Extrato inicial).

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Terminados os ensaios de ELISA, retirou-se uma alíquota da primeira fração do passo de eluição, para testar por eletroforese em SDS-PAGE e analisar a presença do antigénio rsm. Os resultados representam-se na FIGURA 3. 5. A partir da análise do gel SDS-PAGE foi possível inferir a presença do antigénio rsm de 16,7kDa, em todas as amostras purificadas pelos diferentes tampões, permitindo comparar a intensidade das bandas proteicas geradas e a eficiência dos tampões na purificação. Através da FIGURA 3. 5, concluiu-se que os tampões MES pH 6,0 e pH 6,5 – devido às baixas bandas proteicas geradas -, bem como bicarbonato de sódio pH 8,5, não são ideais para a purificação de uma elevada quantidade de antigénio, no entanto, os tampões HEPES pH 7,5 e pH 8,0, Tris-HCl pH 8,0 e 8,5 permitem purificar a maior quantidade de antigénio rsm (através da comparação da densidade da banda do antigénio purificado), e, por isso, serão testados nos próximos ensaios. Apesar da fração purificada com o tampão fosfato de sódio pH 7,4 proporcionar uma quantidade equivalente de antigénio rsm purificado, apresenta uma maior quantidade de proteína contaminante tendo sido por isso descartado como tampão ideal para a purificação do antigénio.

3.3.2 | 2º Ensaio: Presença e ausência de glicerol

O segundo ensaio foi efetuado com o intuito de aumentar a solubilidade da proteína em estudo, de forma a obter um antigénio purificado numa forma mais estável em solução. Sujeitaram-se 8 amostras ao processo descrito na totalidade no Anexo 7.2 (pág. 62), com os respetivos tampões de lavagem, ligação e eluição. A utilização de glicerol (5%) na constituição dos tampões de eluição teve como finalidade o aumento da solubilidade do antigénio rsm. Os tampões com diferentes valores de pH, utilizados e testados ao longo deste ensaio foram os considerados os mais eficientes no ensaio anterior ou seja, HEPES pH 7,5/pH 8,0, Tris-HCl pH 8,0/pH 8,5. As frações de 1mL obtidas em cada purificação foram avaliadas por ELISA (FIGURA 3. 6).

FIGURA 3. 6 | Purificação por IMAC. A. Presença e B. Ausência de glicerol. Representação dos resultados obtidos por ELISA indireta (405nm) e resultante da análise dos produtos da purificação.

De acordo com a FIGURA 3. 6, observam-se, na ausência de glicerol, espectros semelhantes aos observados nos ensaios anteriores e considerados como ideais no que toca a purificação com IMAC,

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com o aumento dos valores medidos a 405nm após aplicação de tampão de eluição (com maiores valores na última fração da ligação e primeira fração de eluição), demonstrando a presença do antigénio rsm. No entanto, na presença de glicerol, não se observam estas distinções, indicativo de que não ocorreu ligação e posterior eluição da amostra. De modo a observar a presença do antigénio rsm, efetuou-se eletroforese em gel de SDS-PAGE a 15%. Os resultados encontram-se representados na FIGURA3.7. É possível observar a 1ª fração da lavagem, a 1ª fração da ligação e a 1ª fração de eluição. Através dos géis, confirmou-se a presença da banda de 16,7kDa, referente ao antigénio em estudo, e a banda de peso molecular de 38kDa, referente à proteína contaminante, sendo ambas mais notórias nos géis representativos de purificação com tampão de eluição sem glicerol na sua constituição, e coerentes com o aumento dos valores obtidos nos ensaios ELISA (FIGURA 3. 6).

Também é possível constatar a ausência da proteína nas frações de lavagem e ligação testadas, comprovando o funcionamento correto da purificação. Concluiu-se que o glicerol nos tampões de eluição não promove uma condição favorável à purificação do antigénio rsm. Quando comparadas as intensidades das bandas referentes ao antigénio rsm purificado com tampões sem glicerol (FIGURA3. 7C e D) constatou-se a presença de bandas mais intensas para as amostras purificadas com Tris-HCl pH 8,0, relativamente às restantes.

3.3.3 | 3º e 4º Ensaio: Alteração do tampão de lavagem e de ligação

Para os presentes ensaios, sujeitou-se seis amostras (2mL) ao processo de purificação, descrito no Anexo 7.2 (pág. 62). Este ensaio teve como intuito o teste de diferentes tampões de lavagem e ligação, de forma a compreender quais proporcionam uma melhor eliminação de proteínas com

FIGURA 3. 7 | Gel em SDS-PAGE a 15%. Purificação com 5% glicerol. A/B. M. Marcador de pesos moleculares; Fração de: 1. Lavagem, 2. Ligação, 3. Eluição; E. Extrato inicial. Purificação sem glicerol.

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ligações inespecíficas à resina e, por conseguinte, uma melhor purificação do antigénio em estudo. Com este ensaio pretendeu-se também eliminar a proteína contaminante de peso molecular 38 kDa, e presente regularmente nos géis. Foram testados os tampões de eluição mais eficientes: Tris-HCl pH 8,0 e HEPES pH 7,5; e quatro tampões de lavagem e ligação: Bicarbonato de sódio pH 8,5; Fosfato de sódio pH 7,4; Tris-HCl pH 8,0 ou HEPES pH 7,5. Após a purificação das amostras com as respetivas combinações, as frações de 1mL obtidas foram avaliadas por ELISA indireta e por eletroforese em gel de SDS-PAGE. Os resultados representam-se no Anexo 7.7 (pág. 69), onde se observou variações na medição da absorvância (405nm), mantendo o aumento dos valores de absorvância para as frações referentes à lavagem da coluna com o tampão de eluição, revelando a eluição do antigénio rsm. Quanto aos resultados obtidos através de eletroforese, verificou-se a presença de duas bandas proteicas: uma banda de maior intensidade com 16,7kDa – referente ao antigénio rsm - e outra banda, de menor intensidade, com 38kDa – referente à proteína contaminante, até ao momento, de origem desconhecida. Com base nos resultados, foi possível concluir que as melhores combinações de tampões testadas são Tris-HCl pH 8,0 e HEPES pH 7,5, como tampão de lavagem, ligação e eluição.

3.3.4 | 5º Ensaio: HEPES pH 7,5 / Tris-HCl pH 8,0

No penúltimo ensaio, descrito no Anexo 7.2 (pág. 62), purificou-se duas amostras de 2mL através de uma resina IMAC em coluna HiTrap (GE Healthcare) com iões Cu2+ imobilizados. Este ensaio teve como intuito observar as diferenças entre os tampões considerados como ideais até ao momento (HEPES pH 7,5/Tris-HCl pH 8,0). Após a purificação das amostras, as respetivas frações de 1mL foram submetidas ao método de ELISA indireto, e, de seguida, a fração de eluição em que se obteve maiores valores de absorvância a 405nm foi avaliada por eletroforese em gel de SDS-PAGE.

FIGURA 3. 8 | Purificação por IMAC: HEPES pH 7,5 e Tris-HCl pH 8,0. A. Representação dos resultados obtidos por ELISA indireta (405nm) através da análise dos produtos da purificação por IMAC.