INSTITUTO FEDERAL MINAS GERAIS campus BAMBUÍ
APOSTILA – Processos Fermentativos
Professora: Maria Silveira Costa
Curso: Técnico em Açúcar e Álcool (PROEJA)
Bambuí-MG Fevereiro-2014
1 MICRORGANISMOS DE IMPORTÂNCIA INDUSTRIAL
Dentre os microrganismos de importância industrial para fermentação alcoólica se encontram as leveduras e as bactérias. O microrganismo mais estudado para a produção de etanol é a levedura Saccharomyces cerevisiae, seguida pela bactéria Zymomonas mobilis. Em escala industrial, no Brasil, predomina a levedura Saccharomyces cerevisiae.
Em várias unidades industriais, ainda é comum, no início da safra, a utilização de levedura de panificação, na forma prensada ou granulada seca. Em outras unidades industriais, ao final da safra, isola-se a levedura produtora de etanol e conserva-se o microrganismo em meio nutritivo até o início da safra seguinte, quando então será reutilizada. É crescente o número de destilarias que utilizam leveduras isoladas e selecionadas de seus próprios processos de fermentação.
1.1 LEVEDURAS
As leveduras são os microrganismos mais importantes na obtenção do álcool por via fermentativa. Fazem parte do grupo de Ascomícetos denominados fungos superiores e são unicelulares, eucarióticos, heterotróficos. Em geral, são maiores que as bactérias, possuem quase sempre formas arredondadas, ovais e elípticas; porém variam consideravelmente no que se refere a suas dimensões, com limites desde 1 a 5 μm de largura e 5 a 12 μm de comprimento.
Unicelular: formado por uma única célula.
Eucariótico: contêm núcleo delimitado por membrana, conjunto de membranas e compartimentos internos e organelas citoplasmáticas. É organizado.
Heterotrófico: ser que necessita de outro ser para se alimentar e sobreviver. Não possui a capacidade de produzir glicose a partir da fotossíntese.
São organismos facultativos, pois apresentam os metabolismos anaeróbio e aeróbio. Apresentam o “Efeito Pasteur”, ou seja, em anaerobiose fermentam, com formação de pouca biomassa e muito etanol e, em presença de muito oxigênio, o contrário ocorre. Encontram-se muito difundidas na natureza, no solo, em pó e em frutos em geral, sendo que a maioria das leveduras vivem em exudatos açucarados de plantas e no néctar das flores, podendo ser transportadas pelo vento e por insetos.
Principais espécies de leveduras
Saccharomyces cerevisiae: Esta espécie de levedura é utilizada na panificação e cervejaria. Após o processo de fermentação, as leveduras são recolhidas e, posteriormente, são secas a vapor, estando prontas para serem vendidas como alimento.
Kluyveromyces marxianus: É a levedura que cresce no soro do leite. Também é utilizada para diminuir a DBO (Demanda bioquímica de oxigênio).
Shizosaccharomyces pombe: Esta espécie é usada como modelo científico.
Cryptococcus neoformans: Esta espécie é um patógeno humano e causa várias micoses sistêmicas (como criptococose).
Candida albicans: Também é um patógeno humano e causa micoses superficiais e profundas. A candidíase, doença muito comum, é causada por esta espécie.
Blastomyces spp: Responsável pela causa da blastomicose, esta espécie causa também micoses profundas (sistêmicas, invasivas de órgãos e tecidos.)
Paracoccidioides brasiliensis: Patógeno humano, causando várias micoses superficiais e profundas. 1.1.1 Saccharomyces cerevisiae
fermentação alcoólica são o alto rendimento e a elevada produtividade, ou seja, rápida conversão de açúcar em álcool, com baixa produção de componentes secundários. A espécie mais importante de levedura alcoólica é a Saccharomyce scerevisiae, que possui um largo espectro de utilização. Sua biomassa pode ser recuperada como subproduto de fermentação e transformada em levedura seca, que se constitui em matéria-prima para a fabricação de ração animal ou suplemento vitamínico para o homem.
Leveduras como Saccharomyces cerevisiae são utilizadas em vários processos, como a produção de fermento de pão, extrato de levedura, cerveja, etanol carburante, aditivos alimentícios (vitaminas, proteínas, enzimas), proteínas heterólogas (vacinas e outros componentes terapêuticos), e produtos de interesse farmacêutico através da manipulação de novas vias metabólicas e do aumento da produção com a engenharia genética, uma vez que o genoma de leveduras já foi inteiramente sequenciado.
Nutrição
As leveduras são microrganismos saprófitas que exigem uma fonte de carbono elaborada -glicose ou outro açúcar, que forneça a energia química e o esqueleto carbônico de suas estruturas celulares, constituídas predominantemente de carbono, oxigênio e hidrogênio. Algumas vitaminas, como tiamina e ácido pantotênico, também são exigidas.
O meio deve, igualmente, fornecer nitrogênio, fósforo, enxofre, potássio, magnésio, cálcio, zinco, manganês, cobre, ferro, cobalto, iodo e outros elementos em quantidades diminutas (LIMA et al, 2001).
Quanto à fonte de nitrogênio a levedura Saccharomyces cerevisiae utiliza esse elemento nas formas amoniacal (NH4+), amídica (uréia) ou amínica (na forma de aminoácidos), não tendo habilidade metabólica para aproveitar o nitrato e com pouquíssima ou nenhuma capacidade de utilizar as proteínas do meio (LIMA et al, 2001; ROITMAM et al, 1988).
Sendo a principal forma a amoniacal, na ausência desta, a levedura procura outras fontes, como os aminoácidos, com isso acarreta um aumento na produção de componentes secundários, tais
como os álcoois isoamílico, amílico, propílico, isopropílico, butílico, isobutílico. O fósforo é absorvido na forma de íon H2PO4 -, forma predominante em pH 4,5 enquanto o enxofre pode ser
assimilado do sulfato, sulfito ou tiossulfato. A sulfitação do caldo no processo de fabricação de açúcar, bem como o ácido sulfúrico empregado no tratamento do fermento, parece fornecer quantidade suficiente de enxofre para a levedura, pois a exigência desse elemento é pequena (LIMA et al, 2001).
Os efeitos de alguns contaminantes e seus produtos metabólicos sobre a levedura são ainda pouco conhecidos, porém sabe-se que um nível elevado de contaminação pode causar redução na produtividade e no rendimento fermentativo devido à competição pelo substrato, à redução da viabilidade das células de levedura pela “intoxicação” por metabólitos do microrganismo contaminante e à floculação das leveduras pela ação das células bacterianas (YOKOYA, 1989).
A floculação do fermento (formação de flocos compostos de células de leveduras e bactérias) diminui a velocidade de fermentação, uma vez que diminui a área de contato entre a levedura e substrato, e ainda causa problemas operacionais, tais como aumento de fundo de dorna e dificuldades na operação das centrífugas. Foram detectadas várias espécies de Bacillus associados à floculação, bem como um gênero resistente ao tratamento ácido do pé-de-cuba, o Sporolacto bacillus (SERRA et al, 1979).
Crescimento
As leveduras podem se reproduzir por gemação (brotamento), esporulação e fissão.
Reprodução por gemação ou brotamento: neste processo aparece uma pequena saliência na parede e esta vai aumentando gradualmente, o citoplasma da célula mãe e célula filha permanecem unidos por algum tempo até que a abertura de passagem de material entre elas se feche formando-se uma parede dupla o que completa o processo. Na célula mãe surge uma cicatriz permanente não podendo haver outro brotamento neste local, na célula filha forma-se uma cicatriz que não é permanente. (Reprodução assexuada)
Reprodução por esporulação: refere-se a formação de esporos sexuados, através da associação de células diferenciadas, por um mecanismo que envolve uma divisão redutora (meiose). (Reprodução sexuada)
Reprodução por fissão: É uma forma de reprodução assexuada, que ocorre em alguns poucos gêneros de leveduras. Consiste no alongamento da levedura, o núcleo se divide em duas células filhas, que em seguida se separam rompendo a parede.
Ciclo de crescimento
Fase Lag: Período de adaptação da cultura. Mudança de meio – Preparação do complexo enzimático. Reparação das células com danos;
Fase Exponencial: Momento em que as células se dividem. Velocidades de crescimento são bastante variáveis;
Fase Estacionária: Ocorre a limitação por depleção de nutrientes e acúmulo de metabólitos;
Fase Morte: A manutenção de uma cultura no estado estacionário por longo tempo conduz as células ao processo de morte. A morte celular é acompanhada da lise celular.
Efeitos ambientais no crescimento microbiano
As atividades microbianas são intensamente afetadas pelas condições químicas e físicas de seus ambientes. O entendimento das influências ambientais ajuda a explicar a distribuição dos microrganismos na natureza, tornando possível o desenvolvimento de método para o controle ou otimização das atividades microbianas. Os principais fatores são: temperatura, pH, disponibilidade de água e oxigênio.
Cada microrganismo possui suas especificidades de temperaturas mínimas, ótimas e máximas, onde ao atingir a mínima ou a máxima acontece a lise celular, ou seja, a morte da célula. Portanto, para se ter um crescimento microbiano adequado, é necessário que se conheça o microrganismo com o qual se está trabalhando, assim como suas características térmicas.
• pH
A maioria dos microrganismos tem uma faixa de pH que varia de duas a três unidades. O pH ideal para o desenvolvimento de leveduras é de 4 a 5,5, sendo estas mais tolerantes à acidez do que as bactérias.
• Disponibilidade de água
Quanto maior o teor de água “livre” na matéria-prima maior será a capacidade de crescimento dos microrganismos. A água é um meio extremamente favorável para o desenvolvimento destes microrganismos.
1.2 BACTÉRIAS
São seres unicelulares e procarióticos pertencentes à classe dos Esquizomícetos, de estrutura muito simples e núcleo difuso, que se reproduzem por cissiparidade. As bactérias têm importante papel na natureza, não só pela variedade de espécies, como também pela reprodução rápida e diversidade de fenômenos em que tomam parte. Devido à sua rápida multiplicação e ação bioquímica, as bactérias constituem um grupo de importância capital para o equilíbrio da natureza. Unicelular: formado por uma única célula
Procariótico: não possui membrana nuclear
Distinguem-se das células eucariontes por não possuírem membrana que separa núcleo e citoplasma (membrana nuclear), nem aparelho respiratório organizado (mitocôndrias).Muitas bactérias apresentam formas resistentes denominadas esporos, que lhes permitem sobreviver por determinado tempo em condições adversas: temperaturas, ambientes secos, etc. A bactéria é constituída por citoplasma com núcleo difuso, limitada por uma membrana cuja camada externa contém mucilagem e cera. Apesar do tamanho minúsculo, as bactérias podem ser vistas em microscópios ópticos.
Certas bactérias são móveis, graças a prolongamentos muito delgados chamados "cílios"; as não ciliadas são imóveis. No entanto, é principalmente a forma que diferencia umas das outras: podem ser esféricas (cocos), cilíndricas (bastonetes ou bacilos), espiraladas (espirilos) ou recurvadas (vibriões). Os cocos podem ser isolados (micrococos) ou agrupados de dois em dois (diplococos) ou em cubos (sárcinas), em cadeia (estréptococos) e em cachos (estafilococos).
Algumas bactérias necessitam de oxigênio (aeróbias), outras não suportam o oxigênio livre (anaeróbias) e muitas podem adaptar-se à presença ou ausência desse gás (anaeróbias facultativas). A maioria das bactérias são parasitas ou saprófitas. Algumas são autotróficas. Sua riqueza enzimática lhes confere intensa atividade bioquímica: degradação de substâncias orgânicas, produção de gases, pigmentos e toxinas (exotoxinas e endotoxinas), depósitos de ferro ou enxofre. Sua proliferação só é possível em certos limites de temperatura; as bactérias do solo desenvolvem-se à temperatura ambiente, as bactérias patogênicas entre 37 e 40ºC. As bactérias são os agentes das fermentações e das putrefações; transformam as substâncias orgânicas do solo em substâncias minerais e em gases, fixam os gases do ar e enriquecem o solo de nitrogênio, fornecendo, assim, aos vegetais uma parte dos alimentos inorgânicos de que necessitam, interferindo também na digestão intestinal de muitos animais superiores. Algumas são patogênicas para o homem e animais, atuando pelas toxinas e pela perturbação digestiva que acarretam. Outras são comensais dos meios internos do homem e de animais, podendo até mesmo intervir em seu metabolismo: assim o bacilo amylobacter do tubo digestivo dos mamíferos permite que os herbívoros utilizem a celulose. Quanto às bactérias do solo, a maioria delas assegura a mineralização dos excrementos e dos cadáveres (nitrificação, por exemplo), fechando assim os ciclos bioquímicos, enquanto algumas espécies (bacilos tetânicos, botúlico, perfringente, etc.) podem tornar-se patógenas. Reconhecidas em estado fóssil nos terrenos primários, as bactérias também têm contribuído para a formação de rochas combustíveis (carvão, petróleo).
Dentre as diversas bactérias existentes, a que possue maior importânica industrial para o setor sucroalcooleiro, mais especificamente para a produção de etanol, é a bactéria denominada Zymomonas mobilis, e portanto objeto do nosso estudo.
1.2.1 Zymomonas mobilis
A bactéria Zymomonas mobilis é gram-negativa, não esporulante e móvel, anaeróbia facultativa, sendo que, algumas linhagens são obrigatoriamente anaeróbias. Morfologicamente, apresenta-se na forma de bastonete curto e grosso medindo de 2,0 a 6,0 μm de comprimento e 1,0 a 1,4 μm de largura. Quando apresenta mobilidade, possui de um a quatro flagelos polares (FALCÃO DE MORAIS, 1983). São encontradas geralmente em pares, embora também apareçam isoladas. Possuem rotas catabólicas comparativamente simples e não tem a variedade de alternativas metabólicas encontradas em outros microrganismos. De forma a gerar energia suficiente para o crescimento, Zymomonas mobilis deve catabolizar substratos com altas taxas específicas de carbono, resultando em baixos rendimentos de biomassa pois a maior parte deste substrato é incorporado no catabolismo do produto final, o etanol (TOMA et al., 2003).
Em meios com altas concentrações de açúcar (melaço com mais de 15º Brix), estas bactérias ocorrem como longos filamentos de extremidades dilatadas. Em meio sólido à base de glicose, as colônias apresentam-se lenticulares de bordas regulares, de coloração branca ou creme e com 1,0 a 2,0 mm de diâmetro após 2 dias de incubação a 30°C (SWINGS; DE LEY, 1977).
Açúcares fermentáveis como glicose, frutose e, em alguns casos, sacarose, são indispensáveis na composição do meio de cultura de Zymomonas mobilis. Uma vez que esta fermenta glicose e frutose gerando quantidades praticamente equimolares de etanol e CO2,
formando colônias de coloração branca ou creme. A fermentação de 1 mol de glicose dá origem a 1,6 de etanol, 1,8 moles de CO2 e pequena quantidade de outros subprodutos com lactato,
acetaldeído, ácido acético, glicerol, acetoína, dihidroxicetona, sorbitol, manitol, levana e ácido glicônico. As condições ideais para o crescimento desta bactéria são intervalos de temperatura de 30 a 36°C e intervalos de pH entre 5 e 7. Cultivadas em meio complexo, podem converter 98% da glicose presente em etanol, CO2, lactato e outros, seguindo um balanço metabólico simples. Apenas
2% da glicose são utilizados para formar biomassa.
As Tabelas abaixo mostram a porcentagem de crescimento de linhagens de Zymomonas mobilis em diferentes valores de pH e temperatura de incubação, respectivamente (SWINGS; DE
LEY, 1977).
Na hidrólise da sacarose, ou de misturas de glicose e frutose, os subprodutos da formação de etanol são a levana e o sorbitol. A frutose, formada da hidrólise da sacarose, não é primariamente transportada para o interior das células, mas sim utilizada na formação de levana e frutooligômeros pela ação da enzima levanasacarase (LOOS et al., 1994).
A maioria das cepas requer ácido pantotênico, biotina e, ocasionalmente, alguns outros fatores de crescimento como vitamina B12, riboflavina, tiamina, ácido lipóico e ácido fólico. Além disso, altas quantidades de extrato de levedura aumentam a produção de células, mas não necessariamente a produtividade de etanol, levana ou sorbitol (CROMIE; DOELLE, 1980).
Belaich e Senez (1965) estudaram o efeito de pantotenato no crescimento de Zymomonas mobilis e observaram que a limitação desta substância resulta na redução da velocidade específica de crescimento da bactéria. Os autores citam que o pantotenato é uma vitamina essencial à produção de etanol porque a bactéria não sintetiza pantotenato, mas necessita desta substância para produzir compostos orgânicos essenciais para o crescimento celular, produzindo, conseqüentemente, etanol.
Nas fermentações com Zymomonas mobilis em meio de cultivo contendo glicose, extrato de levedura, sulfato de amônio, fosfato de potássio e sulfato de magnésio, quando a glicose é exaurida, cessa-se a utilização da fonte inorgânica de nitrogênio (NH4) e a bactéria começa a metabolizar os
aminoácidos do meio como fonte de carbono, com liberação do nitrogênio na forma de amônia, resultando num aumento do pH do meio. Caso o meio de cultivo seja alimentado novamente com glicose o pH deste meio diminui gradualmente. Isto se deve a que o mecanismo que gera o potencial eletroquímico, e direciona o processo de transporte de entrada de glicose, opera via excreção de prótons com os produtos metabólicos por ação da enzima próton-translocante ATPase localizada na membrana celular (ISHIZAKI et al., 1994).
O metabolismo de açúcares de Zymomonas mobilis, ilustrado na Figura a seguir, aparece como uma “via metabólica” com algumas ramificações. A sacarose é metabolizada a glicose e
frutose pela ação das enzimas invertase (INV B) e levanasacarase (LEV U). As duas hexoses entram na célula via sistema de difusão facilitada (GLF) ou são convertidas pela GFOR (glicose-frutose oxirredutase), uma enzima contendo NADP (nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-fosfato) que existe apenas na bactéria Zymomonas mobilis. A enzima GFOR madura está localizada no periplasma, oxida glicose a gliconolactona e reduz frutose a sorbitol. Gliconolactona é, então, convertida pela gliconolactonase (GL), outra enzima periplasmática, em ácido glicônico (gliconato). Ambas as enzimas são os principais constituintes do periplasma, formando aproximadamente 20 a 30% das proteínas deste compartimento. O ácido glicônico é consumido pelas células e pode ser completamente degradado (como um co-substrato) a etanol e ácido acético. O sorbitol é produzido para neutralizar o efeito prejudicial de estresse osmótico (SPRENGER, 1996).
Segundo Doelle et al. (1993), Zymomonas mobilis é uma bactéria única dentro do mundo microbiano, com crescimento, produção de energia e resposta às condições de cultura extremamente peculiares, causando um grande interesse no mundo científico, biotecnológico e industrial. Os autores afirmam que a habilidade da bactéria em acoplar e desacoplar a produção de energia a favor da formação do produto, responder à manipulação física e química do ambiente, bem como sua limitada formação de produtos tornam-a um microrganismo ideal para o estudo e desenvolvimento de processos microbianos.
2 TÉCNICAS DE MANUTENÇÃO DE MICRORGANISMOS
A escolha do método de manutenção mais adequado deve ser baseada pelas características do agente em estudo, assim como pelas vantagens e desvantagens de cada técnica disponível. Para o estudo com células, tecidos e microrganismos, há o anseio pelo desenvolvimento de metodologias mais adequadas à sua conservação, porém, observa-se uma lacuna entre as publicações científicas pertinentes, verificando-se um número reduzido de estudos abordando a problemática da seleção e validação de protocolos principalmente na manutenção de bactérias, bem como na avaliação dos desafios e perspectivas da colheita, processamento, estocagem e manutenção de amostras microbiológicas.
Os processos de isolamento, identificação, conservação e a utilização de microrganismos vem sendo considerados como rotina para o desenvolvimento de pesquisas e obtenção de produtos de interesse econômico.
No âmbito da ciência, a implantação e manutenção de coleções de culturas permitem a formação de estoques de cepas que podem ser utilizadas experimentalmente em diferentes momentos.
O alvo de qualquer método de manutenção é preservar a viabilidade e principalmente proporcionar estabilidade genética do microrganismo ao isolamento, pelo maior tempo possível, evitando assim a formação excessiva de mutações que alterem suas características. Além disso, procura-se adequar a escolha de uma técnica de conservação baseando-se nas particularidades do agente, nas características do próprio método a ser aplicado, nos custos de manutenção da técnica, da importância do acervo e principalmente na capacidade laboratorial e disponibilidade de equipamentos.
Considerando as exigências dos microrganismos e o manuseio em laboratórios, a manutenção de estirpes podem ocorrer em curtos períodos (dias ou meses), onde as culturas bacterianas podem ser mantidas a temperaturas relativamente baixas (4-10°C). Contudo, se a conservação prolongada apresenta-se como opção mais viável, deve-se optar pelo armazenamento em temperaturas ultra baixas como a criopreservação em freezers a -80°C, em nitrogênio líquido a -196°C ou o processo de liofilização que consiste no congelamento e desidratação das células bacterianas, em atmosfera de vácuo.
Diante da necessidade de preservação de microrganismos, muitas vezes, busca-se conservar um agente que foi selecionado e melhorado com intuito de manter sua nova identidade. Ainda assim, o objetivo da manutenção de um microrganismo não é somente conservar seu estado inicial evitando mutações indesejáveis, mas também garantir ao máximo a vitalidade das células e a quantidade de células viáveis.
Segundo COSTA & FERREIRA (1991), os métodos de manutenção de microrganismos podem ser classificados de acordo com tempo máximo de preservação:
• Métodos de curto prazo: repique contínuo;
• Métodos de médio prazo: preservação em óleo mineral, preservação em água esterilizada, congelamento a -20ºC;
• Métodos de longo prazo: liofilização, criopreservação.
Todos estes métodos permitem a elaboração de estudos retrospectivos e prospectivos, elucidando o estado biológico, etiologia e aspectos epidemiológicos. Entretanto, a escolha adequada de procedimentos de preservação, incluindo a aplicação de um ou a combinação de mais métodos, permite uma análise fenotípica e genotípica mais satisfatória, quando se pensa na conservação de microrganismos a longo prazo.
Diversos protocolos de estocagem têm sido desenvolvidos e aplicados, porém, a maioria não tem se mostrado plenamente eficaz, visto as peculiaridades de cada agente a ser conservado e até mesmo pelas características das técnicas, por isso, vem se justificando a conjunção de dois ou mais protocolos a fim de se garantir a melhor recuperação dos microrganismos.
As bactérias, em específico, na tentativa de sobrevivência mediante a utilização de métodos de conservação nos alimentos, são capazes de produzir mecanismos de respostas, como proteínas especializadas para resistência térmica (heat-proteins), mudanças estruturais da membrana com alteração na saturação de ácidos graxos visando à proteção contra baixas temperaturas e reparo de material genético, demonstrando a capacidade de recuperação de células injuriadas, quando em ambiente favorável, após um curto período de tempo.
Considerando o emprego de métodos de conservação sobre alimentos, os microrganismos podem estar presentes em uma amostra sob três estados: inviabilizados (apresentando injúria letal e impossibilidade de multiplicação), com injúria subletal (apesar de ter sofrido danos em suas estruturas celulares, encontrase hábil para multiplicação sob condições favoráveis) e viáveis. Desta forma, a capacidade de recuperação de microrganismos viáveis norteia a eleição do método de manutenção.
2.1 MÉTODO DE CONSERVAÇÃO A CURTO PRAZO 2.1.1 Repicagem contínua ou periódica
A técnica de repique contínuo, também chamado de subcultivo ou repicagem periódica, é um método simples e tradicional de manutenção de culturas em laboratório. Por ser uma das mais antigas técnicas de conservação, tem sido bastante utilizada para se obter a viabilidade de microrganismos, principalmente de bactérias.
O método consiste na inoculação do microrganismo em meio adequado, incubação em ambiente favorável à multiplicação e estocagem em baixas temperaturas, após sua multiplicação. Nesta situação, é aconselhável o armazenamento de culturas sob refrigeração (5 a 8°C ), em busca da redução do metabolismo dos microrganismos e o aumento entre os intervalos de repiques das culturas, proporcionando a conservação de leveduras em média de 1 a 3 meses e de bactérias em torno de 5 a 12 meses.
Apesar de alguns autores preconizarem o armazenamento das culturas sob refrigeração, COSTA & FERREIRA (1991) relataram a possibilidade de incubação em temperatura ambiente, alertando a necessidade de monitoração, a fim de evitar a desidratação do meio de cultura e a consequente privação de elementos essenciais aos microrganismos.
A repetição do processo para novos meios deve ser realizada em intervalos de tempo condizentes com as necessidades e particularidades de cada microrganismo, avaliando-se as condições ótimas e período máximo de sobrevivência entre as diferentes cepas. Entretanto, é aconselhável que a transferência de culturas seja realizada antes que o substrato do meio seja totalmente utilizado pelos microrganismos, ou então se desidrate. É sugerido que os métodos de repicagens periódicas para fungos devem ser realizados em intervalos de 3 ou 4, a fim de evitar o consumo total do substrato do meio de cultura e se evite o acúmulo excessivo de metabólitos fúngicos, já que estes se comportam como agentes mutagênicos.
Para minimizar o efeito da desidratação, os isolados devem ser conservados em tubos de ensaio com tampa rosqueável ou selados com parafina, em ambientes protegidos da luz e de variações de temperatura, mantendo preferencialmente uma faixa entre 5 e 8°C.
Este método clássico de repicagem, apresenta como vantagens a facilidade e o baixo custo, por não provocar estresse ou injúria celular e não necessitar de reativação dos microrganismos. Entretanto, apresenta maior risco de contaminação em decorrência da constante manipulação das culturas devido aos repiques contínuos e periódicos; perdas de características genéticas decorrentes de mutações; necessidade de maior espaço físico para armazenamento das culturas; logística inconveniente quanto à postagem; variabilidade entre as cepas e consequentemente entre os intervalos de repiques para cada microrganismo armazenado.
A idade das culturas e, principalmente, a frequência de repicagens devem ser avaliadas para o emprego deste método de manutenção, pois, as culturas mais velhas acabam por gerar culturas-filhas modificadas, levando-se em consideração a ocorrência de alterações tanto de caráter morfológico quanto fisiológico. Ainda assim, apesar do risco de comprometimento da estabilidade
genética, a manutenção por repicagens periódicas traz consigo outro problema considerável, como a perda da patogenicidade ou virulência de algumas bactérias, daí a necessidade de verificação periódica das características de cada isolado.
A composição do meio de cultura pode interferir na resistência das células, no entanto, existem dois conceitos que se opõem sobre qual a composição ideal de meio de cultivo na manutenção de microrganismos: meios com boa composição de nutrientes ou meios menos elaborados, do ponto de vista nutricional.
Considerando a manutenção de bolores e leveduras, os meios devem conter baixa concentração de açúcares fermentadores para evitar o crescimento micelial exagerado e prevenir alterações. Neste caso, procura-se utilizar meios que propiciem o mínimo de crescimento micelial acompanhado do máximo desenvolvimento das frutificações ou estruturas de propagação e resistência. Quanto à manutenção de fungos esporulantes, preconiza-se a utilização de esporos e não de micélios durante a repicagem, visto que os esporos tendem a manter as características genéticas originais durante o processo de estocagem.
2.2 MÉTODOS DE CONSERVAÇÃO A MÉDIO PRAZO 2.2.1 Manutenção em óleo mineral
Este método de conservação é uma alternativa simples que consiste na aplicação de uma
camada de óleo mineral esterilizado sobre uma cultura, a fim de limitar a quantidade de oxigênio
disponível, causando assim uma redução no metabolismo e consequemente na taxa de multiplicação do agente.
Esta técnica proporciona uma maior longevidade às estirpes, quando comparada à repicagem periódica, bem como redução da velocidade de desidratação do meio de cultura, em consequência da diminuição de oxigênio. Diversas bactérias e fungos podem ser conservados por esta técnica, sendo armazenados com sucesso por 2 a 3 anos, visto a redução na atividade metabólica e nas transferências para outros meios de cultura. Entretanto, comparando com outros métodos, apresenta desvantagens equivalentes à técnica de subcultivo, como a possibilidade de
contaminações, instabilidade genética e dificuldades com a utilização do óleo (esterilização e
manuseio).
A manutenção de microrganismos submersos em óleo mineral promove a redução do
consumo de oxigênio em torno de 10% em poucas horas. Camadas de óleo superiores a 1 cm não
devem ser utilizadas, mediante a redução da viabilidade dos microrganismos em condições de total exaustão de oxigênio. Caso a conservação de culturas seja feita em tubo inclinado, o óleo deve ser adicionado até que todo o meio esteja recoberto, pois o contato dos microrganismos com o ar promove desidratação total da cultura pela evaporação da água.
Considerando o sucesso na manutenção de microrganismos, verifica-se que os óleos utilizados nesta técnica devem ser de boa qualidade e pureza, apresentar alta viscosidade, densidade relativa entre 0,8 e 0,9 à temperatura de 20°C e, além disso, não devem conter produtos tóxicos, sendo a parafina e a vaselina, os mais recomendados para a manutenção de microrganismos em curto prazo.
Outra preocupação quanto à qualidade dos óleos utilizados neste método se recorre ao processo de esterilização. Sugere-se que para a esterilização destes produtos, a autoclavação não é a técnica ideal, preconizando-se o aquecimento por meio de um forno a 170°C por uma a duas horas. Pesquisas afirmam que neste procedimento, deve-se evitar a formação de umidade a fim de se eliminar riscos de contaminação e se ter um controle de temperatura, pois sua elevação pode resultar na formação de produtos tóxicos aos microrganismos em estoque. Existem dois procedimentos possíveis para a esterilização do óleo mineral: autoclavagem a 1 atm por 30 minutos seguida de secagem a 150ºC, ou aquecimento à 170ºC por uma hora. Alternativamente recomenda-se a autoclavagem a 121°C e 15lb de pressão por 15 minutos, recomenda-seguida de permanência em estufa a 100°C por uma noite para remoção de água.
incubação de 18 a 24 horas, sob temperatura de 25 a 28°C. Após a observação de multiplicação bacteriana no meio de cultivo, deve-se realizar a adição do óleo de forma asséptica, limitando uma altura de um a dois cm acima do ponto mais alto do meio inclinado. Bem como a temperatura de conservação do meio após adição do óleo pode variar entre 4ºC e 20ºC, sofrendo ajustes mediante as necessidades individuais de cada agente.
A recuperação dos microrganismos mantidos sob conservação em óleo mineral baseia-se apenas na transferência das culturas para outro meio sólido ou líquido. Entretanto, preconiza-se que na transferência de culturas preservadas por este método, seja utilizado o mesmo meio de cultivo utilizado durante a manutenção e sugere-se que a retirada dos microrganismos deve ser precedida pela drenagem total da camada de óleo.
Neste contexto, observa-se que a alternativa de preservação de microrganismos em óleo mineral possui as mesmas vantagens que o repique contínuo, diferindo somente na longevidade
da cultura, que se apresenta por maiores intervalos. Pesquisadores relatam que as bactérias podem
ser conservadas por períodos de 1 a 7 anos dependendo da espécie, enquanto fungos sobrevivem por 1 a 5 anos, e leveduras até 7 anos.
2.2.2 Manutenção em água esterilizada
A preservação em água destilada esterilizada ou também conhecida pelo método de Castellani consiste no armazenamento de microrganismos em água esterilizada ou solução salina, sendo indicada na preservação de microrganismos sensíveis a baixas pressões osmóticas de soluções hipotônicas.
Esta técnica deve ser utilizada preferencialmente com culturas jovens, com cerca de 10 a 15 dias, e busca redução do metabolismo, com consequente latência das células diante da restrição de fontes nutritivas.
O método se baseia na transferência de culturas para frascos contendo uma solução de água esterilizada, com posterior armazenamento sob temperatura ambiente. Sugere-se a utilização de suspensões bem concentradas de células, a partir de um crescimento em meio sólido ou a inclusão de blocos de ágar contendo os microrganismos.
Apesar do baixo custo e reprodutibilidade, nota-se os riscos de contaminação das culturas e um possível comprometimento na estabilidade genética de alguns microrganismos. Quanto à utilização dos blocos de ágar em água, sua aplicação é restrita a microrganismos que tenham grande aderência ao ágar como bolores e algumas leveduras.
De uma forma geral, a utilização de água destilada esterilizada como meio de manutenção tem sido proposto com sucesso para bactérias fitopatógenas, esporos do gênero Bacillus e vírus da hepatite.
Considerando bolores e leveduras, resultados satisfatórios têm sido obtidos no que se refere à viabilidade, estabilidade, pureza e patogenicidade. Este método além de garantir a preservação das características originais da cultura por longos períodos, promove a ausência de contaminação por ácaros, apresenta baixo custo por utilizar somente água destilada e revela a necessidade de pequeno espaço físico para acondicionar os frascos, além de ser empregado para um grande número de gêneros e espécies de fungos.
2.2.2 Congelamento comum
O congelamento comum se baseia na conservação de agentes em temperaturas relativamente baixas entre -4 e -20°C. Apresenta-se como um dos métodos de manutenção mais simples e baratos, além de oferecer boa segurança para o armazenamento de diversos microrganismos por períodos de 3 meses a 2 anos, devido a uma redução significativa no metabolismo celular.
Trata-se de um método simples, menos oneroso, não requer equipamentos sofisticados, nem mesmo no preparo do material. Como desvantagem, verifica-se possível redução da
viabilidade de alguns microrganismos, em função dos danos causados às células em decorrência da formação de cristais de gelo e da variação eletrolítica na faixa de temperatura utilizada.
2.3 MÉTODOS DE MANUTENÇÃO A LONGO PRAZO 2.3.1 Liofilização
A técnica de liofilização caracteriza-se na conservação de microrganismos por meio da dessecação rápida de culturas que se encontravam em estado de congelamento. A remoção do vapor de água presente em amostras biológicas viáveis em estado de congelamento apresenta-se como alternativa capaz de retardar o relógio biológico estabelecido pela natureza. Desta forma, a liofilização e a criopreservação são as técnicas mais empregadas na conservação da biodiversidade microbiana, sendo uma das chaves para a realização dos serviços de coleção de culturas microbiológicas.
A liofilização é considerada uma das técnicas mais eficientes para a manutenção de microrganismos, justamente por garantir a viabilidade dos agentes por 17 a 20 anos e ser aplicável para a maioria deles, com exceção de algas e protozoários.
Uma grande variedade de coleções de culturas depende deste processo para garantir e preservar a diversidade de seus espécimes, por isso, tem sido utilizada como método de referência para a preservação a longo prazo.
A técnica se baseia na remoção da água intracelular de materiais biológicos congelados, por sublimação, evitando a formação de cristais de gelo, capazes de provocar danos às estruturas celulares, além da degradação de enzimas presentes no citosol, levando a morte dos agentes.
Basicamente, a liofilização pode ser definida como um processo de desidratação sob condições de vácuo, constituído por 3 etapas: congelamento, desidratação primária e desidratação secundária. O congelamento promove a inércia do material a ser liofilizado, gerando uma interrupção das reações químicas e atividades biológicas, sendo por isso uma das fases mais críticas. Posteriormente, a amostra biológica sofre desidratação por meio de sublimação, seguindo-se com o emprego de temperaturas de seguindo-secagem, sob pressões reduzidas.
Apesar da liofilização ser amplamente empregada na manutenção de diferentes microrganismos e ser considerada uma técnica de conservação a longo prazo, as etapas que compõem o processo são capazes de causar injúrias ou danos celulares como alterações na permeabilidade da membrana celular, o que leva ao aumento da sensibilidade a alguns agentes seletivos, aumento da fase lag de multiplicação celular e a necessidade de incremento nutricional.
Na tentativa de contornar os danos celulares, substâncias protetoras podem ser adicionadas durante o desenvolvimento de microrganismos, antes do congelamento ou da secagem. Vale destacar que a escolha destas substâncias varia com o microrganismo alvo da liofilização, porém compostos como o soro bovino, leite desnatado, glicerol, betaína, adonitol, sacarose, glicose, lactose, trealose e alguns polímeros como dextran e polietilenoglicol podem oferecer proteção para muitas espécies.
Os procedimentos de estocagem e acondicionamento influenciam significativamente na vida de prateleira dos materiais liofilizados. Desta forma, os produtos liofilizados, armazenados em ampolas ou frascos de vidro, devem ser acondicionados em ambientes com baixa umidade, baixas temperaturas, abrigo de oxigênio, luz e contaminantes.
Considerando a manutenção de bactérias, verifica-se que a viabilidade relativa após a liofilização decresce entre as bactérias formadoras de esporos, Gram positivas e Gram negativas, algas e alguns protozoários, fato facilmente explicado pelas diferenças na morfologia.
2.3.2 Criopreservação
A criopreservação consiste na manutenção de uma variedade de tipos celulares sob baixas temperaturas, tendo como principal objetivo a redução de injúrias aos materiais biológicos, incluindo células animais e vegetais, bactérias, fungos, vírus e tecidos, durante o processo de
congelamento e estocagem a frio.
Este método compreende a manutenção de materiais a baixas temperaturas (-20°C a -80°C em freezers) e ultra baixas temperaturas (-150°C a -196 °C em containeres de nitrogênio líquido). No que tange a conservação dos microrganismos, a estocagem a baixas temperaturas, apesar de eficiente, pode comprometer a qualidade das amostras armazenadas, visto a possibilidade de variações de temperatura em freezers. Já os sistemas de nitrogênio líquido garantem o armazenamento a temperaturas constantes e por longos períodos.
Embora a eficiência da conservação em temperaturas ultra baixas seja garantida, alterações cíclicas da temperatura de -196°C até -130°C ou -100°C resultam na morte dos microrganismos armazenados, ressaltando desta forma, o cuidado ante a movimentação e transporte de exemplares criopreservados.
Apesar da existência de diversas técnicas de manutenção de microrganismos, o princípio do congelamento-descongelamento se manteve entre os mais importantes e viáveis para a preservação celular.
Considerando as altas taxa de sobrevivência de microrganismos que a criopreservação proporciona, pesquisadores buscam aprimorar a técnica quanto a sua utilização, principalmente pelo aspecto prático, visto a recuperação e obtenção de células viáveis, mas também na redução de possíveis mutações genéticas. Entretanto, faz-se necessário frisar que os protocolos de criopreservação necessitam de adequação metodológica acessível e aplicável para a diversidade de microrganismos existentes.
Diante da importância do método e sua aplicação na conservação de materiais biológicos, é necessário destacar que a criopreservação de microrganismos é dependente de uma série de fatores como a espécie a qual se pretende preservar, suas particularidades como tamanho e estrutura celular, a fase e taxa de desenvolvimento, exigências como temperatura de incubação, composição dos meios de cultivo, pH, osmolaridade, tolerância ao oxigênio, teor de água das células, teor lipídico, composição do meio para congelamento, temperatura e tempo de estocagem, e condições para recuperação das culturas.
Outro parâmetro interferente e de grande relevância na criopreservação é a taxa de resfriamento. Quando os materiais biológicos a serem conservados são submetidos ao resfriamento lento, ocorre uma redução gradativa da temperatura, porém se estabelece uma curva de resfriamento extremamente rápida capaz de prevenir as injúrias celulares, e ao mesmo tempo lenta, o suficiente para permitir um nível de desidratação capaz de evitar a formação de gelo intracelular. A vitrificação compreende a utilização de taxas de resfriamento extremamente altas, porém a adição de crioprotetores em altas concentrações promove a redução de água antes do resfriamento, impedindo assim a formação de cristais de gelo e os consequentes danos estruturais.
Durante o processo de congelamento, o desafio das células não se caracteriza na resistência sob temperatura de armazenamento de -196°C, mas sim na capacidade de suportar as possíveis alterações decorrentes pela passagem pelas faixas intermediárias de temperatura (+ 19°C a + 8°C e -15°C a - 60°C), tanto durante o congelamento quanto no descongelamento.
A metodologia padrão para a criopreservação tem início na refrigeração do material biológico, mantendo-o a temperatura de 20°C. Nesta etapa, não se evidencia danos às estruturas celulares, desde que a amostras estejam diluídas em meios adequados. Com a redução da temperatura, pode ser determinada uma faixa crítica, entre +19 e +8°C, na qual os microrganismos poderão sofrer algum tipo de injúria celular. Quando este resfriamento é realizado de uma forma inadequada, o fenômeno determinado como choque térmico provoca danos irreversíveis como alterações na membrana plasmática com consequente aumento da permeabilidade e perda de íons e moléculas intracelulares, além da redução do metabolismo.
Quando o processo de redução de temperatura atinge a faixa de -6°C a - 15°C, verifica-se a cristalização da água presente no meio, o aumento da concentração de soluto na fração descongelada e a ausência de formação de cristais de gelo intracelular pelo controle da membrana plasmática. Quando o material atinge a temperatura crítica de -60°C verifica-se a inércia celular, sendo possível realizar a imersão do material em nitrogênio líquido, para seu armazenamento e
3 CONTROLE DE MICRORGANISMOS NA INDÚSTRIA
Os métodos de controle e eliminação de microorganismos em objetos (incluindo alimentos), ambientes e superfície corporal diferem conforme a natureza do microrganismo, bem como do item a ser higienizado. Existe uma variação muito grande entre os microrganismos quanto à sensibilidade aos métodos empregados para o controle e eliminação dos mesmos. Deve-se observar o fato de que, a princípio, o termo “controle” se refere aos métodos que visam reduzir a população microbiana a quantidades toleráveis ou, então, estratégias que impedem a referida população de crescer além dos limites aceitáveis. Já a palavra “eliminação” significa extermínio total dos microrganismos em determinado local. Em uma visão global, os principais métodos físicos e químicos, não quimioterápicos, para o controle e eliminação microbiana serão discutidos a seguir.
3.1 MÉTODOS FÍSICOS Temperatura
O calor constitui um dos mais importantes métodos empregados para o controle do crescimento e para a eliminação de microrganismos. É um dos métodos preferenciais por ser eficiente contra os microrganismos, relativamente seguro para quem o executa, ter custo baixo e por não formar produtos tóxicos. Da mesma forma, o método que se baseia nas baixas temperaturas, se apresenta seguro para quem o utiliza e não forma produtos nocivos.
• Altas temperaturas: o calor aparentemente mata os microrganismos pela desnaturação de suas enzimas, que resulta na mudança tridimensional dessas proteínas, inativando-as. A resistência ao calor varia entre os diferentes microrganismos, e essas diferenças podem ser expressas pelo conceito de ponto de morte térmica (PMT). O PMT é a menor temperatura em que todos os microrganismos em uma suspensão líquida específica serão mortos em 10 minutos. Outro fator a ser considerado no processo de esterilização é o tempo requerido para o material se tornar estéril. Esse período é expresso como tempo de morte térmica (TMT), que designa o tempo mínimo em que todas as bactérias em uma determinada cultura líquida específica serão mortas, em uma determinada temperatura.
A utilização das altas temperaturas se distingue em calor úmido e calor seco. O calor úmido é a água ou o vapor de água à alta temperatura, o qual possui maior poder de penetração comparativamente ao calor seco. O quadro abaixo, especifica as diferentes formas de controle microbiano pelo uso de calor úmido.
A autoclavação requer um equipamento chamado autoclave, e a esterilização é alcançada após 45 minutos a 115ºC, ou 15 minutos a 121ºC.
A pasteurização é um procedimento usado principalmente na indústria, para o tratamento em alimentos e controle da população microbiana, mas preservando boa parte de importantes substâncias nutrientes. O alimento é submetido ao calor, seguido de resfriamento brusco. São basicamente três tipos de pasteurização: temperatura ultra-alta (ultra-high temperature – UHT), 141ºC por 2 segundos; alta temperatura por curto tempo (high temperature short time – HTST), 72ºC por 15 segundos; baixa temperatura (low temperature – LT), 63ºC por 30 minutos.
Entre os métodos de calor seco empregados para o controle dos micro-organismos temos os seguintes:
O calor seco mata os microorganismos por efeitos de oxidação. Uma analogia simples é a lenta carbonização do papel em um forno aquecido, mesmo quando a temperatura permanece abaixo do ponto de ignição do papel. Um dos métodos mais simples de esterilização com calor seco é a chama direta ou flambagem, o qual será utilizado muitas vezes no laboratório de microbiologia para a esterilização das alças de inoculação. E para que o processo de esterilização seja efetivo neste processo, a alça de inoculação deverá ser aquecida até a obtenção de um brilho vermelho (incandescente).
• Baixas temperaturas: atuam principalmente mediante redução da atividade enzimática microbiana, o que diminui sua taxa metabólica e velocidade de crescimento. No geral as baixas temperaturas são utilizadas apenas como método de preservação dos microorganismos, embora, dependendo da intensidade de aplicação, poderá acarretar na morte de alguns microorganismos. Os métodos mais empregados são:
Refrigeração – usado principalmente nas residências e nos estabelecimentos de comercialização de alimentos. Possui efeito bacteriostático e fungiostático, mas na presença de microorganismos psicrófilos e psicotróficos (microorganismos que se multiplicam bem em ambientes refrigerados, sendo os principais agentes de deterioração de carnes e pescados, ovos entre outros) promovem alteração do sabor dos alimentos, após algum tempo. Ex.: Pseudomonas, Yersinia, Enterobacter.
Congelamento – utilizam-se temperaturas abaixo de 0ºC. O congelamento rápido tende a inibir as bactérias sem matá-las (nitrogênio líquido, - 179ºC). No congelamento lento, cristais de gelo se formam e crescem, rompendo as estruturas celulares de bactérias e fungos. O congelamento (em torno de -16 a -20ºC) constitui um eficiente recurso para a conservação de alimentos por longos períodos, sobretudo carnes e derivados.
Radiações
Determinadas radiações eletromagnéticas, ionizantes e não ionizantes são capazes de inativar (matar) de forma eficaz os microrganismos. Possuem dependência de seus afeitos quanto ao comprimento de onda, da intensidade, duração e distância da fonte.
Existem dois tipos de radiação que possuem efeito de esterilização:
A radiação ionizante – são utilizados isótopos radioativos que emitem radiação, como por exemplo, as radiações gama. Esse tipo de radiação possui comprimento de onda mais curto e carrega mais energia do que a radiação não-ionizante. O principal efeito da radiação ionizante é a morte ou inativação do microrganismo, através da destruição do DNA celular. Produtos hospitalares descartáveis como seringas plásticas, luvas, cateteres, fios e suturas são esterilizados por este método. A industria de alimentos renovou recentemente seu interesse no uso da radiação para a conservação de alimentos. Como forma de proteção contra o bioterrorismo, em alguns países os correios usam com frequência essa radiação para esterilizar certos tipos de correspondências.
A radiação não ionizante – utilizam-se radiações com comprimento de onda mais longo (acima de 1 nm), como a luz ultra-violeta (UV), que provoca alteração no DNA. As lâmpadas germicidas são empregadas para o controle dos microrganismos no ar e são encontradas em centros cirúrgicos, enfermarias, berçários, capelas de fluxo laminar, etc. As desvantagens do uso da UV são: baixo poder de penetração, obrigando a exposição direta dos microorganismos aos raios para que sejam mortos (atua somente na superfície dos materiais) e os efeitos nocivos sobre a pele e os olhos. As microondas, também denominadas super high frequency – SHF, não possuem efeito direto sobre os microorganismos, e as bactérias podem ser facilmente isoladas do interior de fornos de microondas recém utilizados. As frequências dos fornos de microondas são ajustados para combinar com os níveis de energia nas moléculas de água, que absorvem a energia e as transferem na forma de calor para o alimento, que irá matar a maioria dos patógenos na forma vegetativa. Os alimentos sólidos se aquecem de modo desigual, devido uma distribuição não homogênea da umidade nos tecidos. Por essa razão, uma carne de porco cozida no forno de microondas pode ocasionar a transmissão de triquinose no homem.
Filtração
Método empregado para remover microorganismos de líquidos, ar e gases. Os filtros de partículas de ar de alta eficiência (high-efficiency particulate air - HEPA) removem quase todos os microorganismos maiores que cerca de 0,3 μm de diâmetro. Atualmente, a descontaminação do ar mediante filtração, realizada em laboratórios de manipulação asséptica, fluxos laminares, salas de cirurgia e outros ambientes hospitalares onde o rigoroso controle microbiológico se faz necessário. Dessecação
Condição conhecida pela remoção da umidade de determinada matéria, e pelo impedimento da mesma em absorver a umidade do ar. Os microorganismos não podem crescer e se reproduzir nesse ambiente seco, mas podem permanecer viáveis por longos períodos. No momento que a água é reintroduzida, podem ser reativados, retomando seu crescimento e divisão. Esse é o princípio da liofilização (congelamento-dessecação), um processo utilizado em laboratórios para a preservação de microorganismos, onde uma suspensão é rapidamente congelada em uma faixa de temperatura de -54ºC a -72ºC, tendo a água removida por alto vácuo (sublimação).
Remoção do oxigênio
Na ausência de oxigênio as bactérias aeróbicas perecem, ou então, formam esporos, caso sejam dotadas dessa capacidade. Essa técnica possui importância prática na indústria alimentícia, a qual utiliza-se de embalagens (ou envasamento) a vácuo como meio de melhorar a conservação de alimentos (carne, legumes, etc).
Pressão osmótica
Técnica que utiliza altas concentrações de sais e açucares para conservar próteses biológicas e alimentos, baseada nos efeitos da pressão osmótica. Altas concentrações de determinadas substâncias criam um ambiente hipertônico que ocasiona a saída de água da célula microbiana. Esse processo lembra o método de conservação por dessecação, pois ambos os métodos retiram da célula a umidade que ela necessita para o crescimento. Lembre-se de que, como regra geral, os fungos e os bolores são muito mais capazes que as bactérias de crescer em materiais com baixa umidade ou com alta pressão osmótica.
3.2 MÉTODOS QUÍMICOS
Os métodos químicos são baseados em substâncias naturais ou sintéticas para eliminar ou inibir o crescimento dos microorganismos em tecidos vivos ou em objetos inanimados. Infelizmente, poucos agentes químicos proporcionam a esterilidade, a maioria apenas reduz as populações microbianas em níveis seguros ou removem as formas vegetativas de patógenos nos objetos. Nenhum desinfetante isolado é apropriado para todas as circunstâncias. Fatores como pH, temperatura, tempo de contato, presença de matéria orgânica (inativa algumas substâncias), fase do ciclo vital do microorganismo, concentração do composto químico e presença de outras substâncias químicas podem influenciar na ação dos agentes antimicrobianos, além da variação na resistência dos microorganismos aos produtos químicos. Outra consideração importante é se o agente químico entrará facilmente em contato com os microorganismos. Uma área pode precisar ser esfregada e lavada antes da aplicação do produto, e em muitos casos haverá a necessidade de deixar o desinfetante em contato com a superfície por várias horas.
• Efeito estático (bacteriostático ou fungiostático) – ocasiona a inibição no crescimento microbiano.
• Efeito microbicida/germicida (bactericida, fungicida, viruscida, protozoocida ou esporocida) – promove a destruição dos microorganismos.
A capacidade de eliminar microorganismos, a rapidez assim como o espectro de ação, define o nível de desinfecção que pode ser alcançado por determinado produto. Tendo em vista isso, podemos classificá-los da seguinte forma:
• Nível baixo – eliminação da maioria das bactérias, de alguns vírus e alguns fungos, sem inativação de microorganismos mais resistentes como micobactérias e formas esporuladas. • Nível intermediário – inativação das formas vegetativas de bactérias, da maioria dos vírus e
maioria dos fungos.
• Nível alto – destruição de todos os microorganismos, com exceção de formas esporuladas. 3.2.1 Tipos de agentes químicos utilizados no controle microbiano
3.2.1.1 Agentes alquilantes
São compostos cancerígenos e, por isso, não devem ser utilizados em tecidos vivos. Por definição, um alquila ou alcoila é um radical monovalente (CnH2n+1) formado pela remoção de um átomo de hidrogênio de um hidrocarboneto saturado. Os principais alquilantes utilizados para o controle dos microorganismos são:
Glutaraldeído: seu mecanismo de ação ocorre através da alteração do DNA e de enzimas. Serve para a desinfecção (de alto nível) e para a esterilização, dependendo da concentração e do tempo de exposição. Possui grande poder de desinfecção em diversos equipamentos cirúrgicos, odontológicos, além de não ser corrosivo. Muito utilizado para materiais termossensíveis. Tem como desvantagens o vapor irritante, odor desagradável, ser carcinogênico e ter a sua eficácia diminuída na presença de matéria orgânica. Um possível substituto do glutaraldeído é o orto-fitalaldeído (OFA) que além de mais efetivo contra a maioria dos miroorganismos, mostra-se pouco irritante.
Formaldeído: atua como desinfetante ou esterilizante, possuindo ótimo efeito sobre bactérias gram-positivas e gram-negativas, além de vírus, fungos, micobactérias e endósporos. Obtem-se a esterilização através da solução alcoólica de formaldeído a 8% ou aquosa a 10%, com exposição mínima de 18 horas. Pode ser usado em instrumental cirúrgico e em acrílicos, mas não deve ser utilizado em alumínio e em borrachas. Apresenta alto poder carcinogênico, e deve ser manuseado usando-se equipamentos de proteção individual (EPIs).
Oxido de etileno (ETO): é um esterilizador gasoso incolor muito eficiente, utilizado principalmente para materiais termossensíveis como as sondas para laparoscopia e artroscopia. Possuí alto poder de penetração, é carcinogênico, exigindo treinamento de pessoal, uso de EPIs e exames bioquímicos de saúde periódicos.
3.2.1.2 Fenóis
O fenol (ácido carbólico) e seus derivados atuam na desnaturação de proteínas, servindo como antimicrobianos. Atualmente, os compostos fenólicos são pouco utilizados, pois irritam a pele e apresentam odor desagradável. Possuem efeitos carcinogênicos, com acentuada toxicidade em felinos e crianças. Um dos compostos fenólicos mais utilizados deriva do alcatrão e são denominadas cresóis. Os cresóis são ótimos desinfetantes de superfície.
3.2.1.3 Bifenóis
São derivados do fenol que possuem dois grupos fenólicos ligados por uma ponte. Um bifenol, o hexaclorofeno é muito utilizado em procedimentos de controle microbiano cirúrgico e hospitalar. Estafilococos e estreptococos gram-positivos, que costumam causar infecções de pele em recém-nascidos, são especialmente susceptíveis ao hexaclorofeno, que é usado com frequência para controlar essas infecções em berçários. Outro bifenol amplamente utilizado é o triclosano, um dos componentes presentes em sabonetes antibacterianos e pastas de dentes. O uso do triclosano foi incorporado em tábuas de cozinha, em cabos de facas e outros utensílios plásticos de cozinha. Seu uso está tão difundido que bactérias resistentes a este agente já foram relatadas. É especialmente efetivo contra bactérias positivas, mas também funciona bem contra fungos e bactérias negativas. Existem algumas exceções, como a Pseudomonasaeruginosa, uma bactéria gram-negativa que é muito resistente ao triclosano, bem como a muitos outros antibióticos e desinfetantes.
3.2.1.4 Biguanida
Apresentam um amplo espectro de atividade, especialmente contra bactérias gram-positivas. As biguanidas são também efetivas contra bactérias gram-negativas, com exceção das pseudomonas. A biguanida mais conhecida é a clorexidina, muito usada na preparação cirúrgica, antissepsia de mãos e para o combate de microrganismos indesejáveis da pele e mucosas. Por possuir ótimo efeito bactericida e ser efetiva contra fungos e vírus, é tida como excelente antisséptico, embora não tenha efeito esporocida. Atua como bom desinfetante de superfícies e materiais diversos e se demonstra eficaz mesmo na presença de matéria orgânica. A alexidina é uma biguanida similar à clorexidina, apresentando, porém, ação mais rápida.
3.2.1.5 Halogênios
Os halogênios (ou halógenos), particularmente o iodo e o cloro, são agentes antimicrobianos eficazes, tanto isoladamente, como constituintes de compostos inorgânicos ou orgânicos.
Cloro ou compostos clorados: são amplamente empregados na desinfecção doméstica, pecuária, industrial, alimentícia e de água, bem como na desinfecção de nível médio na área hospitalar. São efetivos contra os vírus, bactérias gram-positivas e gramnegativas, fungos, e efetividade média como tuberculocidas e esporocidas. Uma grande vantagem é a permanência de atividade residual, e como desvantagens destacam-se a inativação pela matéria orgânica, atividade corrosiva em metais e o efeito descolorante. Os principais compostos clorados com ação desinfetante são: hipoclorito de sódio (água sanitária, líquido de Dakin), hipoclorito de cálcio (alvejantes em pó) e as cloraminas (amônia com cloro).
Iodo: considerado um dos antissépticos mais antigos e eficazes, empregados em feridas e tecidos, agindo contra todos os tipos de bactérias, muitos endósporos, vários fungos e alguns vírus. O iodo pode ser empregado para a desinfecção de equipamentos e superfícies, não sendo seu uso recomendado em metais facilmente oxidáveis ou que mancham facilmente. As soluções à base de iodo são geralmente alcoólicas (álcool etílico 70 com 0,5 a 1% de iodo livre), solução a 2% em água ou emulsões em detergentes (iodopovidona), conhecidas como degermantes. Estas emulsões não são recomendadas para curativos, uma vez que a presença constante do detergente prejudica a cicatrização, entretanto, são indicadas para a antissepsia das mãos, campo operatório e desinfecção de superfícies.
3.2.1.6 Peroxigênios (peróxido de hidrogênio, ácido peracético e ozônio)
São agentes químicos oxidantes que exercem ação na membrana citoplasmática, no DNA e em outros componentes celulares.
Peróxido de hidrogênio (H2 O 2 ): conhecido como água oxigenada, a substância é utilizada como desinfetante de filtros e tubulações na indústria de alimentos. Possui ampla aplicação na limpeza e desinfecção hospitalar e como antisséptico de feridas.
Ácido paracético: possui odor de vinagre, sendo eficiente para a desinfecção de materiais e instrumentos, sendo pouco afetado pela presença de matéria orgânica. Atua bem em temperaturas de 10 a 40ºC.
Ozônio (O3 ): trata-se de um composto derivado do oxigênio, usado geralmente para a desinfecção de água. Possui efeito germicida e não apresenta toxicidade ao homem e animais.
3.2.1.7 Alcoóis
O mecanismo de ação do álcool é a desnaturação de proteínas, mas também pode romper membranas e dissolver lipídeos, inclusive o componente lipídico dos vírus envelopados. Agem efetivamente contra as bactérias, fungos, mas não contra endósporos e vírus não envelopados. Os dois alcoóis mais comumente utilizados são o etanol e o isopropanol. A concentração ótima para o etanol (etílico) é de 70%, enquanto que para o isopropanol ((isopropílico) é de 90%. Os alcoóis têm a vantagem de agir e então evaporar rapidamente, sem deixar resíduos. Quando a pele é degerminada antes de uma injeção, a atividade de controle microbiano provém do fato de simplesmente remover a poeira e os microorganismos junto com os óleos cutâneos (limpa). Contudo, os alcoóis não são antissépticos satisfatórios quando aplicados em feridas, pois causam a coagulação de uma camada de proteínas, sob a qual as bactérias continuam a proliferar.
Como antisséptico das mãos, o álcool em gel apresenta determinadas vantagens sobre o líquido, as quais destacam-se:
- o gel retém certo grau de moléculas de álcool, com a volatilidade reduzida, possibilita maior tempo de ação.
- adesão do gel nas mãos, prolongando a ação do álcool;
- o gel protege a pele do ressecamento promovido pelo álcool líquido; - o gel é menos inflamável, evitando acidentes com queimaduras;
- mais fácil no acondicionamento, na medida que o gel não vaza facilmente. 3.2.1.8 Corantes
O azul de metileno e o cristal violeta (violeta genciana) constituem-se nos principais corantes antimicrobianos, atuando por inibição da síntese da parede celular.
3.2.1.9 Agentes de superfície (tensoativos ou surfactante)
Os agentes de superfície podem reduzir a tensão superficial entre moléculas de um líquido. Esses agentes incluem os sabões e os detergentes.
Sabões e detergentes: possuem pouco valor como antisséptico, mas tem uma importante função na remoção mecânica dos microorganismos. A pele geralmente possui células mortas, pó, suor seco, microorganismos e óleos, provindos das gl\ãndulas sebáceas. Os sabões rompem o filme oleoso em pequenas gotículas, denominadas emulsificação, que juntamente com a água, removem os resíduos
à medida que a pele é lavada. Nesse sentido, os sabões funcionam como bons agentes degerminantes.
Compostos quaternários de amônia (QUATs): possuem excelente ação bactericida contra as gram-positivas e, bom poder bactericida contra as gram-negativas, sendo efetivos contra vírus envelopados (lipofílicos), as amebas e alguns fungos. São ineficazes contra vírus não envelopados (hidrifílicos), micobactérias e esporos. A presença de matéria orgânica limita a ação dos compostos deste grupo. Dois QUATs populares são o cloreto de benzalcônio e o cloreto de cetilpiridínico.
4 PROCESSOS FERMENTATIVOS 4.1 CONCEITOS E FUNDAMENTOS
Denomina-se fermentação alcoólica a transformação dos açúcares monossacarídeos (até 6 carbonos) em álcool etílico (etanol) e gás carbônico (CO2) pela ação de um determinado grupo de
microrganismos, geralmente as leveduras, que elaboram enzimas responsáveis por esta fermentação. A fermentação alcoólica tem seu início devido à ação das leveduras que usam os açúcares do mosto para seu crescimento e multiplicação, dando como resultado a formação de álcool e gás carbônico. Enquanto existe oxigênio no mosto, a levedura cresce e se multiplica; quando este acaba, começa a produção de etanol e gás carbônico (CO2).
A fermentação alcoólica é um processo anaeróbico que ocorre com a transformação de açúcares, em etanol e CO2, catalisado por enzimas. Este processo é realizado principalmente por
leveduras (Sacharomices cerevisae), em nível citoplasmático, com o objetivo de produzir energia, a qual será empregada na realização de suas atividades fisiológicas, e ainda para seu crescimento e reprodução, sendo, o etanol, tão somente, um subproduto desse processo (LIMA et al, 2001).
Apesar de haver, durante a fermentação alcoólica, uma série de reações químicas intermediárias, a reação que mostra o produto inicial e os produtos finais desta fermentação é a seguinte:
C6H12O6 ---> 2 C2H5OH + 2 CO2
aç. monos. etanol gás carbônico
A transformação do açúcar em etanol e gás carbônico envolve onze reações em seqüência ordenada conhecida como via glicolítica ou via EMP (Embden-Meyerhof- Parnas), onde cada reação é catalisada por uma enzima específica. Essas enzimas glicolíticas sofrem ações de diversos fatores (nutrientes, minerais, vitaminas, inibidores, substâncias do próprio metabolismo, pH, temperatura e outros), alguns que estimulam e outros que reprimem a ação enzimática, afetando o desempenho do processo fermentativo conduzido pelas leveduras. Na figura abaixo se pode observar as reações que ocorrem no processo fermentativo, e as enzimas responsáveis por cada uma delas.
Qualquer produto que contenha açúcar ou outro carboidrato constitui-se em matéria-prima para obtenção de etanol. Os substratos (mostos) devem ser adequados ao desenvolvimento do microrganismo e à finalidade de sua atividade, que é produzir uma determinada substância. Além de uma composição capaz de suprir as exigências do microrganismo, para seu melhor desempenho, deve estar devidamente condicionado em termos de pH, temperatura, assepsia ou esterilidade (LIMA et al, 2001).
4.2 PRODUTOS DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
Dos produtos obtidos pela fermentação alcoólica, quimicamente falando, o álcool etílico é o principal deles, seguido do gás carbônico e de outros produtos secundários, que aparecem em maior ou menor quantidade, dependendo de vários fatores, entre os quais evidenciam-se: matéria-prima, levedura, condução da fermentação, higiene na produção etc.
