Medidas Antropométricas [3]

Foi realizada uma avaliação antropométrica para determinação da massa corporal, da estatura e da densidade corporal, sendo que, para este último, foram medidas as dobras cutâneas triciptal, subescapular, peitoral, axilar, abdominal, suprailíaca e da coxa (JACKSON; POLLOCK, 1985), utilizando um plicômetro científico (Premium da Cescorf) com precisão de 0,1mm. Em seguida, foi calculada a gordura corporal relativa, utilizando a fórmula de Siri (1993).

4.2.17 Eletromiografia de superfície [3]

Para a coleta dos sinais eletromiográficos, foi utilizado o eletromiógrafo da marca Biopac (Biopac System, Inc., Santa Barbara, CA, USA), modelo MP150, de 16 canais, e eletrodos ativos (Biopac System, Inc., CA, USA), modelo TSD-150, com relação de rejeição do modo comum (CMRR) de >95 dB. Para a captação e processamento dos sinais, foi utilizado o software AcqKnowledge 3.8.1 (Biopac System, Inc., Santa Barbara, CA, USA). A frequência de aquisição dos sinais eletromiográficos foi de 2000 Hz e o filtro passa-banda de 20-500 Hz.

Após tricotomia para a remoção de pilosidade e de células mortas, os eletrodos foram fixados com fita adesiva sobre a pele nos postos referentes aos músculos reto femoral, vasto lateral e vasto medial do membro direito do voluntário, conforme recomendação de “SENIAM – Surface ElectroMyoGraphy for the Non-Invasive Assessment of Muscles” (HERMENS et al., 2000), mantendo a distância fixa entre eletrodos de dois centímetros (centro a centro). O eletrodo de referência foi posicionado na espinha ilíaca ântero-superior do quadril direito do voluntário. Os arquivos gerados foram extraídos do software AcqKnowledge e analisados por rotinas customizadas no software MATLAB (Math Works Inc., versão 8.5.0 - R 2015a), de modo a calcular o RMS, com janelamento de 100 bursts, de cada parcial de 400 metros, que foi normalizada pelo RMS do aquecimento de 5 minutos à 150W. No intuito de reportar a RMS do conjunto dos músculos extensores do joelho, foi feita a média da RMS do sinal eletromiográfico normalizado dos músculos reto femoral, vasto lateral e vasto medial.

4.2.18 Análise Estatística [1, 2 e 3]

Cada um dos três estudos apresenta características diferentes de desenho experimental, o que refletiu sobre a estratégia especifica de análise estatística. Em linhas gerais, para todos os estudos, a distribuição dos dados foi analisada pelo teste Shapiro-Wilk. Dados com distribuição não paramétrica foram Log (=log(x)) transformados. Para as comparações entre as condições IVL e Placebo em caso de variáveis com apenas um dado por condição, o teste-T pareado foi utilizado. Já no caso de variáveis com mais de um dado (diferentes tempos) por condição, foi utilizada a análise de variância de dois caminhos (ANOVA two way) para medidas repetidas. Quando encontrado efeito de interação (condição X tempo), foi utilizado o teste Post Hoc de Bonferroni. Para todas as análises estatísticas, foi utilizado software STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA). Os dados são apresentados em média e desvio padrão e o valor de significância adotado para todas as comparações foi de p ≤ 0,05.

Para o estudo do painel metabolômico, foi também realizada a analise multivariada. Esta ferramenta foi utilizada para selecionar vias metabólicas com maior probabilidade de relação com os efeitos da nossa intervenção, de forma a evitar o erro do tipo 1 (falso positivo) e reduzir drasticamente o número de comparações. Para tal, primeiramente, foi corrigida a heterocedasticidade, considerando que os valores de cada metabólito foram submetidos a uma transformação logarítmica (Log10) para obter maior simetria entre as curvas de distribuição dos dados. Devido à grande variabilidade entre os valores dos metabólitos identificados e para torna-los padronizados e comparáveis, foi aplicado o processamento por meio da técnica pareto scaling. O valor de metabólito foi ajustado para uma amostra específica pela diferença entre seu respectivo valor e a média de todas as amostras deste metabólito, seguido da divisão pela raiz quadrada do desvio padrão deste conjunto de amostras (VAN DEN BERG et al., 2006).

Em seguida, com o intuito de inspecionar o perfil metabolômico de cada condição, os dados pré e pós-exercício de cada intensidade para cada condição foram utilizados para conduzir uma análise discriminante (2 a 2) por mínimos quadrados parciais (PLS-DA), a qual é uma técnica supervisionada que permite uma segregação específica das classes, facilitando a visualização dos dados. Os modelos PLS-DA foram gerados a partir dos dados de concentração (mM) dos metabólitos. A robustez do modelo PLS-DA foi validada utilizando dois parâmetros, R2, que significa a variação total explicada nos dados, enquanto

que o Q2 explica a previsibilidade do modelo, para que este seja capaz de predizer a classificação dos grupos.

Os metabólitos que apresentaram maior discriminação entre os grupos em cada modelo foram evidenciados no gráfico VIP (“variable importance in projection”) score, que representa a contribuição das variáveis espectrais na segregação dos grupos. Foram selecionados os metabólitos que possuíam score acima de 1 para análises univariadas (ANOVA como descrito no primeiro parágrafo deste tópico), por serem estes os de maior contribuição para a segregação dos grupos no modelo. Os metabolitos que apresentaram interação condição X tempo foram utilizados para a Pathway Analysis, gerando o gráfico de vias metabólicas que mais se relacionaram com os efeitos do IVL em cada intensidade de exercício. Esta análise é uma junção da análise de enriquecimento das vias metabólicas (Pathway Enrichment Analysis), representada no eixo y, com a análise topológica das vias metabólicas (Pathway Topological Analysis), representada no eixo x. O impacto de uma via é medido pelos resultados do enriquecimento e da centralidade de um metabólito em determinada via metabólica.

Por fim, as vias metabólicas relacionadas a cada intensidade foram inspecionadas e os metabolitos comuns ao nosso painel dados metabolômico foram comparados através da ANOVA. As vias localizadas muito próximas à intersecção dos eixos, as quais, portanto, tiveram mínimo impacto, foram desconsideradas na inspeção visual. As análises foram realizadas na plataforma on-line MetaboAnalyst 4.0 (open acess) (XIA et al., 2015; XIA; WISHART, 2011) e, para a inspeção visual, ainda foram utilizados o site hmdb - Human Metabolome Database - (http://www.hmdb.ca/) (WISHART et al., 2018) e SMPDB - The Small Molecule Pathway Database – (http://smpdb.ca/) (JEWISON et al., 2014).

5 ESTUDO 1

TECIDO EMISSOR DE INFRAVERMELHO LONGO MELHORA CONTRIBUIÇÃO AERÓBIA, ESTRESSE OXIDATIVO E TOLERÂNCIA AO EXERCÍCIO, MAS NÃO

A BIODISPONIBILIDADE DE ÓXIDO NÍTRICO

5.1 Introdução

Estudos recentes mostram que os efeitos biológicos positivos das radiações solares vão muito além do metabolismo da vitamina D (BAROLET; CHRISTIANES; HAMBLIN, 2016; LINDQVIST, 2018; TSAI; HAMBLIN, 2017; WELLLER 2016). Um efeito intrigante é o aumento da disponibilidade de óxido nítrico (NO) a partir da fotólise de compostos nitrosilados cutâneos pela radiação UVA, levando a vasodilatação e redução da pressão arterial (LINDQVIST, 2018; LIU et al., 2014; MONAGHAN et al., 2018). Outra radiação com aplicações surpreendentes é a radiação infravermelho (IV), que tem mostrado efeitos positivos (fotobiomodulação) sobre processos fisiológicos, como cicatrização, dor, vasodilatação, função cognitiva e na melhora do desempenho muscular (FERRARESI; HUANG; HAMBLIN, 2016; HAMBLIN, 2016; NAMPO et al., 2016; SALEHPOUR et al., 2018; TSAI; HAMBLIN, 2017; YU et al., 2006). Estes efeitos são causados pela absorção da energia irradiada por estruturas celulares fotorreceptoras, como canais iônicos, enzimas e a própria água, que traduzem esse sinal fotônico em sinalização celular (BASHKATOV, et al., 2005; PASSARELLA; KARU, 2014). Esta sinalização celular ocorre, por exemplo, através de estímulos para produção de ATP e aumento da disponibilidade de Ca2+, inositol fosfatos e NO (DITTAMI et al., 2011; FERRARESI et al., 2016b; IRVINE; SCHELL, 2001; KARU, 2008; MITCHELL; MACK, 2013).

Os mecanismos de fotobiomodulação do IV sobre o músculo esquelético apontam para o potencial deste na melhora do desempenho aeróbio de alta intensidade (intensidade > limiar anaeróbio), visto que nesta tarefa a fadiga está associada a fatores periféricos, como alterações metabólicas (lactato, fosfocreatina e fosfato), estresse oxidativo e perturbações iônicas (Ca2+, Cl-, H+, K+, Mg2+ e Na+) (BLACK et al., 2017; HOSTRUP; BANGSBO, 2017; REID, 2001b; 2016b; THOMAS et al., 2016; THOMAS et al., 2015), que poderiam ser moduladas pelo IV. Entre os fatores que poderiam amenizar a fadiga, estão a melhora da função de canais iônicos, trânsito de Ca2+ (DITTAMI et al., 2011), e principalmente, o

aumento da oferta de ATP via efeito do IV sobre a citocromo C oxidase (FERRARESI et al., 2016b), ou aumento de NO (IKEDA et al., 2005; MITCHELL; MACK, 2013), induzindo melhora na eficiência mitocondrial (LARSEN et al., 2011). Um segundo sitio de atuação do IV seria a vasodilatação induzida pelo NO (FERGUSON et al., 2013; IKEDA et al., 2005; MITCHELL; MACK, 2013). O aumento de vasodilatação facilitaria o aporte de O2 e

substratos, melhorando a biogenética e a depuração de metabólitos e íons capazes de estimularem os neurônios aferentes musculares do grupo III/IV, que modulam sensação de dor, e funções cardiorrespiratórios e neuromusculares críticas para a tolerância ao esforço (AMANN et al., 2011; POLLAK et al., 2014).

De fato, o aumento da biodisponibilidade de NO resultou na melhora do desempenho, em estudos com suplementação de Nitrato ou suco de beterraba (VAN DE WALLE; VUKOVICH, 2018). Estes trabalhos, além de mostrarem o aumento do tempo até exaustão (Tlim) em exercícios de alta intensidade, mostraram também melhora da cinética do V̇O2 e da eficiência muscular e bioenergética durante o exercício (BAILEY et al., 2009;

LANSLEY et al., 2011; LARSEN et al., 2011). Em relação ao mecanismo fisiológico que associa NO à melhora de desempenho, Larsen et al (2011), em experimento ex-vivo com biópsias humanas, mostrou que o NO pode afetar diretamente a bioenergética celular. Os autores observaram que o NO aumentou a eficiência mitocondrial, via aumento da atividade da citocromo C oxidase e a produção de ATP, que por sua vez melhorou a cinética do V̇O2

durante o exercício. Neste contexto, os efeitos do IV na melhora do desempenho de alta intensidade foram recentemente demonstrados tanto em corredores (FERRARESI et al., 2015a; FERREIRA JUNIOR et al., 2018), quanto em ciclistas (LANFERDINI et al., 2018a, b), assim como nos estudos com suplementação de Nitrato, que resultou na melhora da cinética do V̇O2 (FERRARESI et al., 2015a; LANFERDINI et al., 2018b). Embora nenhum

dos estudos tenha avaliado a disponibilidade de NO, o que impossibilita a associação entre IV, aumento do NO, melhora de bioenergética e desempenho, esta emerge como uma interessante hipótese.

Por fim, sobre a construção da hipótese acima, é importante observar que (1) pouco se sabe sobre as alterações causadas pelo IV na biodisponibilidade de NO, tanto na quantidade quanto nos efeitos, sobre a fisiologia humana (sinalização celular VS. espécies reativas de nitrogênio). Este fato merece atenção, diante do possível aumento de estresse oxidativo e nitrosativo causado pelo NO, que ainda poderia ser exacerbado durante o exercício, e está diretamente relacionado à fadiga periférica (FERREIRA; REID, 2008;

HAMBLIN, 2018; POWERS; LENNON, 1999; REID, 2001b, 2016a). Além disso, (2) os estudos sobre o efeito do IV no exercício de alta intensidade utilizam dispositivos fototerápicos (Lasers e LEDs), que têm mobilidade reduzida por serem dependentes de energia elétrica, irradiam IV curto (0,7-1,4 μm), relacionado ao aumento da temperatura corporal (PAOLILLO et al., 2013b), o que por si só pode levar a vasodilatação e efeitos positivos sobre a mitocôndria (IKEDA et al., 2005; LIU; BROOKS, 2012), impedindo a real constatação dos efeitos do IV.

Neste contexto, tecidos impregnados com nanopartículas de material cerâmico, as quais, sem uso de qualquer fonte elétrica, absorvem energia do ambiente (ex. calor) e a reemite na forma de radiação infravermelha longa (IVL: 3-100 μm) (LEUNG, 2015; VATANSEVER; HAMBLIN, 2012), parecem ser uma boa estratégia para a irradiação com IV, por permitir total mobilidade e não promover alterações na temperatura da área irradiada (LEUNG, 2015; VATANSEVER; HAMBLIN, 2012). Contudo, embora um estudo de contração muscular em modelo ex-vivo tenha mostrado a eficiência de aplicação dessa fonte de IVL sobre acidose e retardo da fadiga, e esses eventos tenham sido acompanhados de aumento do NO (LEUNG et al., 2011), os efeitos do IVL sobre o desempenho aeróbio de alta intensidade em humanos nunca foram estudados.

Desta forma, o presente trabalho testa o uso do traje emissor de IVL na melhora do desempenho aeróbio de alta intensidade, e seus efeitos sobre a bioenergética, temperatura, biodisponibilidade de NO, estresse oxidativo e nitrosativo e defesa antioxidante.

5.2 Métodos 5.2.1 Amostra

O cálculo amostral foi realizado pelo software G*Power 3.1.9.2 (FAUL et al., 2007), com alfa de 0,05, poder de 0,80 e um tamanho de efeito do tratamento de 0,72, baseado no resultado do estudo piloto com desenho idêntico a este estudo. O cálculo demonstrou a necessidade de n = 14, para confirmar a diferença significativa entre os trajes IVL e Placebo no tempo para exaustão em exercício de intensidade muito pesada. Foram recrutados voluntários até completar o tamanho da amostra estimado. Vinte homens aprovados por triagem inicial e avaliação cardiológica participaram do estudo. Os voluntários assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) do estudo aprovado pelo Comitê de

Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas - FCM/UNICAMP (CAAE: 0064.0.146.000-11/2014) e conduzido em concordância com a declaração de Helsinki.

Os critérios de inclusão foram: ter entre 18 e 40 anos, ser do sexo masculino, saudável, fisicamente ativo (≥ 2 sessões semanais de exercícios físicos), acostumados com exercícios em bicicleta, declarar disponibilidade para participar dos procedimentos experimentais, aceitar manter o mesmo nível de atividade física e padrão alimentar durante o período experimental e utilizar a calça por 96 horas que precederam os testes. Os critérios de exclusão e descontinuidade foram: ter sofrido lesões musculoesqueléticas e/ou articulares nos membros inferiores no período de seis meses anteriores ao estudo, utilização de qualquer substância/medicamento que pudesse interferir nas respostas aos testes, não utilizar a calça no período estabelecido, ter praticado atividade física extenuante nas 48 horas que precederam os testes, uso de drogas licitas ou ilícitas nas 24 horas precedentes aos testes, ingestão de bebidas estimulantes 6 horas antes dos testes, apresentar algum desconforto músculo articular e/ou respiratório durante o teste. Dos 20 voluntários que iniciaram a fase experimental, 14 concluíram totalmente o estudo e tem suas características descritas na tabela 1.

Estudo 1. TABELA 1. Características dos participantes

Idade (anos) 26 ± 4

Altura (cm) 173,6 ± 6,7

Peso (kg) 68,2 ± 7,3

IMC (kg/m2) 22,6 ± 2

V̇O2pico (mL/kg/min) 45,5 ± 5,5

Ppico (W) 280 ± 24

Limiar ventilatório (W) 154 ± 13

Ponto de compensação Respiratória (W) 229 ± 35

Potência no exercício muito pesado (W) 238 ± 20

Dados estão apresentados em média ± desvio padrão. IMC, índice de massa corporal; Ppico, potência pico;

V̇O2pico, consumo pico de oxigênio.

5.2.2 Desenho experimental

Os voluntários realizaram sete visitas, sendo elas: 1) entrevista (interesse, disponibilidade e critérios de inclusão/exclusão), assinatura do TCLE, avaliação cardiológica (anamnese, exame clinico e eletrocardiograma de repouso); 2) prova dos trajes, medidas de peso e altura, adequação dos ajustes de guidão e banco da bicicleta, familiarização com teste

progressivo até a exaustão; 3) e 4) 1º e 2º testes progressivos até a exaustão; 5) familiarização com testes de cargas constantes no domínio muito pesado; 6) e 7) testes de cargas constantes no domínio muito pesado com traje IVL ou Placebo.

Na sexta e sétima visitas foram realizadas as sessões experimentais (IVL e Placebo), em um formato aleatorizado, contrabalançado, crossover e duplo cego. Ambos os tecidos foram utilizados nas 96 horas que antecederam e durante as sessões experimentais. As condições experimentais foram separadas por um intervalo de sete dias sem uso de qualquer traje (washout), sendo realizadas no mesmo dia da semana e mesmo horário do dia, para que não houvesse influência do ciclo circadiano. Nas 48 horas antecedentes aos testes experimentais, foi registrado o padrão alimentar através de um diário alimentar. Os diários alimentares da primeira sessão experimental foram utilizados como guia para a segunda sessão. Os diários foram utilizados para a quantificação da ingestão calórica total e de micronutrientes, através do software DietPro® (version 5i). Os testes foram realizados em sala climatizada, mantida a 22ºC. Todas as avaliações foram acompanhadas por 2 avaliadores. O teste de carga constante foi realizado em bicicleta padrão no ciclo simulador (ComputrainerTM, RacerMate®, Seattle, USA).

As sessões experimentais (figura 1) foram constituídas de 5 minutos de repouso para coleta de gases (linha de base), seguido da medida de temperatura da coxa e coletas de sangue capilar e venoso, para então realizar o aquecimento de 10 minutos a 90% do LV e cadência de 65-75 rpm. A relação de marcha utilizada (54x17) foi à mesma em todos os testes do estudo. Após novo repouso de 5 minutos, os voluntários começaram a pedalar com a carga mínima do ciclo simulador (50W) para, só após 5 minutos, iniciarem o teste na intensidade alvo. O início de teste já em movimento foi adotado para evitar as influências da inércia dos pedais, e também do acelerar das pernas até alcançar a rotação desejada (ÖZYENER et al., 2001). Ao final destes 5 minutos, a carga foi automaticamente aumentada para a intensidade do domínio do esforço muito pesado [LV + 70% Δ(V̇O2pico-LV)] (BAILEY et al., 2009;

LANSLEY et al., 2011; ÖZYENER et al., 2001). Os voluntários foram orientados a pedalar pelo maior tempo possível, sendo registrado o tempo até exaustão (Tlim).

Durante o teste e nos 6 minutos de recuperação, as variáveis V̇O2, V̇E e FC foram

coletadas de forma constante, e expressas como valores médios dos 30 segundos anteriores a exaustão. Amostras de sangue capilar foram coletadas imediatamente após a exaustão e nos momentos 3, 5 e 7 minutos pós-teste, para identificação do valor de lactato pico ([Lacpico]).

No quinto minuto da recuperação, a segunda medida de temperatura da coxa e a coleta de sangue venoso foram feitas. Os dados de V̇O2 coletados durante o exercício e nos 6 minutos

de recuperação e o Δ[Lac] ([Lacpico] – [Lacpré]) foram posteriormente utilizados para a

quantificação dos metabolismos energéticos.

Estudo 1. Figura 1. Representação esquemática da sequência de eventos que constituíram a sessão experimental em ambas as condições (traje IVL ou Placebo).