Filtragem de variantes

É estimado que um ser humano saudável possua em média 5 milhões de variantes em relação ao genoma de referência. Embora 99,9% sejam variantes em pequena escala (substituições, pequenas deleções/inserções), um genoma característico da espécie humana contém também de 2100 a 2500 variantes estruturais (1000 genomes project consortium, 2015).

Comumente a identificação da variante patogênica se dá por um processo criterioso de exclusão de variantes potencialmente não patogênicas e de inclusão de variantes potencialmente patogênicas. A esse procedimento damos o nome de filtragem de variantes. No processo de filtragem de variantes, a sua busca nos diferentes bancos de dados de sequências humanas como o “Exome Aggregation Consortium” (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org/), o “NHLBI Exome Sequencing Project” (ESP) (http://evs.gs.washington.edu/EVS/) e o 1000

genomes project (http://www.1000genomes.org/) é essencial. Quase todas as variantes

Em casos familiares de doença, o estudo de ligação é muito útil durante o processo de filtragem das variantes. Com os dados da análise de ligação, pode-se selecionar apenas variantes presentes em regiões candidatas indicadas pelo cálculo de Lod score.

A tentativa de predição da patogenicidade de variantes pode ser valiosa no processo de filtragem. Diversos programas disponíveis na rede, cada um utilizando seu próprio algoritmo, fazem essa predição, como o PolyPhen-2 (Adzhubei e col., 2010), o MutationTaster2 (Schwarz e col., 2014), o SIFT (Kumar e col., 2009) e o Provean (Choi e col., 2012). As bases da predição da patogenicidade são o grau de conservação dos resíduos de aminoácidos entre diferentes espécies e a busca da variante em diferentes bancos de dados. Contudo, essa é uma predição in

silico e é considerável a taxa de erros. Os resultados combinados de múltiplas ferramentas

podem aumentar a possibilidade de aferir corretamente a patogenicidade da variante, que pode estar subestimada ou superestimada por uma ferramenta quando utilizada individualmente.

Desse modo, nos dias de hoje, apesar da disponibilidade de inúmeras técnicas sofisticadas de análise do genoma, a interpretação do significado da variação encontrada é um desafio. Estudos clínicos, moleculares e funcionais criteriosos são importantes etapas neste processo.

Embora os genes mais importantes no desenvolvimento de membros já tenham sido descobertos e as vias de sinalização, de uma forma geral, já estejam descritas, ainda existem inúmeras lacunas sobre vias de sinalização da embriogênese dos membros e muitos genes que participam desse processo permanecem obscuros. A descoberta de variantes em genes ainda não relacionados ao desenvolvimento de membros ou a descoberta de novas manifestações clínicas que resultam de variantes em genes já conhecidos têm o potencial de aumentar a nossa compreensão, tanto sobre as vias de sinalização do desenvolvimento quanto sobre a manifestação de determinadas doenças.

Capítulo 2

2 Objetivos

2.1 Objetivo principal

O objetivo do estudo é identificar as alterações genéticas responsáveis por defeitos de membros em famílias brasileiras.

2.2 Objetivos específicos

• Mapear os lócus e identificar as alterações genético-moleculares responsáveis pelos quadros clínicos apresentados;

• Contribuir ao estudo da manifestação clínica associada às alterações encontradas;

• Realizar estudos funcionais em casos selecionados, para testar o efeito patogênico das variantes encontradas;

Capítulo 3

3 Casuística e métodos

3.1 Aspectos éticos

O material biológico das famílias 1 e 2 foi coletado na vigência deste projeto, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (IB-USP) (CAAE: 37297114.7.0000.5464). Todos os indivíduos, ou seus responsáveis, que integram a casuística consentiram em participar da pesquisa mediante a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (ANEXO). O material genético das famílias 3 e 4 foi coletado na vigência de projetos previamente aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do IB-USP (protocolo nº 084/2008) durante o mestrado de Renata Soares Thiele de Aguiar, ocasião em que os termos de consentimento foram igualmente assinados.

3.2 Casuística

3.2.1 Família 1

A família 1 foi encaminhada pela Dra. Eliete Pardono (Faculdade de São Paulo) e atendida no Centro de Pesquisa sobre o Genoma Humano e Células-Tronco (CPGHCT) do IB-USP em 2013 pelos Drs. Paulo A. Otto e Regina Célia Mingroni-Netto. A probanda é natural da cidade de Belém (Pará, Brasil). O quadro clínico presente na família se caracteriza por ectrodactilia, fenda labial e displasia ectodérmica, sinais típicos da síndrome da displasia ectodérmica, ectrodactilia e fenda labiopalatina (EEC, do inglês, ectrodactyly-ectodermal

dysplasia and cleft lip/palate) (OMIM #604292). O quadro clínico detalhado e o heredograma

serão apresentados no Capítulo 4.

3.2.2 Família 2

A família 2 foi averiguada no Centro de Genética Médica da Escola Paulista de Medicina da Universidade Federal de São Paulo (EPM-UNIFESP), em 2004, pela equipe da Dra. Ana Beatriz Alvarez Perez. Os resultados do exame físico, registros fotográficos, exames

radiográficos e anamnese foram disponibilizados para a nossa equipe. O probando também foi atendido na Associação de Assistência à Criança Deficiente (AACD) e os exames foram disponibilizados pelo Dr. Luis Garcia Alonso (EPM-UNIFESP). Essa família foi também reexaminada pessoalmente por nossa equipe de pesquisa (Drs. Paulo Alberto Otto e Regina Célia Mingroni-Netto), em domicílio, na cidade de São Paulo (SP), em 2013. Os sinais clínicos presentes em membros da família são: orelha direita em concha, criptorquidia bilateral, desvio ulnar do polegar à esquerda, encurtamento do antebraço e mão direita, com desvio radial da mão; desorganização do pé direito, além de polegar trifalângico com desvio ulnar dos polegares. O quadro clínico detalhado e o heredograma serão apresentados no Capítulo 5.

3.2.3 Família 3

A família 3 foi averiguada pela equipe do nosso laboratório (Laboratório de Genética Humana - LGH) em estudos genético-populacionais conduzidos nos remanescentes de quilombos do Vale do Ribeira (SP), que se desenvolvem em nosso laboratório desde o ano de 2000, sob diversas fontes de financiamento da FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) e do CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico). Os indivíduos afetados apresentaram um quadro variável de anomalias das extremidades dos membros, incluindo polidactilia, sindactilia e camptodactilia, sem dismorfias extra-membros associadas. O quadro clínico detalhado e o heredograma serão apresentados no Capítulo 6.

3.2.4 Família 4

A família 4 foi averiguada pela Dra. Silvana Santos (Universidade Estadual da Paraíba) na cidade de Riacho de Santana, uma pequena cidade no extremo oeste do Estado do Rio Grande do Norte, durante a execução do projeto “Consanguinidade em populações do Nordeste Brasileiro: da prospecção de doenças genéticas à intervenção por meio de educação genética” coordenado pelo Dr. Paulo Alberto Otto, em 2006. A família é constituída por indivíduos afetados por uma nova síndrome, que foi denominada síndrome de Santos (OMIM 613005). Sinais clínicos como aplasia/hipoplasia fibular, fêmur hipoplásico, pé torto com deformações e grave oligodactilia, anoniquia/hipoplasia ungueal nas mãos, às vezes associados com

braquidactilia leve e, ocasionalmente, polidactilia, estão presentes nos afetados. A descrição da família foi publicada no trabalho de Santos e col. (2008). O quadro clínico detalhado e o heredograma serão apresentados no Capítulo 7.