primeira substituição os mais frequentes (Strack, 1997). Na figura 14 está representada a estrutura base dos flavonóides.
Figura 14. Estrutura base dos flavonóides
A estrutura base dos flavonóides pode ocorrer por duas vias: uma derivada de um núcleo de 2-fenil cromona. (Cadenas e Packer, 2002; Ribéreau-Gayon, et al., 2006; Moreno-Arribas e Polo, 2009).
O modo de ciclização, o grau de insaturação e o estado de oxidação do anel central dos flavonóides determinam os vários grupos, sendo que os que se incluem na dieta humana são essencialmente as flavonas, flavonóis, antocianidinas, antocianinas, flavanóis e flavanonas (Mabry et al., 1970; Croteau et al., 2000; Iwashina, 2000; Martínez-Flórez
et al., 2002; Yilmaz e Toledo, 2004). Na tabela 2 encontram-se representadas as estruturas
gerais das várias classes dos flavonóides.
Os flavonóides tem sido mencionados por exibirem uma ampla gama de efeitos biológicos, incluindo atividade anti-bacteriana, anti-inflamatória, antialérgica e anti
17 trombótica. Estudos epidemiológicos apontam para a possibilidade de estes prevenirem doenças cardiovasculares e cancerígenas (Gheldof et al., 2002).
18 Tabela 2. Estrutura dos flavonóides e sub-classes
Classe Estrutura geral Flavonóide Substituintes
Flavanois (+) - Catequina (-) – Epicatequina Flavonas Crisina Apigenina Rutina Luteolina Glucosideo luteolina R2,R3=OH R2,R3,R5=OH R2,R3,R4,R5=OH, R1=rutinoso R2,R3,R5,R4=OH R2,R3, R4=OH,R5=glucose Flavonois Kampferol Quercetina Miricetina Tamarixetina R,R2,R1=H R=OH, R1,R2=H R,R2,R1=OH R-OH, R1=Me, R2=H Flavanonas Naringina Naringenina Taxifolina Eriodictiol Hespiridina R1=H, R2=OH, R=ramnoglucose R,R2=OH, R1=H R,R1,R2, R3=OH R,R1,R2=OH
R1,R3=OH, R2-OMe, R=rutinoso
Isoflavonas Genistina Genisteína Daidzin Daidzeina R2=OH, R-glucose R2=OH, R=H R=glucose R=H Antocianidinas Delfinidina Cianidina Pelargonidina Peonidina Malvidina Petunidina R=R1=OH R=OH, R1=H R=R1=H R=OMe, R1=H R=R1=OMe R=OMe, R1=OH
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1.6.2. Compostos fenólicos não-flavonóides
Os compostos não-flavonóides compreendem um vasto grupo de compostos dos quais se destacam os ácidos fenólicos e os estilbenos.
Os ácidos fenólicos são divididos em duas subclasses: os ácidos benzóicos e os ácidos cinâmicos. Os ácidos benzóicos são compostos que possuem uma estrutura geral em C6-C1 (Dey et al.,1997) e incluem, entre outros os ácidos: vanílico, siringico,
p-hidroxibenzoico e gálico (Bravo, 1998). A estrutura geral está representada na tabela 3.
Tabela 3. Estrutura dos ácidos benzóicos mais abundantes nas uvas (adaptado de Gonçalves, 2007).
Os ácidos cinâmicos apresentam uma estrutura geral em C6-C3 destacando-se: ácido p-cumárico, ácido cafeico, ácido ferúlico e ácido sináptico. A sua estrutura geral encontra-se representada na tabela 4.
Tabela 4. Estrutura dos ácidos cinâmicos mais abundantes nas uvas (adaptado de Gonçalves, 2007).
Ácido cinâmico R1 R2
Ácido p-cumárico H H
Ácido cafeico OH OH
Ácido ferúlico OCH3 H
Ácido sináptico OCH3 OCH3
Os estilbenos são compostos cuja estrutura química é caraterizada por possuir dois anéis benzénicos unidos por uma cadeia de etileno, dos quais o mais abundante nas uvas é o resveratrol (figura 15). Estes são fitoalexinas produzidas naturalmente nas plantas
Ácido benzóico R1 R2
Ácido p-hidroxibenzóico H H
Ácido gálico OH OH
Ácido vanílico OCH3 H
20 como forma de proteção contra agressões externas, nomeadamente infeções microbianas e radiações UV (Sandler e Pinder, 2003).
Figura 15. Estrutura do resveratrol
1.7. Composição fenólica das uvas e do vinho
Os compostos fenólicos são agentes redutores que têm a capacidade de oferecer proteção contra o stress oxidativo; desempenham um papel muito importante na qualidade do vinho, devido ao seu contributo nas características organoléticas, particularmente na cor (como é o caso das antocianinas) e também nas sensações gustativas, devido ao seu contributo na adstringência e amargo (responsabilidade de ácidos fenólicos e flavanóis) (Ribichaud e Noble, 1990).
Os compostos fenólicos são encontrados, principalmente, nas camadas internas da película e da grainha. Na polpa as suas concentrações são muito baixas, no entanto os seus teores estão muito dependentes da casta e dos fatores ambientais (Pérez-Magariño e González-San José, 2006).
O teor de compostos fenólicos durante a maturação da uva não evolui da mesma forma que o teor de açúcares, significando assim que o máximo de concentração de compostos fenólicos não coincide com a acumulação máxima de açúcares na uva (Maujean et al., 1983). Normalmente o teor de compostos fenólicos aumenta ao longo da maturação das uvas, dependendo da família fenólica (González-San José et al., 1991; Mazza et al., 1999; Pérez-Magariño e González-San José, 2006).
Os flavonóides mais importantes no vinho são os flavonóis, que compreendem as antocianinas e os flavan-3-ois (taninos condensados ou proantocianidinas) (Moreno-Arribas e Polo, 2009). De entre os flavonóides destacam-se ainda os flavanóis cuja estrutura é idêntica aos flavonóis, diferenciando-se por não possuírem um grupo carbonilo no anel pirano (Cadenas e Packer, 2002; Ribéreau-Gayon et al., 2006; Moreno-Arribas e Polo, 2009). Os flavanóis monoméricos mais importantes no vinho são os isómeros (+)-catequina e (-)-epi(+)-catequina, que são responsáveis pelo sabor amargo. Os flavanóis
21 poliméricos, as proantocianidinas (taninos condensados) que compreendem os oligómeros e os polímeros, são de extrema importância organolética, uma vez que são responsáveis pela sensação gustativa do vinho, como por exemplo a adstringência (Moreno-Arribas e Polo, 2009).
As antocianinas representam uma parte muito importante quer quantitativa quer qualitativa dos flavonóides das uvas das castas tintas (Pirie e Mullins, 1977). Estas são os pigmentos responsáveis pela coloração vermelha e azul das películas das uvas e também do vinho tinto. Esta coloração deve-se à sua forma característica, sendo que quando a estrutura é alterada, existe alteração da cor (Moreno-Arribas e Polo, 2009). Nas uvas e nos vinhos, foram identificadas 15 antocianinas distintas, correspondentes aos monoglucósidos de cinco antocianidinas principais: delfinidina, cianidina, petunidina, peonidina e malvidina (Cadenas e Packer, 2002; Ribéreau-Gayon et al., 2006; Moreno-Arribas e Polo, 2009). As suas quantidades variam de casta para casta, sendo, em todas as castas, a malvidina a maioritária. As antocianinas ainda reagem com os taninos condensados para originar estruturas conhecidas como pigmentos poliméricos que participam na coloração do vinho (Ribéreau-Gayon et al., 2006; Moreno-Arribas e Polo, 2009).
Os compostos fenólicos não flavonóides no vinho são constituídos essencialmente por ácidos hidroxicinâmicos, ácidos benzóicos e estilbenos. Os ácidos hidroxicinâmicos constituem o maior grupo de compostos fenólicos no vinho branco, existindo no entanto em quantidades comparáveis nos vinhos tintos. Os ácidos hidroxicinâmicos encontrados nos vinhos são os ácidos cumárico, cafeico e ferúlico (Cadenas e Packer, 2002; Ribéreau-Gayon et al., 2006; Moreno-Arribas e Polo, 2009). São compostos que se oxidam muito rapidamente estando na origem do acastanhamento dos vinhos. Este provém da ação da enzima polifenoloxidase que é libertada, durante o esmagamento da uva. Este aspeto (acastanhamento) contrabalançado naturalmente na uva pela presença de glutatião que reage rapidamente com o ácido hidroxicinâmico oxidado formando um composto sem cor (Moreno-Arribas e Polo, 2009).
Os ácidos benzóicos aparecem no vinho em menores proporções relativamente aos ácidos hidroxicinâmicos. Apesar de existirem diferentes tipos de ácidos benzóicos no vinho, o mais importante é sem dúvida o ácido gálico (Cadenas e Packer, 2002; Ribéreau-Gayon et al., 2006; Moreno-Arribas e Polo, 2009).
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1.8. Atividade antioxidante
Um antioxidante é qualquer substância capaz de retardar ou impedir danos causados pela oxidação, estando presente em pequenas concentrações, quando em comparação com o agente oxidante (Maisuthisakul et al., 2007).
Os antioxidantes são substâncias que previnem ou retardam o dano oxidativo de lípidos, proteínas e ácidos nucleicos causados por espécies reativas de oxigênio, bem como radicais livres (Bayili et al., 2011). Das espécies reativas conhecidas, destacam-se os radicais superóxido, peróxido de hidrogénio, hidroxilo e o oxigénio singuleto (Tawaha, 2007) por serem os mais nocivos nos processos biológicos.
Os antioxidantes podem ser classificados em duas categorias: antioxidantes primários e secundários. Os antioxidantes primários são capazes de inibir ou retardar a oxidação por inativação de radicais livres devido à doação de átomos de hidrogénio ou de eletrões, transformando os radicais em substâncias estáveis. Os antioxidantes secundários apresentam uma grande variabilidade ao nível dos mecanismos de atuação, entre eles, a ligação de iões metálicos, a inativação de espécies reativas de oxigénio, a conversão de hidroperóxidos em espécies não radicalares ou ainda a absorção da radiação UV (Maisuthisaku et al., 2007).
Alguns dos antioxidantes são endogenamente produzidos, como é o caso de enzimas, de moléculas de baixo peso molecular ou de cofatores enzimáticos. Os tecidos humanos dispõem de um sistema antioxidante endógeno que permite alcançar uma proteção eficiente. Este sistema consiste num arranjo de diversos componentes lipossolúveis, como vitamina E e carotenóides, hidrossolúveis, como ácido ascórbico e glutatinona, e enzimáticos, como glutatinona peroxidase, superóxido dismutase e catalase (Mclean et al., 2005). Os antioxidantes exógenos são obtidos de fontes dietéticas e podem ser classificados em várias classes como polifenóis, vitaminas, carotenóides, compostos organossulfurados e minerais (Ratnam et al., 2006).
De modo a preservar o equilíbrio orgânico e a proteger a célula, destruindo e neutralizando os radicais livres, existem os antioxidantes que revelaram ter uma importância central na prevenção de estados de doenças. Entre estes antioxidantes encontram-se as vitaminas C, E, β-caroteno (pró-vitamina A) e flavonóides (Kumpulainen e Salonen, 1996). Dado que o organismo humano não consegue sintetizar antioxidantes para combater os radicais livres, o papel dos alimentos é muito importante,
23 dado que estes, em especial os frutos e os vegetais são as fontes principais de antioxidantes (Wang et al., 1996).
Os antioxidantes também são relevantes na pós-colheita uma vez que desempenham um papel fundamental na defesa natural do fruto, para protegerem as plantas de pragas e doenças e que por sua vez também são benéficos para a saúde dos seres humanos (Gara et al., 2003; Hodges et al., 2004).
O stress oxidativo, resultante da formação e ação das espécies reativas de oxigénio (ROS-Reactive Oxygen Species), está relacionado com o processo de envelhecimento celular assim como com o aparecimento de várias doenças degenerativas e inflamatórias como o cancro, doenças cardiovasculares, diabetes e doenças neuronais (Manton et
al.,2004).
O vinho é considerado um alimento funcional pois contém componentes que exercem efeitos benéficos para a saúde do consumidor desde que ingeridos em doses adequadas para o equilíbrio fisiológico. Um desses efeitos benéficos é a capacidade de neutralização de espécies químicas consideradas oxidantes, ou seja, a atividade antioxidante.
A atividade antioxidante dos compostos fenólicos deve-se principalmente às suas propriedades redutoras e estrutura química. Estas caraterísticas desempenham um papel importante na neutralização ou sequestro de radicais livres e quelação de metais de transição (Sousa, 2007). O mecanismo relativo à atividade antioxidante dos compostos fenólicos encontra-se representado na figura 16.
24 Figura 16: Mecanismo da atividade antioxidante dos compostos fenólicos.
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1.9. Objetivos do trabalho
O objetivo deste trabalho foi efetuar a caracterização fenólica e avaliar o potencial antioxidante de sete castas tintas cultivadas na Região Demarcada do Douro (Alicante Bouschet, Cabernet Sauvignon, Merlot Noir, Pinot Noir, Donzelinho Tinto, Rufete e Sousão). Esta caraterização e avaliação foi feita em dois anos de colheita, 2012 e 2013, sendo as amostras colhidas das mesmas quintas nos dois anos em análise e com o mesmo grau de maturação, tendo para tal sido avaliados numa primeira fase diversos parâmetros enológicos como por exemplo o grau Brix, álcool provável, acidez total entre outros. Numa segunda fase foram preparados extratos fenólicos das películas das uvas com o intuito de efetuar a sua caracterização fenólica e avaliar a sua atividade antioxidante.
Além dos objetivos referidos, pretendeu-se ainda com este trabalho estabelecer um paralelismo entre o conteúdo em compostos fenólicos e a atividade antioxidante, dos dois anos em estudo, tentando verificar de que forma as condições climáticas afetam estes parâmetros, nas diferentes castas em estudo.
26
Capítulo II
27
2.1. Amostragem
No presente trabalho foram usadas sete castas tintas: Alicante Bouschet e Donzelinho Tinto da quinta da Boavista; Pinot Noir e Cabernet Sauvignon da quinta Cidrô; Rufete da quinta do Bom Retiro; Merlot Noir da quinta do Ventozelo; Sousão da quinta do Seixo, as coordenadas do local de vindima encontram-se na tabela 5. Todas estas quintas são situadas na Região Demarcada do Douro, e as uvas provenientes da vindima de 2012 e 2013, foram recolhidas à maturação tecnológica.
Tabela 5. Coordenadas do local de vindima
Casta/Quinta Coordenadas do local de vindima
Alicante Bouschet – Quinta da Boavista N41º09’47.888 W7º34’38.321 Donzelinho Tinto – Quinta da Boavista N41º09’56.735
W7º34’49.273 Pinot Noir – Quinta Cidrô N41º08’39.245
W7º23’45.537 Cabernet Sauvignon – Quinta Cidrô N41º08’15.681
W7º22’41.891 Rufete – Quinta do Bom Retiro N41º09’18.839
W7º32’30.127 Merlot Noir – Quinta do Ventozelo N41º09’18.839
W7º32’30.127 Sousão – Quinta do Seixo N41º10’09.169
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2.2. Caraterização enológica das castas
2.2.1. Extração do mosto das uvas
Efetuou-se a contagem e pesagem dos bagos de cada uma das castas. Procedeu-se seguidamente ao esmagamento manual dos bagos até libertação total do mosto. Determinou-se o volume de mosto obtido em mL. Este mosto foi utilizado para a determinação do grau Brix, acidez total e pH.
2.2.2. Acidez total
A acidez total foi determinada, em g de ácido tartárico/L, pelo método proposto pelo OIV (2013), que consiste numa titulação com NaOH, tendo o azul de bromotimol como indicador do ponto final da reação. A acidez total de um mosto, é a soma de todos os ácidos tituláveis, à exceção do dióxido de carbono, com o acerto do pH a 7, por adição de uma solução alcalina tituladora.
2.2.3. pH
A concentração hidrogeniónica do meio é dada pela expressão: pH= -log10[H+]. A
determinação foi realizada por potenciometria (OIV, 2013), que se baseia na determinação da diferença de potencial entre dois elétrodos imersos no meio em análise – um (elétrodo de referência) com um potencial constante e conhecido, outro (elétrodo de medida) com o potencial determinado pelo pH do meio.
2.2.4. Grau Brix
A determinação do grau Brix realizou-se recorrendo à refractometria (OIV, 2013), utilizando-se um refratómetro de mão. O valor obtido representa a percentagem de sacarose por 100 g de solução existente no mosto.
2.2.5. Álcool provável
O álcool provável foi calculado com base no grau Brix recorrendo a tabelas apropriadas.
2.3. Extração dos compostos fenólicos das películas das uvas
Para a extração dos compostos fenólicos a partir das películas das uvas utilizaram-se 5 bagos. As películas foram pesadas e colocadas num almofariz, onde foram maceradas
29 com 10 mL de metanol acidificado. Este procedimento foi repetido 2 vezes. O extrato fenólico foi centrifugado durante 15 minutos a 3000 rotações por minuto. O líquido sobrenadante foi recuperado e guardado em balões volumétricos de 50 mL, perfazendo o mesmo com metanol acidificado, de seguida foram armazenados à temperatura de refrigeração. Todos os extratos foram preparados em triplicado (Downey et al. 2007).
2.3.1. Tonalidade
Foi medida a absorvância do extrato fenólico a 420 e a 520nm, sendo a tonalidade obtida a partir da razão entre a absorvância a 420nm e a absorvância a 520nm, de acordo com OIV (2013).
2.3.2. Intensidade corante
Foi medida a absorvância do extrato fenólico a 420, 520 e 620nm, sendo a intensidade corante obtida a partir da soma das absorvâncias a 420, 520 e 620nm, de acordo com OIV (2013).
2.3.3.Fenóis totais
Para a determinação dos fenóis totais utilizou-se o método de Folin-Ciocalteau, descrito por Barros et al. (2012). Este método consiste numa mistura dos ácidos fosfomolibídico e fosfotungstico, em meio alcalino, de coloração amarela, que na presença de agentes redutores como compostos fenólicos originam óxidos de molibdénio e tunguesténio de coloração azul. A partir da coloração azul é possível determinar o conteúdo em compostos fenólicos existentes na solução, medindo num espetrofotómetro a absorvância a 750nm.
Para a quantificação dos fenóis totais foi necessário construir uma reta de calibração onde se usou como padrões ácido gálico com as seguintes concentrações: 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 e 250 mg/L. Nos tubos de ensaio colocou-se 1 mL de ácido gálico (com as diferentes concentrações), 0,5 mL de reagente de Folin-Ciocalteau, 2 mL da solução de Carbonato de sódio (Na2CO3) e 6,5 mL de H2O destilada
seguido de homogeneização. Os tubos foram colocados num banho-maria a 70ºC durante 30 minutos, seguido de arrefecimento em água corrente e leitura da sua absorvância a 750nm.
30 Para a determinação dos fenóis totais nas amostras efetuou-se o mesmo procedimento com a diferença de que em vez de utilizar padrões de ácido gálico usou-se amostra diluída (50 vezes). Todas as análises foram efetuadas em duplicado. Por interpolação, a partir da reta de calibração calculou- se a concentração de fenóis totais em cada uma das amostras, e os resultados foram expressos em mg ácido gálico/g película.
2.3.4. Orto-difenóis
A determinação do teor em orto-difenóis foi efetuada de acordo com o método descrito por Mateos et al., (2001). Assim, para a construção da reta de calibração, foram preparadas soluções padrão de ácido gálico com diferentes concentrações (5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 e 250 mg/L). Para a construção da reta de calibração dos orto-difenóis colocou-se em tubos de ensaio 4 mL de cada padrão de ácido gálico e 1 mL de molibdato de sódio. Aguardou-se 15 minutos e leu-se a absorvância a 370nm.
No anexo 3 encontra- se a reta de calibração obtida para a determinação da concentração dos orto- difenóis.
Para a determinação dos orto-difenóis das amostras procedeu-se do mesmo modo, substituindo os padrões de ácido gálico pela amostra diluída. Esta análise foi realizada em duplicado, e os resultados foram expressos em mg ácido gálico/g película.
2.3.5.Flavonóides
A determinação do teor em flavonóides dos extratos em estudo foi efetuada de acordo com o descrito por Zhishen et al., (1999). No anexo 4 encontra- se a reta de calibração obtida para a determinação da concentração dos flavonóides.
Para a determinação dos flavonóides nas amostras procedeu-se do modo anteriormente descrito, substituindo os padrões de catequina pela amostra diluída. Esta análise foi realizada em duplicado, e os resultados foram expressos em mg catequina /g película.
31
2.3.6. Atividade antioxidante
A atividade antioxidante foi determinada pelo método TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity). Este ensaio permite a quantificação da atividade antioxidante de uma amostra através da sua capacidade em reduzir radicais catiões ABTS•+.
Ao juntar na mistura reacional persulfato de potássio a ABTS (ácido 2,2'-azino-bis (3 - etilbenzotiazolino-6-sulfónico), este último é oxidado ao catião ABTS•+, que possui uma coloração azul escuro. Ao juntar substâncias antioxidantes à mistura, o catião ABTS•+ é reduzido a ABTS, fazendo com que se dê a descoloração da solução inicial.
No presente trabalho foi utilizado um antioxidante sintético o ácido (6-hidroxi-2,5,7,8-tretametil-2-cromil) fórmico, genericamente designado por Trolox (figura 17).
Figura 17. Princípio do método da capacidade antioxidante (Fonte: Protocolo: Determinação da atividade antioxidante de vinhos e sumos de fruta)
Para a construção da reta de calibração foram adicionados a 6 tubos de ensaio 2 mL da solução de trabalho ABTS• e aos tubos de ensaios de 2 a 6 adicionou-se 200, 150, 100, 50 e 25 μL da solução de trabalho de Trolox 11mM, respetivamente. Por fim, aos tubos de ensaio 1, 3 a 6 adicionou-se 200, 50, 100, 150 e 175 μL de água, respetivamente. O tubo de ensaio 1 é o branco. Após 15 minutos de repouso leu- se a absorvância a 734nm.
No anexo 2 encontra- se a reta de calibração para os cálculos da quantificação da atividade antioxidante.
A percentagem de inibição de cada padrão foi calculada pela seguinte fórmula:
Para a quantificação da atividade antioxidante adicionou-se em 3 tubos de ensaio 2 mL da solução de trabalho de ABTS•, 200, 100 μL de amostra diluída e 100, 150 μL de
32 água para completar o volume dos tubos de ensaio que não continham 2,2 mL. Este ensaio foi realizado em duplicado. Após 15 minutos de espera leu-se a absorvância a 734nm. Por interpolação a partir da reta de calibração, foi determinada a atividade antioxidante das amostras. Os resultados foram expressos em μmol de Trolox/g de película (Ozgen et al., 2006).
2.3.7.Antocianinas totais
Para a quantificação das antocianinas totais foram preparados 2 tubos de ensaio; um dos tubos continha 1 mL da amostra concentrada, 1 mL da solução etanólica a 0,1% HCl concentrado e 10 mL da solução tampão a pH 3,5 e o outro tubo continha 1 mL da amostra diluída, 1 mL da solução etanólica 0,1% HCl concentrado e 10 mL de uma solução de HCl a 2% com pH 0,6 (Lee et al., 2005).
A concentração de antocianinas totais presentes nas amostras calculou-se através da seguinte fórmula:
2.4. Tratamento estatístico dos dados
Para analisar as diferenças estatísticas entre os resultados, efetuou-se uma análise de variância (ANOVA, uma variável), tendo sido efetuado a comparação dos valores médios pelo teste de Tuckey (p<0,05). A diferenciação das castas pelos parâmetros determinados foi efetuada com recurso à análise em componentes principais. O programa usado para o tratamento estatístico foi o Statistica versão 6.
33
Capítulo III
34
3.1. Caracterização do mosto das castas tintas
Como referido anteriormente, os mostos das castas tintas em estudo foram caracterizados ao nível do volume do mosto, pH, ºBrix, acidez total e álcool provável dos dois anos de colheita, estando os resultados apresentados na tabela 6.
As castas que apresentaram um peso maior de bagos, na vindima de 2012 foram a casta Rufete, Alicante Bouschet e Donzelinho Tinto; na vindima de 2013 foram a casta Pinot Noir e Alicante Bouschet e consequentemente foram também as que apresentaram o maior rendimento em mosto. Já as castas, Merlot Noir, Pinot Noir e Sousão foram as castas com o menor peso de bagos no ano de 2012; e em 2013 foram a Cabernet Sauvignon e a Merlot Noir; consequentemente também com o menor rendimento em mosto.
Tabela 6. Peso de bagos, volume de mosto, pH, ºBrix, acidez total e álcool provável do mosto das
castas em estudo cultivadas na Região Demarcada do Douro (vindima 2012 e 2013).
Castas Ano de colheita Peso (g de 200 bagos) Volume de mosto (mL) pH °Brix Acidez total (g/L ác.tartárico) Açúcar (g/L) Álcool provável (%v/v) Alicante Bouschet 2012 324,9 171 3,87 19,0 3,6 180,5 10,7 2013 367,0 225 4,10 21,4 2,4 207,9 12,4 Cabernet Sauvignon 2012 168,1 104 3,52 23,0 3,2 226,4 13,5 2013 181,0 105 3,34 20,8 3,8 201,1 12,0 Merlot Noir 2012 125,2 52 3,73 21,8 3,3 212,5 12,6 2013 168,5 105 4,16 26,0 1,9 261,1 15,5 Donzelinho Tinto 2012 278,0 171 3,48 22,8 4,5 224,1 13,3 2013 292,9 175 3,48 22,0 3,6 214,8 12,8 Pinot Noir 2012 153,9 95 3,44 18,2 5,3 171,5 10,2 2013 379,0 200 3,25 21,2 4,7 205,7 12,2 Rufete 2012 487,1 266 4,08 25,8 2,9 259,1 15,4 2013 293,3 175 4,25 17,0 1,7 158,1 9,4 Sousão 2012 182,4 85 3,36 22,0 5,2 214,8 12,8 2013 232,3 135 3,71 24,0 3,2 238,2 14,2
35 O pH do mosto apresentou valores distintos entre as diferentes castas em estudo como se pode verificar pela tabela 5, variando de 3,25 a 4,25 para o mosto da casta Pinot Noir (2013) e Rufete (2013), respetivamente. No ano de colheita de 2013 o mosto das castas Alicante Bouschet, Merlot Noir, Rufete e Sousão apresentaram valores superiores ao ano de vindima de 2012, por sua vez o mosto das castas Cabernet Sauvignon e Pinot Noir apresentaram valores inferiores. O mosto da casta Donzelinho Tinto foi o único que manteve o mesmo valor de pH, nas duas vindimas. Segundo Costa et al., (2013) os valores de pH dos mostos das castas Alicante Bouschet, Cabernet Sauvignon, Pinot Noir e Merlot Noir são iguais e de 2,9; os resultados obtidos de pH neste estudo foram de 3,87; 3,52; 3,44; 3,73 no ano de colheita de 2012 e em 2013 apresentou os valores de pH de 4,10; 3,34; 3,25; 4,16. Podemos dizer que os valores de pH são superiores aos verificados na literatura, mas esta diferença de pH observada poderá estar relacionada com o ano de vindima bem como com as condições climáticas dos locais de proveniência das uvas.
Relativamente ao ºBrix dos mostos, os valores oscilaram entre 17,0 e 25,8 ºBrix referentes à casta Rufete, do ano de 2013 e 2012, respetivamente (Tabela 5). Nos mostos das castas Alicante Bouschet, Cabernet Sauvignon, Pinot Noir e Merlot Noir os valores de ºBrix determinados foram de, 19,0; 23,0; 18,2; 21,8 ºBrix na vindima de 2012 e de 21,4; 20,8; 21,2; 26,0 ºBrix na vindima de 2013, respetivamente. Costa et al., (2013) estudou as mesmas castas e obteve valores de ºBrix nos mostos de 26,8; 25,9; 20,4; 24,4; respetivamente. Como se pode constatar para a mesma casta há situações em que o valor do ºBrix do mosto da vindima de 2011 é superior, mas também há casos em que o valor do ºBrix do mosto quantificado na vindima de 2013 apresenta um valor mais elevados. Por isso, não há uma tendência no grau ºBrix com o ano de vindima, o que prossupõe que outros fatores influenciaram a síntese dos açúcares como por exemplo a localização e a exposição da vinha entre outros. Os teores em açúcares totais dos mostos oscilaram entre 171,5 g/L e 259,1 g/L que correspondem respetivamente aos mostos das castas Pinot Noir e Rufete da vindima de 2012. Relativamente ao ano de colheita de 2013 os valores dos açúcares dos mostos oscilaram, entre 158,1 g/L e 261,1 g/L das castas Rufete e Merlot Noir, respetivamente. Como seria de esperar no ano de 2012 o mosto da casta Rufete é a que apresenta o valor mais elevado de álcool provável 15,4 % (v/v), e o mosto da casta Pinot Noir o valor mais baixo 10,2 % (v/v); já em 2013, por sua vez é o mosto da casta Rufete o que apresenta o valor mais baixo de álcool provável 9,4 % (v/v) e o da casta Merlot Noir o valor mais elevado 15,5 % (v/v). De acordo com o trabalho publicado por Costa et al., (2013) os mostos das castas Cabernet Sauvignon, Pinot Noir e Merlot Noir
36 apresentaram teores de álcool provável de 15,5% (v/v), 11,7% (v/v) e 14,4% (v/v), respetivamente, sendo estes valores superiores aos obtidos na vindima de 2012; por outro lado, em 2013 o mosto da casta Cabernet Sauvignon apresentou valores inferiores aos publicados (Costa et al.,2013), mas o mosto das castas Pinot Noir e Merlot Noir apresentou valores superiores. Contudo, podemos constatar que o mosto da casta Cabernet Sauvignon (2012) foi a que apresentou os valores mais elevados em ambos os estudos e o mosto da casta Pinot Noir (2012) os valores mais baixos (15,5 % (v/v) e 13,5 % (v/v) e de 11,7 % (v/v) e 10,2 % (v/v); respetivamente).
O mosto da casta Sousão foi o que apresentou o valor mais elevado de acidez total 5,2 g/L ácido tartárico, e o mosto da casta Rufete o valor mais baixo com 2,9 g/L ácido tartárico na vindima de 2012 (Tabela 6). Em 2013 o mosto da casta Rufete continua a ser o que apresentou o valor mais baixo de acidez total com 1,7 g/L ácido tartárico e o mosto da casta Pinot Noir o que apresentou o valor mais alto com 4,7 g/L ácido tartárico. De acordo com Costa et al. (2013) o valor de acidez total mais elevado, entre os mostos das castas Alicante Bouschet, Cabernet Sauvignon, Pinot Noir e Merlot Noir, foi de 6,7 g/L ácido tartárico, para o mosto da casta Pinot Noir, por outro lado o mosto das castas que exibiram o valor mais baixo foram a Alicante Bouschet e Merlot Noir com 6,0 g/L ácido tartárico.
3.2. Antocianinas totais, tonalidade e intensidade corante
Os valores obtidos de antocianinas totais no extrato fenólico das películas oscilaram entre 846,63 mg/L e 2537,21 mg/L, para a casta Donzelinho Tinto e Merlot Noir da vindima de 2012, respetivamente (Tabela 7). Na vindima de 2013, a casta Donzelinho Tinto foi novamente a casta que apresentou valores mais baixos de antocianinas totais com 1131,19 mg/L e a casta Cabernet Sauvignon os valores mais elevados com 2057,77 mg/L.
Relativamente à tonalidade corante do extrato fenólico das películas das uvas da colheita de 2012 oscilaram entre 0,603 e 0,622 unidades abs nas castas em estudo (Tabela 7). Estes valores estão de acordo com o trabalho efetuado por Costa et al., (2013), que refere valores de 0,61; 0,60; 0,62 e 0,50 unidades abs para as castas Alicante Bouschet, Cabernet Sauvignon, Pinot Noir e Merlot Noir, respetivamente. Já na vindima de 2013 os valores determinados foram mais elevados, quer em relação ao ano de 2012, quer dos
37 valores publicados, variando entre 0,70 e 0,83 unidades de abs, para a casta Pinot Noir e Donzelinho Tinto/ Cabernet Sauvignon, respetivamente.
Tabela 7. Antocianinas totais, tonalidade e intensidade corante dos extratos das películas das
sete castas em estudo da vindima de 2012 e 2013.
Castas Ano de colheita Antocianinas
totais (mg/L) Tonalidade (unidades abs) Intensidade (unidades abs) Alicante Bouschet 2012 1534,27±4,41 e 0,622±0,002 b 52,60±0,06 d 2013 1626,72±48,56 b 0,810±0,010 c 74,36±0,93 c Cabernet Sauvignon 2012 1153,66±13,84 c 0,614±0,002 ab 49,24±0,19 ab 2013 2057,77±9,83 b 0,830±0,005 c 69,39±0,25 b Merlot Noir 2012 2537,21±7,05 b 0,612±0,005 ab 49,07±0,13 ab 2013 1563,34±49,29 b 0,820±0,006 c 68,19±0,65 b Donzelinho Tinto 2012 846,63±9,12 a 0,613±0,013 b 49,68±0,19 b 2013 1131,19±35,10 a 0,830±0,008 c 68,64±0,52 b Pinot Noir 2012 1399,40±7,87 c 0,603±0,008 a 48,79±0,21 a 2013 1973,78±13,19 b 0,700±0,050 a 63,01±1,94 a Rufete 2012 1011,22±9,01 c 0,615±0,003 ab 50,63±0,03 c 2013 1192,80±18,75 a 0,760±0,010 b 65,88±0,88 b Sousão 2012 1411,22±4,28 d 0,616±0,003 ab 54,22±0,23 e 2013 1528,33±9,75 b 0,780±0,007 b 76,69±0,62 c
*Valores com a mesma letra não são significativamente diferentes (p <0,05) para cada parâmetro avaliado (teste Tuckey).
Segundo Costa et al., (2013), e para as castas Alicante Bouschet, Cabernet Sauvignon, Pinot Noir e Merlot Noir, os valores relativos à intensidade situam-se entre 13,72 unidades abs e 21,03 unidades abs. Os resultados obtidos no presente trabalho são bastante superiores, como pode ser observado na tabela 7. Contudo, as diferenças observadas na intensidade corante podem estar relacionadas com o facto de Costa et al. (2013) ter usado um método de extração dos compostos fenólicos diferente do usado no presente trabalho.
