As características do IVL emitido pelo material foram testadas (radiômetro e FT- IR espectrofotômetro) por dois institutos independentes de medidas (Institute for Technological Research, SP - Brazil e Korea Institute of Far Infrared Applied Estimation, Seokchon-Dong, Songpa-GU - South Korea), e estão descritas na tabela 2. Esta mesma tabela mostra os parâmetros de dosimetria de radiação, estimados com base nos parâmetros físicos do tecido, na área de tecido utilizado para a confecção do traje e o tempo de uso diário do traje de cada voluntário. Os voluntários foram questionados quanto ao tempo diário sem o uso do traje experimental, e declararam só terem-no removido para a prática de atividade física e práticas de higiene pessoal. O tempo médio e desvio padrão de uso de traje também estão descritos na tabela 2.
Estudo 1. TABELA 2. Parâmetros de radiação traje IVL
Irradiância emitida (35°C) 134 ± 6 µW/cm2
Comprimento de onda 5 - 20 µm
Área do corpo 8000 cm2
Emissão (potência) 1,07 ± 0,05 W
Tempo de exposição 91 ± 1 horas
Energia emitida total 350 ± 6 kJ
Energia emitida total/área 44 ± 1 J/cm2
Dados apresentados em média ± desvio padrão. W, watts; KJ, quilo joules; J, joules. É importante destacar que as estimativas de dosimetria foram feitas baseadas em uma irradiância mensurada a 35°C o que limita a exatidão desses números, visto que a quantidade de energia irradiada aumenta a quarta potência para cada grau célsius de
aumento na temperatura do material. B A
5.2.4 Teste progressivo até a exaustão
O teste foi realizado no ciclo simulador (ComputrainerTM, RacerMate®, Seattle, USA) com coleta contínua das trocas gasosas, onde foram analisados o consumo de oxigênio (V̇O2), o dióxido de carbono produzido (V̇CO2) e a ventilação (V̇E) (CPX UltimaTM,
Medgraphics®, Minnesota, EUA). A frequência cardíaca (FC) foi mensurada continuamente por um transmissor cardio-frequencímetro (Polar, Kempele, Finlândia). A percepção subjetiva de esforço (PSE) foi registrada 10 segundos antes de cada mudança de intensidade, sendo utilizada uma escala de 6 – 20 pontos (BORG, 1982).
Anteriormente ao teste, a bicicleta padrão do próprio ciclo simulador teve o pneu calibrado com pressão de 100 a 110 libras, o câmbio foi mantido na relação 54x17 e o rolo do ciclo simulador foi aquecido e calibrado conforme recomendação do fabricante (RacerMate®, ComputrainerTM, Seattle, USA). Em seguida, foram feitos os ajustes de altura do banco e posição horizontal de banco e guidão, de acordo com as dimensões corporais do voluntário, e estas informações foram anotadas para uso nos demais testes. Simultaneamente à preparação do ciclo simulador, o analisador de gases foi calibrado, também seguindo recomendações do fabricante (Medgraphics®, Minnesota, EUA). Os procedimentos de calibração do ciclo simulador e analisador automático de gases foram repetidos de maneira idêntica, antes de todos os testes (progressivos e experimentais), para cada voluntário.
O protocolo consistiu em 5 minutos de repouso, 5 minutos de aquecimento à 50W, seguidos de acréscimos de 25W a cada minuto, até que o voluntário não conseguisse manter a frequência do pedal na faixa de 65-75 rotações por minuto (rpm). Quando não foi possível manter a cadência dentro desse intervalo, foram dadas duas tentativas, acompanhadas de forte encorajamento verbal, para que a cadência fosse reestabelecida para o intervalo preconizado. O teste foi interrompido quando o voluntário não conseguiu manter a cadência dentro do intervalo numa terceira ocasião, sendo este momento considerado como exaustão física (o critério de exaustão foi utilizado para o teste progressivo e também os protocolos experimentais). Seguiu-se um período de 2 a 5 minutos de recuperação ainda na bicicleta.
O consumo máximo de oxigênio identificado nos testes progressivos até a exaustão foi considerado válido, quando, pelo menos, dois dos seguintes critérios foram atendidos: 1) Ocorrência de platô do V̇O2, definido como um aumento inferior a 2.1
ml/kg/min no V̇O2 mesmo com incremento da carga; 2) Razão de trocas respiratórias (RER) ≥
idade); 4) PSE registrada no último estágio completo ≥ 18 pontos. Estes critérios foram baseados no trabalho de Howley, Bassett e Welch (1995).
Para a análise de cada teste, os dados foram extraídos do software do analisador de gases e filtrados, utilizando média móvel de 5 pontos. O consumo máximo de oxigênio (V̇O2pico) foi definido como o maior valor alcançado durante o teste. A potência máxima
(Ppico) foi calculada através da equação 1 (KUIPERS et al., 1985):
Ppico = Wc + [(t/60) . Wi] (Eq. 1)
Onde: Wc é o valor da carga do último estágio completado, t é o tempo (segundos) em que o participante permaneceu no estágio incompleto, 60 é a duração (segundos) de cada estágio e Wi é o incremento de potência
entre os estágios (25W).
Foram realizados dois testes progressivos até a exaustão, no intuído de melhorar a qualidade da avaliação, visto que os parâmetros identificados foram usados na prescrição das intensidades do exercício; foram utilizados os valores do teste com maior Ppico. O limiar
ventilatório (LV) e o ponto de compensação respiratória (PCR) foram avaliados de maneira independente por dois pesquisadores experientes, sendo: o ponto de perda de linearidade da relação V̇E/V̇O2 e o ponto de perda de linearidade da relação V̇E/V̇CO2 associado à primeira
queda na fração de V̇CO2, respectivamente (MEYER et al., 2005). Em caso de discordância,
um terceiro pesquisador foi consultado.
5.2.5 Avaliação da temperatura superficial da coxa
Foram feitas medidas da temperatura da coxa nos momentos pré-teste e após a exaustão (ponto de medida com 0,5 cm de diâmetro localizado no ponto médio-lateral da coxa) para ambas as condições: IVL e Placebo. A medida da temperatura foi feita por termômetro infravermelho, com precisão de 0,2°C (Thermofocus® - TECNIMED, srl, Vedano Olona, Varese, Itália). Para as medidas pré-testes, o voluntário aguardou 5 minutos sentado, em repouso, em um ambiente de temperatura controlada (22°C). As medidas após exaustão foram feitas 5 min após o fim do exercício. A distância entre o voluntário e o termômetro foi mantida ótima, de acordo com as indicações do próprio equipamento, em todos os momentos e condições.
5.2.6 Análise do lactato sanguíneo
Para análise da concentração sanguínea de lactato ([Lac]), foram coletadas amostras de 25μl de sangue da falange distal dos dedos da mão por punção com lancetas descartáveis, após assepsia do local com álcool 70°GL. As amostras de sangue foram imediatamente colocadas em microtubos contendo 25μl de fluoreto de sódio (NaF) 1g%, e mantidas em gelo até o final da sessão, em seguida foram centrifugadas por 5 min a 5000rpm (Centrífuga Excelsa Baby I, Fanem®, São Paulo, Brasil). O plasma sobrenadante foi separado e armazenado a -80º C para posterior análise. A concentração de lactato foi analisada com o uso de Kits comerciais (Biotecnica®, São Paulo, Brasil) e espectrofotômetro (ELx800, Biotek®, Vermont, USA), como descrito anteriormente (CONCEIÇÃO et al., 2016). O erro típico e coeficiente de variação para esta medida é de 0,07 mmol/L e 5,2%.
5.2.7 Coleta e processamento das amostras de sangue venoso
As amostras de sangue venoso foram coletadas por punção venosa a vácuo e o soro ou plasma separados foram armazenados a -80ºC até o momento das análises. Para as análises de NO, o plasma foi obtido após centrifugação a 3000 rpm, a 4ºC, por 5 minutos, de amostras de 4 mL de sangue coletadas em tubo contendo heparina lítica. As análises dos F2-
isoprostanes totais foram feitas em soro, obtido por centrifugação a 3000 rpm, por 10 minutos, de amostras de 8 mL de sangue coletado em tubo seco com separador de silicone, e após ser mantido por 30 minutos em temperatura ambiente para coagulação. Já para as análises dos marcadores de defesa antioxidante, foi utilizado plasma obtido de 6 ml de sangue coletado em tubo contendo EDTA, que foi centrifugado a 3000 rpm em 4ºC durante 10 minutos.
5.2.8 Determinação da concentração plasmática de Óxido Nítrico
A quantificação de óxido nítrico (NO) foi realizada no sobrenadante das amostras de plasma (heparina), após desproteinização com etanol (proporção 1:2), em banho de gelo por 30 minutos e centrifugação a 14.000 rpm por 5 minutos. A dosagem foi realizada, em duplicata, através da quantificação de NOx, que é a soma do NO proveniente de reação de redução de nitrito e nitrato, produtos da degradação do NO, pela técnica de
quimioluminescência (PELLETIER et al., 2006) no equipamento Sievers NO Analyzer (GE, Boulder, USA). Nitrito e nitrato foram reduzidos com solução de iodeto de sódio e cloreto de vanádio III, respectivamente, formando NO (gás). Os valores de concentração do NO foram calculados com base em uma curva padrão de oito pontos, entre 10 nM e 100 µM.
5.2.9 Análise de Estresse oxidativo: F2-isoprostanes totais
O estresse oxidativo foi determinado através da análise dos F2-isoprostanes totais,
como marcadores de peroxidação lipídica, utilizando-se o método descrito por Briskey et al (2014). As amostras de soro, analisadas em duplicatas, foram saponitificadas com NaOH e marcadas com o padrão interno 8-iso prostaglandina F2α-d4 (Cayman Chemicals, EUA).
Após acidificação da amostra, o isoprostano marcado foi extraído do soro com subsequentes etapas de precipitação e centrifugação com hexano e acetato de etila, e foi seco com nitrogênio. Após reconstituição da amostra com acetonitrila, foi realizado o processo de derivação com brometo de pentafluorobenzilo e diisopropiletilamina. Em seguida as amostras foram secas em nitrogênio e incubadas com piridina bis (trimetilsilil), trifluoroacetamida e trimetilclorossilano. Em seguida, as amostras foram diluídas em hexano e analisadas no equipamento de cromatografia gasosa acoplado a espectrômetro de massa tandem (Varian, Austrália) em modo de ionização química negativa. O coeficiente de variação do método é de 4,5%.
5.2.10 Análise da Defesa antioxidante
A capacidade antioxidante total inespecífica (CAT) e a defesa antioxidante enzimática, medida pela atividade da Glutationa Peroxidase (GPx), foram analisadas, em duplicata, em amostras de plasma. A CAT foi avaliada utilizando-se uma versão adaptada da técnica descrita por Rice Evans e Miller (1994), que utiliza a determinação do cátion ABTSº+, resultante da reação do ácido 2,2'-azino-di-(3-etilbenztiazolina-6-sulfónico) (ABTS) com ferromioglobina e peróxido de hidrogênio, na presença de peroxidase. O cátion ABTSº+ absorve em 600 nm, e a capacidade antioxidante do plasma aumenta a extinção do composto. A absorção do cátion ABTSº+ foi determinada no espectrofotômetro automatizado (Cobas, Mira, Roche Diagnostics, Suíça), e o antioxidante Trolox foi usado como padrão na faixa de concentração de 0,5 a 2,5 mM. A CAT é expressa como unidades de capacidade antioxidante equivalente de trolox (TEAC). O coeficiente de variação laboratorial foi de 1,9%. A atividade
da glutationa peroxidase plasmática foi determinada em duplicata, através da medida do decréscimo da absorbância, em 340 nm, do NADPH, que é oxidado para NADP+ na reação que converte glutationa oxidada para glutationa reduzida, catalisada pela enzima glutationa peroxidase. O método foi modificado a partir daqueles desenvolvidos por Andersen et al. (1997) e Wheeler et al. (1990). Foi utilizado o aparelho espectrofotômetro automático Cobas Mira (Roche Diagnostics, Suíça) e o coeficiente de variação laboratorial foi de 2,4%.
5.2.11 Cálculo da contribuição dos sistemas energéticos e gasto energético total
As contribuições dos sistemas energéticos e o gasto energético total foram estimados de acordo com Bertuzzi et al. (2016), utilizando o software GEDAE-Lab
(http://www.gedaelab.org/). A contribuição do sistema energético aeróbio (AMET) foi
calculada como a área sobre a curva do V̇O2 ao longo do tempo de exercício (utilizando o
método trapezoidal), da qual o valor de V̇O2 da linha de base correspondente ao tempo total
de exercício foi subtraído. Para estimar a contribuição do sistema energético anaeróbio alático (ALMET), foi utilizado o modelo matemático ou biexponencial (eq. 2) para ajustar V̇O2 da
recuperação após cada exercício, considerando a cinética rápida V̇O2 pós-exercício, sendo o
valor de amplitude multiplicado pela constante de tempo (eq. 3). Para calcular a contribuição do sistema energético anaeróbio lático (LAMET), o lactato acumulado (Δ[Lac] - pico de lactato
menos lactato da linha de base) foi multiplicado pelo equivalente energético de oxigênio para o lactato (3 ml O2.kg-1) e pela massa corporal do sujeito. O gasto energético total (GEtotal) foi
calculado como a soma dos três sistemas energéticos. Por fim, a contribuição dos três sistemas energéticos também foi expressa como percentual do GEtotal.
V̇O2(t) = V̇O2linha de base + A1[e-(t-td)/t1] + A2[e-(t-td)/t2] (Eq. 2)
ALMET = A1 . t1 (Eq. 3)
Onde: V̇O2(t) é o consumo de oxigênio em determinado tempo, V̇O2linha de base é o consumo de oxigênio na linha de
base, A é a amplitude, td é o tempo de atraso, t é a constante de tempo, 1 e 2 representam os componentes rápido e lento da cinética do consumo de oxigênio pós-exercício, e ALMET é a estimativa do sistema energético
5.2.12 Análise estatística
Inicialmente a normalidade dos dados foi confirmada utilizando o teste Shapiro- Wilk. Em seguida, o teste-T pareado foi aplicado para verificar as possíveis diferenças entre as condições (IVL e Placebo) para as variáveis Tlim e os dados de contribuição dos sistemas energéticos (AMET, ALMET e LAMET) e GETOTAL. Para as comparações entre as condições (IVL
e Placebo) e tempos (pré- e pós-teste) para as variáveis temperatura, V̇O2, V̇E e FC, NO
(Nitrito, Nitrato e NOx), F2-isoprostanes totais, CAT e GPx, foi utilizada a análise de
variância de dois caminhos (ANOVA two way) para medidas repetidas. Quando encontrado efeito de interação (condição X tempo), foi utilizado o teste Post Hoc de Bonferroni. Para todas as análises estatísticas foi utilizado o software STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA). Os dados estão apresentados em média e desvio padrão, e o valor de significância adotado para todas as comparações foram de p<0,05.
5.3 Resultados
Os resultados de Ppico atingidos no teste e reteste progressivo até a exaustão foram
utilizados para o cálculo do erro típico (ET) e do coeficiente de correlação intercalasse (CCI), demonstrando um ET de 8,7W e CCI de 0,94, considerado excelente. Não houve diferenças tanto na ingesta de macronutrientes (carboidratos: 539 ± 160 vs. 557 ± 175 g P = 0,64; lipídeos: 125 ± 37 vs. 124 ± 43 g P = 0,95; Proteínas: 202 ± 57 vs. 195 ± 45 g P = 0,49;), quanto de calorias totais (4535 ± 2332 vs. 4568 ± 2338 kcal P = 0,88) nas 48 horas que precederam as visitas experimentais. O Tlim médio observado de 387 ± 129 segundos está em acordo com a duração esperada para exercícios no domínio de intensidade muito pesada (Özyener et al., 2001; Hill, 1993).
5.3.1 Efeito do IVL sobre o Tlim e temperatura da coxa
O desempenho médio e individual com ambos os trajes pode ser observado na figura 3A. O uso do traje IVL resultou no aumento de ~25% no Tlim (Placebo = 347 ± 114 segundo; IVL = 428 ± 134 segundos; p = 0,0005). A análise dos desempenhos individuais revela que 11 voluntários apresentaram aumento marcante, dois apresentaram discretas mudanças e um apresentou piora do Tlim com o traje IVL (figura 3A). A análise dos dados de
temperatura da coxa não indicou interação condição X tempo (p = 0,12), sendo apontado somente efeito principal de tempo (p = 0,05) (figura 3B).
Estudo 1. Figura 3. Desempenho (Tlim) médio e individual no exercício