específicas sofreram uma redução significativa. No começo da fermentação predominam transformações produtoras de energia com formação de biomassa, sendo que o antibiótico é formado quando o metabolismo oxidativo se encontra atenuado. Não existe uma associação clara entre as referidas velocidades que permita estabelecer alguma relação cinética definida. O produto formado é denominado como metabólito secundário. As toxinas microbianas também pertencem a este grupo.
Figura - Variação de velocidades específicas em uma fermentação penicilínica.
Curva 1 – produção de antibiótico; curva 2 – consumo de açúcar; curva 3 – consumo de oxigênio; curva 4 – crescimento de microrganismo
4.4 FASES DA FERMENTAÇÃO
A fermentação alcoólica é feita em três fases, são elas: 1) Fermentação inicial ou pré- fermentação; 2) Fermentação principal ou tumultuosa e 3) Fermentação final, lenta ou pós- fermentação.
4.4.1 Fermentação inicial
Como o mosto definitivo, mesmo sem ter sido aerado, ainda contém uma determinada quantidade de ar, as leveduras começam inicialmente a se multiplicar. Esta multiplicação caracteriza a fermentação inicial, na qual observa-se somente o crescimento de colônias de leveduras. O consumo de açúcar nesta fase é considerável e a produção de etanol é muito pequena.
O aumento de temperatura nesta fase é muito pouco notado e não há a formação de bolhas que caracteriza o desprendimento de gás carbônico. O processo é conduzido por um período de 4 a 6 horas.
4.4.2 Fermentação principal ou tumultuosa
Inicia-se no momento em que termina o ar do mosto, caracterizando-se pela paralisação da produção das leveduras que passam a elaborar a enzima, que ataca os açúcares transformando-os em álcool e gás carbônico.
Com desprendimento do gás carbônico haverá a formação de bolhas arredondadas e uniformes no mosto que parece entrar em um processo semelhante ao da ebulição. Observa-se ainda, um aroma característico, semelhante ao de maças maduras.
A atividade bioquímica intensa nessa fase causa um desprendimento intenso de calor que deve ser removido. Essa remoção é feita pela troca de calor através de serpentinas, resfriadores de placas ou trocadores de caor tubulares.
Haverá nesta fase um aumento acentuado da temperatura e haverá normalmente uma queda do grau Brix e um aumento do grau alcoólico do mosto. O período dessa etapa de fermentação é de 12 a 16 horas.
4.4.3 Fermentação final
Nesta etapa verifica-se a diminuição da temperatura do vinho, elevação da acidez, desaparecimento da espuma e a diminuição da viabilidade das células de levedura pela ação do acúmulo de seus metabólitos, do esgotamento dos carboidratos e das toxinas dos contaminantes.
A fase final encerra-se quando há uma paralisação total do desprendimento de CO2, o
desaparecimento das bolhas e a volta à temperatura ambiente. A quantidade de álcool atinge de 7 a 10% do volume total.
4.5 OUTROS TIPOS DE FERMENTAÇÃO 4.5.1 Fermentação láctica
Fermentação láctica é o processo metabólico no quais carboidratos e composto relacionados são parcialmente oxidados, resultando em liberação de energia e compostos orgânicos, principalmente ácido láctico, sem qualquer aceptor de elétrons externo. É realizado por um grupo de microrganismos denominado de bactérias ácido-lácticas, as quais têm importante papel na produção conservação de produtos alimentares. Pode ser classificada em dois tipos, de acordo com a quantidade de produtos orgânicos formados: homolática e heteroláctica.
O ácido lático pode ser produzido através da fermentação de bactérias como as bactérias homofermentativos (Lactobacillus Del brueckii, L. bulgaricus, L. pentosus, L.casei,L. leichmannii, Streptococcus lactis), de fungos como leveduras e ficomicetos, e também de algumas algas. Ele
também pode ser produzido de forma sintética, através da hidrólise da lactonitrila (LIMA et al, 2001).
Ele pode apresentar duas formas esterioquímicas, devido ao carbono quiral presente. Durante. A fermentação ocorre em temperaturas relativamente altas e dependerá do microrganismo utilizado. Lactobacillus Del brueckii cresce bem à temperatura de 45ºC; L. bulgaricus, pode ser incubado em 45-50ºC; já L. pentosus, L. casei, e Strepto coccus lactis podem ser cultivados em 30ºC (PRESCOTT et al, 1959).
E são bastante utilizados na indústria de alimentos como acidulante e conservante de refrigerantes, geléias, xaropes e sucos de frutas (LIMA et al, 2001).
O ácido lático (ácido 2- hidroxipropanóico) de fórmula (CH3CH(OH)COOH) é um líquido viscoso, higroscópico, inodoro, de sabor azedo, ponto de fusão 18°C e ponto de ebulição 122°C. Pode ser sintetizado quimicamente ou pela via biológica, pelas bactérias láticas, ou então nos tecidos musculares em atividade, quando o oxigênio é limitado (DAINTITH, 1996).
Para Pasteur, o ácido lático foi um dos primeiros problemas microbiológicos. O primeiro a isolar os microrganismos, como cultura pura, foi Lister, em 1877, e a cepa isolada foi de Streptococcus lactis. Nesta época, Delbruek verificou que temperaturas relativamente altas eram favoráveis à produção do ácido (LIMA et al, 1975).
A produção industrial do ácido lático passou a ter maior importância após 1881. Atualmente, é produzido, principalmente, a partir de glicose de milho, melaços e soro de queijos. O ácido lático, obtido por fermentação, normalmente é sob forma racêmica, existindo, no entanto Lactobacillus que produzem formas opticamente ativas (LIMA et al, 1975).
O grupo das bactérias ácido-lácticas é composto por doze gêneros de bactérias grampositivas: Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus e Weissella. Todos os membros desse grupo apresentam a mesma característica de produzir ácido láctico a partir de hexoses. Os Enterococcus e os Lactobacillus não pertencem mais ao gênero Streptococcus, o microrganismo deste último gênero mais importante em alimento é o S. thermophilus. O S. diacetilactis foi reclassificado como uma linhagem de Lactococcus, subespécie lactis que utiliza citrato (LIMA et al, 1975).
Requerimentos Nutricionais
Estes organismos possuem requerimentos complexos de fatores de crescimento requer vitaminas do complexo B, um considerável número de aminoácidos e bases purínicas e pirimidínicas. Como resultado desses requerimentos, as bactérias láticas são normalmente cultivadas em meios contendo peptona, extrato de levedura ou outros materiais vegetais ou animais digeridos. Estes devem ser suplementados com um carboidrato fermentável para prover uma fonte de energia.
Mosto
Obtém-se o ácido lático a partir de diversas matérias-primas, subprodutos ou resíduos da indústria alimentícia, como soro do queijo, melaço, glicose de milho.Empregam-se, também, resíduos de elevada DBO (demanda bioquímica de oxigênio), como os das indústrias de papel e polpa de celulose, aglomerados ("fiberboard") que contém polímeros de açúcar. Os substratos utilizados são principalmente a glicose, lactose e sacarose. Porém, substratos amiláceos como de milho, batata e mandioca podem ser empregados, desde que pré-hidrolisados enzimaticamente. A concentração em açúcares do mosto é ajustada na faixa de 5 a 20% de acordo com o microrganismo, a matéria-prima e o processo empregado.
pH
O pH, para propiciar elevado rendimento, deve-se situar nas proximidades da neutralidade ou na faixa levemente ácida. Deve-se evitar que o pH se torne francamente ácido com a adição de neutralizantes como carbonato de cálcio ou hidróxido de cálcio, amônio, carbonato de amônio ou mistura de sódio, potássio e carbonato de amônio. É importante manter o pH constante, pois conforme a acidez aumenta, ocorre uma inibição da fermentação.
Fatores de crescimento
- As bactérias láticas são reconhecidamente exigentes para certos fatores de crescimento. - A riboflavina é uma vitamina necessária ao bom desenvolvimento da fermentação lática. - O ácido pantatênico é essencial para algumas espécies láticas.
- O ácido nicotínico estimula o crescimento e a produção de ácido de alguns gêneros.
- Algumas espécies exigem várias substâncias como, por exemplo, o L. pentosus, que necessita dos ácidos pantatênico, nicotínico e da biotina.
Bactérias homo fermentativas
São muito importantes e tem grande interesse na fabricação do ácido lático. Os primeiros estágios da via metabólica da fermentação lática são os mesmos da fermentação alcoólica, ou mais especificamente a via de Embden-Meyerhof ou via glicolítica. O intermediário importante para a formação do ácido lático é o ácido pirúvico. No final da via glicolítica, o ácido pirúvico, sob a ação da enzima lactato desidrogenase dá origem ao ácido lático (LIMA et al, 1975).
Bactérias heterofermentativas
A fermentação da glicose por essas bactérias resultam em vários produtos, enquanto as bactérias homo fermentativas degradam a glicose através da via glicolítica, às heterofermentativas degradam a glicose através da via oxidativa das pentoses fosfato. Os compostos intermediários importantes na via heterofermentativa são o ácido pirúvico e o aldeído acético. O rendimento líquido em ATP: 2 moles / mol de glicose pela via homo fermentativa e apenas 1 mol / mol de glicose pela via heterofermentativa (LIMA et al, 1975).
Fases da Fermentação Láctica
A fermentação láctica, tal como a alcoólica, realiza-se em duas fases: Primeira fase: Glicólise
glicose é fosforilada e clivada para gerar duas moléculas de triose fosfato. Este processo consome dois ATPs, (Quando ocorre a clivagem da molécula de glicose, a energia não é simplesmente liberada para o meio, a energia é transferida para outras moléculas chamadas de ATP - Adenosina Trifosfato), que servirão de reservatórios temporários de energia, como umaforma de investimento energético.
No segundo estágio, duas moléculas de triose fosfato são convertidas a piruvato, com a concomitante geração de quatro ATPs. A glicólise, portanto, tem um rendimento de dois ATPs por glicose. Onde cada molécula de glicose é desdobrada em duas moléculas de piruvato (ácido pirúvico), com liberação de hidrogênio e energia, por meio de várias reações químicas. O hidrogênio combina-se com moléculas transportadoras de hidrogênio (NAD),formando NADH + H+, ou seja, NADH2.
Segunda fase: Fermentação Láctica
Após a glicólise, a redução do piruvato é catalisada pela enzima lactato-desidrogenase. O equilíbrio global dessa reação favorece fortemente a formação de lactato. Microrganismos fermentadores regeneram continuamente o NAD+ pela transferência dos elétrons do NADH para formar um produto final reduzido, como o são o lactato e o etanol.
Em torre de resfriamento no processo de produção de álcool, a microbiota do caldo de cana apresentou-se predominantemente bacteriana (88%), sendo 87% Gram positivas. As cepas pertencentes ao gênero Lactobacillus foram os contaminantes mais freqüentes (38%), seguindo-se os gêneros Staphylococcus (23%) e Leuconostoc (12%) (SILVA e CANHOS,1990).
Rendimento
O rendimento em ATP da glicólise sob condições anaeróbicas (2 ATP por molécula de glicose), como é o caso da fermentação, é muito menor que o obtido na oxidação completa da glicose até CO2 e H2O sob condições aeróbicas (30 ou 32 ATP por molécula de glicose).
Quando a glicose é completamente oxidada a CO2 e H2O, a variação total de energia livre padrão é -2840 kJ/mol. A degradação da glicose na via glicolítica até duas moléculas de piruvato (ΔG’0 = -146 kJ/mol) libera, portanto, apenas 5,2% da energia total que pode ser obtida da glicose pela oxidação completa [(146/2840)x100].
Com a redução de duas moléculas de piruvato as duas de lactato, são regeneradas duas moléculas de NAD+. O processo global é equilibrado e pode continuar indefinidamente: uma molécula de glicose é convertida em duas de lactato, com a geração de duas moléculas de ATP e, ainda, NAD+ e NADH são continuamente interconvertidos sem nenhum ganho ou perda global na quantidade de cada um deles.
A média de rendimento é de 85 a 90% em relação ao açúcar consumido (fermentado).O ácido formado é uma mistura racêmica (PELCZAR et al, 1997).
Utilização do Ácido Láctico
As bactérias láticas são encontradas no leite, plantas, silagem, vinho, cerveja e no intestino de humanos de animais. São importantes na produção de vários tipos de queijos e alimentos, como pães e bebidas lácteas, contudo, podem ser prejudiciais, por exemplo, por causar cáries nos dentes, através da liberação de ácido e pela produção de glucana ou na produção de vinho e outras bebidas (KETCHUM, 1988; RADLER, 1975).
Os lactatos são usados na indústria farmacêutica, de cosméticos e na alimentícia, seus ésteres são de dois tipos: esterificados na hidroxila do carbono b-(CH3-CHOR-COOH) ou, então, na carboxila (CH3-CHOH-COOR), sendo que, neste último, quando o radical possuir menos de quatro átomos de carbonos, os ésteres serão substâncias solúveis em água. Os ésteres são usados principalmente na fabricação de tintas e vernizes, de plastificantes e também como solventes.
4.5.2 Fermentação acética
A fermentação acética é realizada por um conjunto de bactérias do gênero Acetobacter ou Gluconobacter, pertencentes à família Pseudomonaceae (AQUARONE et al, 2001).
Na fermentação acética o etanol é oxidado a ácido acético. Essa etapa é feita por bactérias acéticas em meio aeróbio. Além do ácido acético são produzidas pequenas quantidades de outros produtos como aldeídos, cetonas, ésteres e outros ácidos orgânicos, sendo o acetaldeído o composto secundário predominante (SACHS, 1990).
Para a fermentação acética não é comum o uso de culturas puras. Emprega-se uma microflora mista de Acetobacter contendo diferentes espécies ou variedades dessa bactéria, que é considerada a mais eficiente (AQUARONE et al, 2001, SACHS, 1990).
As acetobactérias fazem fermentação acética, em que o produto final é o ácido acético. Elas provocam o azedamento do vinho e dos sucos de frutas, sendo responsáveis pela produção de vinagre.A fermentação acética é a oxidação do álcool etílico resultando como produto o vinagre (ácido acético + água).
Segundo o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Mapa, 2011) os fermentados acéticos são definidos como os produtos obtidos da fermentação acética do fermentado alcoólico de mosto de frutas, cereais vegetais, de mel, ou ainda da mistura hidroalcóolica, devendo apresentar acidez volátil mínima de 4,0 (quatro) gramas por 100 mililitros, expressa em ácido acético.
Produção de Ácidos por Microrganismos
Os fungos e as bactérias podem ser usados pelo homem para obtenção de produtos com grande valor econômico. As bactérias utilizadas industrialmente são as anaeróbias e microaerófilas, para a produção de ácido acético, lático, glucônico, propiônico e outros, ou para a produção de alimentos como queijos, picles, chucrutes, vinagres, leites fermentados e outros.
Os fungos também são usados na produção de ácidos por via fermentativa. Os principais ácidos são: cítrico, glucônico, itacônico, kógico, giberélico, fumárico, lático, gálico, ácidos graxos e outros.
As bactérias envolvidas nos processos para obtenção de ácidos são principalmente as do gênero Acetobacter e Lactobacillus. As bactérias podem formar inúmeros ácidos diferentes. São, no entanto, de maior interesse econômico algumas das bactérias produtoras de ácido lático, ácido acético e de ácido propiônico. Os ácidos são provenientes da degradação anaeróbica de glicídeos por oxidação incompleta.
4.6 FORMAS DE CONDUÇÃO
Existem diveras formas de condução dos processos de fermentação etanólica, classificados em descontínuos (batelada) e contínuos, assim como os que reutilizam e os que não reutilizam o inóculo.
Na condução em batelada, as operações de enchimento da dorna, inoculação e descarga do mosto fermentado são realizadas de modo intermitente. Em outras palavras, o inóculo (fermento) é colocado na dorna de fermentação, adiciona-se então o mosto e, terminada a fermentação, o mosto fermentado (vinho) é enviado para a seção de separação. Como na produção industrial de etanol o setor de destilação funciona de modo contínuo, várias dornas são necessárias, de modo que se teham, a intervalos regulares, dornas em início, meio e fim de fermentação suprindo, continuamente, através de um tanque-pulmão (dorna volante), vinho para as colunas de destilação.
Quando a condução do processo é de forma contínua, o fermentador (reator) é alimentado continuamente com o mosto contendo os nutrientes. O mosto fermentado é retirado também de forma contínua e na mesma vazão de entrada do mosto de alimentação.