O processo de FBN ´e realizado por diferentes classes de microrganismos, chamados de mi-crorganismos diazotr´oficos. Eles s˜ao exclusivamente procari´oticos, mas podem ser arqueas metanogˆenicas ou bact´erias aer´obicas, anaer´obicas, Gram positivas, Gram negativas, he-terotr´oficas, autotr´oficas e fototr´oficas.
Tabela 1.1: Exemplos de gˆeneros de organismos diazotr´oficos De vida livre Simbi´oticos Endof´ıticos Aer´obicos Anaer´obicos Leguminosas N˜
ao-leguminosas
Azotobacter Firmibacterias Rhizobium Frankia Azospirillum Beijerinkia Desulfovibrio Bradyrhizobium Anabaena Gluconacetobacter
Nostoc Rhodospirillum Azoarcus
Methanococcus Herbaspirillum
Os organismos diazotr´oficos s˜ao divididos em trˆes grupos principais:
• os de vida livre, que podem viver e fixar N2 independentemente de outros organis-mos. A capacidade de fixar N2 por microorganismos de vida livre est´a amplamente distribuida entre as bact´erias e arqueas do solo e da ´agua. Todos os grupos fisiol´ o-gicos tem algum representante que ´e capaz de realizar este processo com maior ou menor eficiˆencia [Baldani et al., 1997].
• os que vivem em simbiose com outros organismos. Os exemplos mais conheci-dos fazem parte conheci-dos gˆeneros Rhizobium e Bradyrhizobium, que infectam as ra´ızes de plantas leguminosas e estimulam a produc˜ao de n´odulos, dentro dos quais as bacterias fixam N2, enquanto a planta responde fornecendo nutrientes orgˆanicos produzidos durante a fotoss´ıntese. Tais n´odulos possuem condi¸c˜oes otimizadas para uma m´axima eficiˆencia do processo de fixa¸c˜ao. Outra bact´eria fixadora de N2 que estabelece rela¸c˜oes simbi´oticas (por´em com plantas n˜ao-leguminosas) ´e a cianobact´ e-riaAnaebaena azollae, que vive en pequenos poros da planta aqu´aticaAzolla. Outro exemplo ´e o o gˆeneroFrankia, uma bact´eria que se assemelha a Estreptomicetes, que forma n´odulos em ´arvores, arbustos e herb´aceas [Baldani et al., 1997].
• A intera¸c˜ao entre bact´erias diazotr´oficas e gram´ıneas ´e um tipo particular de asso-cia¸c˜ao entre planta/diazotr´oficos conhecido como coloniza¸c˜ao endof´ıtica. A asso-cia¸c˜ao endof´ıtica ´e caracterizada por uma coloniza¸c˜ao de diversos tecidos vegetais por bact´erias diazotr´oficas que promovem o crescimento da planta sem causar qual-quer sintoma de doen¸ca [D¨obereiner, 1992]. Baldani e colaboradores sugeriram a
separac˜ao do grupo entre os ”endof´ıticos associativos ou facultativos” para os micro-organismos que s˜ao capazes de colonizar a superf´ıcie e o interior da raiz e sobreviver bem no solo, e os ”end´ofiticos obrigat´orios ” que n˜ao sobrevivem no solo mas coloni-zam o interior das ra´ızes e a parte a´erea da planta [Baldani et al., 1997]. H´a, por´em, outros autores que discordam quanto ao uso da terminologia ”endof´ıtico obrigat´orio”
pois estas bact´erias podem crescer em meio de cultura sem a presen¸ca de extratos de vegetais [Reinhold-Hurek e Hurek, 1998]. Mais recentemente, devido a dificuldade de separa¸c˜ao entre esses dois grupos esta classifica¸c˜ao foi abandonada. A lista de di-azotr´oficos endof´ıticos que colonizam plantas n˜ao-leguminosas inclui v´arias bact´erias do gˆenero Azospirillum (A. brasilense, A. lipoferum, A. amazonense, A. irakense), Herbaspirillum seropedicae, H. rubrisubalbicans, G. diazotrophicus, Azoarcus sp. e Burkholderia sp. Estas bact´erias foram isoladas de cana-de-a¸c´ucar, plantas forra-geiras, cereais e outros hospedeiros e s˜ao descritas em detalhes em publica¸c˜oes de D¨obereiner e Baldani [D¨obereiner et al., 1993, Baldani et al., 1997].
Organismos fixadores de nitrogˆenio que estabeleceram simbiose com plantas superiores sempre foram o foco da aten¸c˜ao dos pesquisadores que estudam o processo de FBN.
De fato, as maiores contribui¸c˜oes em nitrogˆenio fixado por FBN foram detectadas em oceanos e plantas leguminosas. No entanto, evidˆencias recentes de significativa FBN em gram´ıneas de importˆancia econˆomica, em especial cana-de-a¸c´ucar (Saccharum sp.), arroz (Oryza sativa), gram´ıneas forrageiras, comoLeptochloa fusca despertaram novos interesses nos estudos de fixa¸c˜ao de nitrogˆenio e o estudo da FBN em gram´ıneas ganhou novo folego [Baldani et al., 1997, James, 2000].
1.2.1 O complexo enzim´ atico da nitrogenase
Em organismos diazotr´oficos, o processo de redu¸c˜ao do nitrogˆenio ´e catalizado pela ni-trogenase, que ´e um complexo de metaloenzimas com caracter´ısticas mecˆanicas e estrutu-rais conservadas [Rees e Howard, 2000, Lawson e Smith, 2002, Dixon e Kahn, 2004]. Es-tas enzimas contˆem dois componentes que s˜ao nomeados de acordo com o metal de
sua composi¸c˜ao. O componente dim´erico menor, conhecido como Ferro-prote´ına (Fe-prote´ına, produto do gene nifH), que funciona como um doador de el´etrons dependente de ATP para o maior componente heterotetramerico, conhecido como prote´ına Ferro-molibdˆenio (MoFe-prote´ına, produto do gene nifDK), que cont´em o s´ıtio catal´ıtico da enzima [Dixon e Kahn, 2004]. O complexo da nitrogenase ´e codificado pelos genes estru-turais nifHDK. A Ferro-prote´ına cont´em um n´ucleo 4Fe-4S, j´a a MoFe-prote´ına (codifi-cada pelos genes nifDK), cont´em dois grupos prost´eticos: Centro P [8Fe–7S] e o cofator ferro molibdˆenio. Estes componentes apresentam forte homologia entre diferentes micro-organismos diazotr´oficos, podendo o componente I de um organismo ser combinado ao componente II de outro, tornando o complexo nitrogenase ativo [Detroy et al., 1967].
Um modelo estrutural do complexo nitrogenase deAzotobacter vinelandii est´a apre-sentado na Figura 1.1 Todos os diazotr´oficos tˆem um sistema ferro-molibdˆenio nitroge-nase, mas em condi¸c˜oes de ausˆencia de molibdˆenio, alguns organismos comoA. vinelandii e Rhodobacter capsulatus - induzem a s´ıntese de nitrogenases alternativas contendo como co-fatores o ferro-van´adio ou ferro-ferro [Eady, 1996]. O mecanismo enzim´atico da ni-trogenase requer a redu¸c˜ao da Fe-prote´ına por doadores de el´etrons como ferredoxina e flavodoxina, a transferˆencia de el´etrons para a MoFe-prote´ına atrav´es de um processo de-pendente da hidr´olise de Mg-ATP e a transferˆencia de el´etrons para o substrato ligado ao s´ıtio ativo da MoFe-prote´ına [Dixon e Kahn, 2004]. Em condi¸c˜oes ´otimas, a estequiome-tria global da rea¸c˜ao ´e [Simpson e Burris, 1984]:
N2+ 8e−+ 8H+ 16AT P→2N H3+H2 + 16ADP +P i (1.1) Devido `a sensibilidade das nitrogenases ao oxigˆenio e ao alto custo energ´etico da FBN, esse processo em diazotr´oficos ´e estritamente regulado [Postgate, 1998]. Em pro-teobact´erias, a s´ıntese do complexo enzim´atico da nitrogenase depende da atividade da prote´ına NifAem conjunto com a o promotorσv54 respons´avel pela ativa¸c˜ao da transcri¸c˜ao dos genesnif (genes da fixa¸c˜ao do nitrogˆenio), que codificam a nitrogenase e outras prote´ı-nas necess´arias para a s´ıntese desta enzima, matura¸c˜ao dos seus componentes, transporte
de el´etrons e regula¸c˜ao da transcri¸c˜ao [Merrick, 1992].
Figura 1.1: Estrutura do complexo da nitrogenase de Azotobacter vinelandii. As subu-nidades Fe-prote´ına est˜ao coloridas em azul claro, marron e cinza. As subunidades da MoFe-prote´ına est˜ao coloridas em verde, amarelo, azul escuro e vermelho (Adaptado de Dixon [2004] por Guedes [2010]Oi).