Seleção do gene candidato e sequenciamento de Sanger

O programa de priorização Endeavour indicou o gene WNT7A como o principal gene relacionado com as vias de sinalização presentes durante o desenvolvimento de membros e entre os genes associados com defeitos de membros nas regiões com Lod score positivo no cromossomo 3. O gene fica localizado próximo ao marcador D3S1263, que se mostrou em homozigose em 5 dos 6 afetados.

O sequenciamento de Sanger do gene WNT7A revelou a presença da variante c.934G>A (Figura 7-10) em homozigose nos indivíduos afetados IV-1, IV-16, IV-19, IV-20 e IV-32 e em heterozigose no indivíduo afetado V-12, assim como nos indivíduos não afetados IV-31, V-13, V- 14 e V-15. A variante estava ausente nos indivíduos IV-17 e IV-19 (genótipos apresentados na Figura 7-3). Esses genótipos seguiram o mesmo padrão de segregação dos genótipos apresentados pelo marcador D3S1263 (Figura 7-11).

Figura 7-10: Eletroferograma do sequenciamento de Sanger da região com a variante c.934G>A no gene WNT7A.

A, amostra do indivíduo não afetado IV-17. B, amostra do indivíduo afetado V-12. C, amostra do indivíduo afetado IV-32.

A

B

Figura 7-11: Genótipos nos marcadores de microssatélites e reconstrução dos haplótipos. A caixa à esquerda mostra os marcadores de microssatélite utilizados. As cores

A variante c.934G>A em WNT7A é uma variante missense, p.Gly312Ser, presente no último éxon do gene, o éxon 4. Esta variante nunca foi descrita nos diferentes bancos de dados de sequenciamento. A variante foi indicada como patogênica pelo Polyphen-2 (1,0) e pelo SIFT (0,001); foi predita ser deletéria pelo Provean (5,42) e predita ser causadora de doença pelo MutationTasting2. O alinhamento da região da proteína mostrou que ela é altamente conservada em todos os filos do sub-reino Eumetazoa, segundo alinhamento realizado com o Clustal Omega (Quadro 7-5).

Quadro 7-5: Alinhamento da região com a variante p.Gly312Ser da proteína WNT7A

Homo_sapiens (humano) APQASGCDLMCCGRGYNTHQYARV-WQCNCKFQWC Pan_troglodytes (chimpanzé) APQASGCDLMCCGRGYNTHQYARV-WQCNCKFHWC Gorilla_gorilla (gorila) APQASGCDLMCCGRGYNTHQYARV-WQCNCKFHWC Pongo_pygmaeus (orangotango) APQASGCDLMCCGRGYNTHQYARV-WQCNCKFHWC Rattus_norvegicus (rato) APQASGCDLMCCGRGYNTHQYARV-WQCNCKFHWC Bos_taurus (gado) APQASGCDLMCCGRGYNTHQYARV-WQCNCKFHWC Gallus_gallus (ave) AQQSNGCDLMCCGRGYNTHQYSRV-WQCNCKFHWC Ophiophagus_hannah (réptil) AQQTNGCDLMCCGRGYNTHQYSRV-WQCNCKFHWC Xenopus_tropicalis (anfíbio) AQHTSSCDLMCCGRGYNTHQYSRV-WQCNCKFHWC Danio_rerio (peixe ósseo) AQHTNGCDLMCCGRGYNTHQYSRV-WQCNCKFLWC Daphnia_magna (crustáceo) SAGADGCNLLCCGRGYNTHQFNHVSHQCNCKFHWC Exaiptasia_pallida (cnidário) LSKTNSCKVLCCGRGYNVHEVVRV-WDCQCKFYWC Em cinza, o aminoácido correspondente à glicina na posição 312 em humanos.

7.6.5 Sequenciamento massivo em paralelo

Com o objetivo de excluir outras variantes que pudessem explicar a síndrome de Santos e excluir que o indivíduo V-12 fosse afetado por doença genética distinta, foi realizado o sequenciamento massivo em paralelo do exoma das amostras dos indivíduos V-12 e IV-20. Após os filtros de qualidade, o sequenciamento da amostra V-12 teve em média 43,5 leituras por base e com 52% das bases com no mínimo 20 leituras. Já a amostra IV-20, que foi sequenciada pela equipe da doutora Carla Rosenberg, obteve 98,2% das bases com no mínimo 20 leituras.

Os resultados das etapas de filtragem da amostra do indivíduo V-12 estão resumidos no Quadro 7-6. Após a filtragem, 208 variantes foram selecionadas, 205 em heterozigose e 3 em homozigose. Dos genes contendo as variantes presentes no indivíduo V-12, o único que possui relação com defeitos de membros e que participa em vias de sinalização do desenvolvimento de membro foi o gene TBX5. Este gene também foi priorizado pelo programa Endeavour. O gene TBX5 apresentou a variante c.C848A (p.Thr283Asn) em heterozigose.

Quadro 7-6: Filtragem das variantes presentes no indivíduo V-12

Filtros Número de

variantes Total de variantes em heterozigose e homozigose 33813 Variantes com MAF < x* no NHBLI-ESP exomas e 1000 genomes project 7086

Ausentes nos 60 indivíduos controle da reação 535 Após exclusão de variantes em genes hipervariáveis 476 Variantes exônicas e em sítios de splicing 362 Após exclusão das sinônimas e de efeito desconhecido 213 Após exclusão das variantes com baixa qualidade 208

* x = 0,001 para variantes em heterozigose e x = 0,01 para variantes em homozigose

Realizamos o sequenciamento de Sanger do éxon 8 do gene TBX5, onde a variante está localizada, nas amostras do indivíduo V-12 e de seus familiares. A variante foi confirmada no indivíduo V-12 e detectada nas amostras de sua mãe (IV-32) e de sua irmã (V-15), ambas não afetadas pelo quadro. Além disso, sua irmã (V-15) é heterozigótica tanto em relação à variante c.C848A (p.Thr283Asn) em TBX5 quanto em relação à variante c.934G>A (p.Gly312Ser) em

WNT7A, ou seja, tem ambos os genótipos iguais ao do indivíduo afetado V-12, mas não

manifesta a doença. Esses resultados praticamente excluem o papel da variante no gene TBX5 como candidata a explicar o quadro clínico do indivíduo V-12 e mantêm a variante c.934G>A no

WNT7A como a principal candidata.

Para excluir a possibilidade de alguma outra variante, além da c.934G>A no WNT7A, estivesse relacionada com o quadro clínico da síndrome de Santos, foi realizado o sequenciamento massivo em paralelo do exoma com a amostra do indivíduo IV-20. As 208 variantes selecionadas pela filtragem do exoma do indivíduo V-12 (conforme estratégia apresentada no Quadro 7-6) foram novamente filtradas em conjunto com as variantes presentes na amostra do indivíduo IV-20, como indicado no Quadro 7-7.

Quadro 7-7: Filtragem das variantes no indivíduo IV-20, após filtragem inicial no indivíduo V-12

Filtros Número de

variantes Variantes na amostra V-12 após filtragem prévia 208 Variantes presentes em regiões com Lod score positivo* 6

Variantes também presentes no indivíduo IV-20 1

* Foram consideradas todas as regiões com resultado do cálculo de Lod score positivos sob o modelo de herança autossômica dominante e recessiva.

Após a filtragem, apenas a variante c.934G>A no gene WNT7A se mostrou presente em ambos os indivíduos.

Consideramos também a hipótese do defeito de membro apresentado pelo indivíduo V- 12 ser resultado de alguma alteração genética em regiões não exônicas ou devido a causas ambientais. Desse modo, filtramos apenas as variantes presentes na amostra do indivíduo IV- 20, presentes em regiões de Lod score positivo, em estratégia similar a apresentada no Quadro 7-6. Contudo, nenhuma variante além da encontrada no gene WNT7A se mostrou candidata a explicar o quadro clínico.

Em resumo, após diversas estratégias de filtragem de variantes, não foram detectadas outras variantes que pudessem explicar o quadro da Síndrome de Santos, além da variante c.934G>A no gene WNT7A.

7.6.6 Ensaio funcional com Luciferase

Os resultados dos quatro ensaios da Luciferase estão representados na Figura 7-12.

Figura 7-12: Gráficos dos resultados dos ensaios com a Luciferase. A, Ensaio 1. B, Ensaio 2. C, Ensaio 3. D, Ensaio 4.

Os resultados apresentados até o momento são inconclusivos, uma vez que, ambos os experimentos com os vetores com o gene WNT7A, selvagem e mutado, revelaram a atividade da Luciferase menor do que quando foram usadas células com o vetor vazio ou, em vários casos, células somente com o vetor TopFlash.