Fases da embriogênese somática

De modo geral, protocolos de embriogênese somática de palmeiras envolvem as seguintes fases: indução, diferenciação, maturação, germinação/conversão e aclimatização. Vale salientar, que nem todos os protocolos de embriogênese somática em palmeiras fazem diferenciação entre as etapas, determinando tratamentos diferentes para cada uma delas. Inclusive, há na literatura confusão com relação aos termos utilizados para nomeá-las, muito por conta do assincronismo típico do processo de embriogênese somática.

Os calos contendo células embriogênicas consequentes da fase de indução, mediada por reguladores de crescimento e/ou diferentes estresses, geralmente, proliferam e formam massas proembriogênicas (HALPERIN, 1966; VON ARNOLD et

al., 2002; YANG; ZAHNG, 2010). Essas massas são caracterizadas, normalmente, pelo

isolamento físico ou fisiológico de seus arredores imediatos devido ao espessamento da parede celular (calose) (DUBOIS et al., 1990) e da ausência ou redução do número de plasmodesmas (VERDEIL et al., 2001). Segundo Verdeil et al. (2001), esse isolamento físico pode facilitar a reprogramação das funções genômicas e celulares necessárias à aquisição de totipotência e competência embriogênica. Vale mencionar que o isolamento celular não é regra em sistemas embriogênicos in vitro.

Essas massas embriogênicas podem ser subcultivadas em meios com níveis reduzidos de reguladores de crescimento (BOTTI; VASIL, 1984; GOH et al., 2001; QUIROZ-FIGUEROA et al., 2006; REE; GUERRA, 2015) ou desprovidos deles (VRIES et al., 1988; KAWAHARA; KOMAMINE, 1995; REE; GUERRA, 2015; QUIROZ-FIGUEROA et al., 2006). A redução ou remoção de reguladores inibe a proliferação e promove um gradiente polar de auxina (JIMÉNEZ, 2001, 2005), estimulando a formação de embriões somáticos e o seu desenvolvimento inicial (KAWAHARA; KOMAMINE, 1995; VON ARNOLD et al., 2002; SU et al., 2009). Além do mais, a consequência da remoção da auxina do meio tem sido associada a eventos epigenéticos, como hipometilação de DNA, o que permite o posterior

37 desenvolvimento do embrião (MUNKSGAARD, MATTSSON; OKKELS, 1995). Fehér (2006) hipotetiza que a determinação embriogênica é alcançada na presença da auxina exógena, todavia, a sua presença contínua bloqueia o desenvimento posterior do embrião somático, ou seja, a determinação para a via da embriogênese somática ocorre antes da remoção do regulador de crescimento do meio de cultivo.

Essa abordagem, redução ou remoção do regulador de crescimento, é definida por alguns autores como a fase de diferenciação de embriões somáticos, e tem sido usada com sucesso em B. gasipaes (STEINMACHER; CLEMENT; GUERRA, 2007),

E. guineensis (BALZON; LUIS; SCHERWINSKI-PEREIRA, 2013; JAYANTHI et al.,

2015) e A. aculeata (LUIS; SCHERWINSKI-PEREIRA, 2014).

Uma vez diferenciados, os embriões somáticos passam então por um processo

de amadurecimento, caracterizado comumente, por mudanças bioquímicas e morfológicas (VON ARNOLD et al., 2002). Essa fase de maturação, marcada pela expansão rápida dos cotilédones e síntese e acúmulo de compostos de reserva, é considerada crucial para a conversão bem-sucedida dos embriões somáticos em plântulas (MISHRA; SANYAL; AMLA, 2012).

Assim, um processo insuficiente de maturação, caracterizado geralmente, por uma germinação precoce, acarreta no desenvolvimento de plântulas pouco desenvolvidas (JIMÉNEZ, 2005). Para contornar essa problemática corriqueira em embriões somáticos de diferentes famílias de plantas, se tem adotado a suplementação de meios com reguladores de crescimento, como ABA (VON ARNOLD et al., 2002; JIMÉNEZ, 2005; OTHMANI et al., 2009; RAI et al., 2011; FRAGA et al., 2016b), embora essa não seja uma prática comum em palmeiras (REE; GUERRA, 2015).

Salienta-se ainda que o acúmulo de substâncias de reserva é uma fase típica do desenvolvimento embrionário, portando-se como um excelente marcador da qualidade e fidelidade da embriogênese somática (MERKLE; PARROTT; FLINN, 1995). Entretanto, embriões somáticos de muitas espécies de palmeiras apresentam produção deficitária de alguns desses compostos de reserva, como proteínas (SANÉ et al., 2006; ABERLENC-BERTOSSI et al., 2008; SGHAIER et al., 2008; MOURA; VENTRELLA; MOTOIKE, 2010). Essa produção anormal de proteínas, segundo Merkle, Parrott e Flinn (1995), é consequência dos tipos de estratégias para maturação utilizadas durante o desenvolvimento do embrião somático e não um problema inerente à embriogênese somática. Essa questão levanta a necessidade de otimização de

38 metodologias para maturação em palmeiras, as quais permanecem ainda pouco estudadas (REE; GUERRA, 2015).

As etapas posteriores à maturação consistem na germinação, definida como o desenvolvimento do sistema radicular e/ou parte aérea (MERKLE; PARROTT; FLINN, 1995); conversão, conceituada como o desenvolvimento de plântulas a partir de embriões somáticos germinados (VENKATACHALAM et al., 2003) e aclimatização, caracterizada como a transição das plantas das condições in vitro para ex vitro (BADR; ANGERS; DESJARDINS, 2015). Conforme Maruyama e Hosoi (2016) e Guan et al. (2016), a maturação de quantidades consideráveis de embriões somáticos e a eficiência da sua conversão se configuram como fatores limitantes para o uso da técnica em muitas espécies.

Durante as fases de germinação e conversão, há relatos tanto da utilização de reguladores de crescimento, como ácido 3-indolacético (AIA), ácido indolbutírico (AIB), ácido 1-naftalenoacético (ANA), ácido giberélico (AG3), 6-benzilaminopurina (BAP), quanto da ausência deles em diferentes espécies de palmeiras. Em E. guineensis, por exemplo, Jayanthi et al. (2015) e Gomes, Bartos e Scherwinski-Pereira (2015) relataram o uso de reguladores para fins de enraizamento. A formação de raízes é considerada um aspecto primordial ao processo de conversão, já que supre as necessidades hídricas e nutricionais das plantas após a transferência para condições ex

vitro (REE; GUERRA, 2015). Já Perera et al. (2009) consideraram a adição de AG3 um passo crucial para a regeneração de C. nucifera, semelhante ao relatado por Freitas et al. (2016) que adicionaram além de AG3, BAP durante a regeneração de E. oleracea. Por outro lado, reguladores de crescimento não foram necessários em E. oleracea (SCHERWINSKI-PEREIRA et al., 2012) e A. aculeata (LUIS; SCHERWINSKI- PEREIRA, 2014).

As plantas transplantadas para condições ex vitro devem resistir progressivamente ao aumento da luminosidade (fluxo de fótons), à umidade relativa inferior, variação de temperatura e estresses bióticos típicos da nova condição (FKI et

al., 2011a). Para tal, diferentes procedimentos têm sido adotados para incrementar a

sobrevivência e crescimento de plantas regeneradas a partir de embriões somáticos. Steinmacher, Clement e Guerra (2007), por exemplo, mantiveram plantas de B.

gasipaes dentro de uma caixa de plástico coberta com vidro para permitir a entrada de

luz e reduzir a desidratação. Luis e Scherwinski-Pereira (2014) aclimatizaram plantas de

39 aumento gradativo na abertura desses, até que as plantas estivessem totalmente aclimatizadas às condições ambientais. Vale salientar, todavia, que por mais precisas e cautelosas sejam as abordagens de aclimatização, de acordo com Von Arnold et al. (2002), o sucesso da sobrevivência e crescimento de plantas regeneradas depende das condições fornecidas nas fases anteriores in vitro.

Ressalta-se que plantas regeneradas a partir de embriões somáticos podem apresentar variação somaclonal, provavelmente, devido à mudanças epigenéticas (DE- LA-PEÑA et al., 2015; KUMAR; STADEN, 2017) que levam à formação de genótipos com características novas, desejáveis ou não. Um fenótipo indesejável, conhecido como fenótipo mantled, caracterizado pelo desenvolvimento anormal de flores, tem sido relatado em baixas percentagens em plantas regeneradas de E. guineensis, o que tem sido atribuído por alguns autores ao processo de metilação de DNA (JALIGOT et al., 2000; JALIGOT; BEULÉ; RIVAL, 2002; SHEARMAN et al., 2013; ONG- ABDULLAH et al., 2015). Anormalidades em plantas regeneradas a partir de embriões somáticos também têm sido mencionadas em P. dactylifera (AL-MAZROUI; ZAID; BOUHOUCHE, 2007; BOUHOUCHE; AL-MAZROU; ZAID, 2007). Dentre essas anormalidades citam-se infertilidade de flores femininas e nanismo (FERRY, 2011).