Estudos de genˆ omica funcional em Gluconacetobacter diazotrophicus : ˆ enfase no metabolismo redox e nas vias alternativas de aminoacila¸ c˜ ao e
s´ıntese de asparagina
Sylvia Maria Campbell Alqu´ eres
Rio de Janeiro
2010
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Estudos de genˆ omica funcional em Gluconacetobacter diazotrophicus : ˆ enfase no metabolismo redox e nas vias alternativas de aminoacila¸ c˜ ao e
s´ıntese de asparagina
Sylvia Maria Campbell Alqu´ eres
Orientador: Orlando B. Martins
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de P´ os-Gradua¸c˜ ao em Qu´ımica Biol´ ogica, Instituto de Bioqu´ımica M´ edica da UFRJ, como parte dos requisitos necess´ arios ` a obten¸c˜ ao do t´ıtulo de Doutor em Qu´ımica Biol´ ogica.
Rio de Janeiro
2010
Estudos de genˆ omica funcional em Gluconacetobacter diazotrophicus: ˆ enfase no metabolismo redox e nas vias alternativas de aminoacila¸c˜ ao e s´ıntese de asparagina
Orientador: Orlando Bonif´ acio Martins
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de P´ os-Gradua¸c˜ ao em Qu´ımica Biol´ ogica, Instituto de Bioqu´ımica M´ edica da UFRJ, como parte dos requisitos necess´ arios ` a
obten¸c˜ ao do t´ıtulo de Doutor em Qu´ımica Biol´ ogica.
Aprovada por:
Prof. Dr. Alexandre Rosado Inst. Microbiologia CCS - UFRJ
Prof. Dr. F´ abio Lopes Olivares
Centro de Biociˆ encias e Biotecnologia IB - UFRJ
Prof. Dr. Jos´ e Ivo Baldani
Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia - EMBRAPA
Prof. Dr. Russolina Zingali
Inst. Bioqu´ımica M´ edica CCS - UFRJ
Prof. Dr. Orlando Martins
Inst. Bioqu´ımica M´ edica CCS - UFRJ
Prof. Dr. Adriana Hemerly
Inst. Bioqu´ımica M´ edica CCS - UFRJ
A minha fam´ılia: meus pais, irm˜ ` aos e Tin. Ao Carlos Eduardo.
Agradecimentos
Ao Orlando. J´ a faz 10 anos que eu entrei no seu laborat´ orio e em todo esse tempo eu devo ter pensado um milh˜ ao de vezes ”uau, como eu sou sortuda de estar aqui”. Al´ em de gostar muito da maneira como vocˆ e pensa as quest˜ oes experimentais, da maneira com que vocˆ e coloca os problemas cient´ıficos, eu ainda tive a oportunidade de ver o seu engajamento na luta por fazer UFRJ uma faculdade melhor, mais integrada, com mais recursos, que acolhesse mais alunos, e que em ultima instˆ ancia, desempenhasse o seu papel de fazer do Rio uma cidade melhor.
Ao meu orientador e amigo Alex que sempre me ajudou muito em todos os trabalhos desenvolvidos, com bom humor e otimismo e uma leveza de se encarar os experimentos que sempre tornou o ambiente do laborat´ orio mais divertido e entusiasmante.
Ao meu irm˜ ao Welington, que foi essencial para minha forma¸c˜ ao como bioqu´ımica.
Foi quem me explicou tudo sobre o ent˜ ao departamento de bioquimica m´ edica, quem me deu aulas de metabolismo energ´ etico, me preparou para as provas do mestrado, e discutiu n˜ ao s´ o experimentos e mas tamb´ em muitas coisas da vida.
Ao Z´ e, grande figura deste laborat´ orio. Quero agradecer pela grande ajuda nos experimentos, mas principalmente na reda¸c˜ ao do paper, ao tomar a frente e fazer as coisas acontecerem quando eu estava demorando muito.
Ao professor Jonathan Trent, por abrir meus olhos para ver a poesia e o caos escon- didos nos processos celulares.
Ao Eduardo Mattos, quem me explicou o b´ asico de Glucona, quando eu n˜ ao tinha nem id´ eia de por onde come¸car a estudar o assunto novo. Pelas cr´ıticas claras e essenciais ao trabalho.
Professor Ivo Baldani que me recebeu em seu laborat´ orio onde passei ´ otimos mo-
inclusive), pelo excelente ambiente de trabalho.
A professora Adriana Hemerly pela revis˜ ao e acompanhamento desta tese e por abrir seu laborat´ orio sempre que precisei fazer experimentos. E ao pessoal do JB, que me recebeu muito bem quando fui fazer experimentos l´ a.
Ao professor Paulo Ferreira.
Ao Marcelo Bertalan, por toda a ajuda com a bioinform´ atica.
A Helma, que al´ em de um doce ´ e uma ´ otima companheira de trabalho, pela ajuda nos testes de ARA e discuss˜ oes sobre os projetos.
Ao Luc, pela ajuda na constru¸c˜ ao dos mutantes aleat´ orios.
A Maria Clara, Milane e Marcos Sorgine, pela grande ajuda nos primeiros qPCRs. ` Ao Jordano, pela ajuda na realiza¸c˜ ao das HPLC.
Ao Marcus e a Renata, que durante o desenvolvimento da tese tiraram in´ umeras d´ uvidas sobre sistema respirat´ orio, mitocˆ ondrias, ROS e etc. E deram ´ otimas dicas para o trabalho.
Ao Ricardo por me ensinar a importˆ ancia de se fazer ciˆ encia usando uma pergunta e apenas duas amostras.
Ao Ramon e Nathalia, meus melhores amigos. Por estarem presentes nos principais momentos da minha vida. Por dividirem comigo uma vis˜ ao original e clara sobre a vida e sobre as pessoas.
Ao professor Pedro pelo incentivo sempre.
Ao Rodrigo, meu orientador de mestrado que sempre foi um exemplo para mim.
As meninas Aline, Cynthia, Vivi e Roberta, que trouxeram uma vida nova ao nosso ` laborat´ orio.
A Tereza, Patr´ıcia e Leonardo, da secretaria de p´ ` os gradua¸c˜ ao.
A Gluconacetobacter diazotrophicus ´ e um organismo endof´ıtico estritamente aer´ obico, iso- lado de cana-de-a¸c´ ucar, que fixa nitrogˆ enio (N
2). Seu sequenciamento foi finalizado em 2008 junto com os primeiros estudos de proteˆ omica. Dentro deste cen´ ario esse trabalho foi dedicado ao estudo da genˆ omica funcional desta bact´ eria. Estes estudos foram focados em trˆ es diferentes temas: o primeiro deles foi a identifica¸c˜ ao dos tranportadores presentes na bact´ eria pela an´ alise de seu genoma, o segundo tema foi a influˆ encia de esp´ ecies reativas de oxigˆ enio (ROS) no processo de fixa¸c˜ ao biol´ ogica de nitrogˆ enio (FBN) por essa bact´ eria;
e o terceiro foi a an´ alise de uma via alternativa para a aminoacila¸c˜ ao de tRNA e produ¸c˜ ao de asparagina.
Dentro do primeiro tema estudado observou-se que cerca de 45% dos tranportadores anotados pertecem ` a classe de transportadores ativos prim´ arios, 30% ` a classe de trans- portadores ativos secund´ arios e 12% s˜ ao relacionados ` a forma¸c˜ ao de poros e canais na membrana celular. Entre os transportadores identificados vale ressaltar a presen¸ca de 23 genes transportadores do tipo TonB que est˜ ao ligados ` a capta¸c˜ ao de ferro extracelular, a presen¸ca de 40 genes da fam´ılia RND e uma grande quantidade de genes para exportar metais pesados e outros compostos t´ oxicos, que podem conceder ` a bact´ eria uma not´ a- vel resistˆ encia a ambientes in´ ospitos, e a presen¸ca de transportadores de um sistema de secre¸c˜ ao do tipo IV, que confere ` a bact´ eria a capacidade de transportar macromol´ eculas atrav´ es de seu envelope at´ e a planta. Acredita-se que isso tenha um papel relevante no reconhecimento celular, no curso da intera¸c˜ ao planta-bact´ eria.
Dentro do segundo tema estudado abordamos a influˆ encia de ROS no processo de
ATP fornecida pela respira¸c˜ ao aer´ obica. No entanto, a atividade da nitrogenase ´ e ex- tremamente sens´ıvel ` a presen¸ca de oxigˆ enio e possivelmente ` a ROS. Neste trabalho n´ os exploramos esse paradoxo e mostramos que de fato os n´ıveis de ROS s˜ ao diminuidos du- rante o processo de FBN devido ao aumento na express˜ ao de seis enzimas detoxificadoras de ROS. Um agrupamento baseando-se nos padr˜ oes de express˜ ao de cada um destes genes revelou a existˆ encia de um grupo formado pelos genes das enzimas super´ oxido dismutase, catalase do tipo E e subunidade MoFe da nitrogenase que apresenta 99,8% de similari- dade de responta nos padr˜ oes de express˜ ao frente as diferentes condi¸c˜ oes apresentadas.
Finalmente, a atividade da nitrogenase foi inibida de maneira dose-dependente por Para- quat, que aumenta os n´ıveis de ROS intracelulares. Os resultados apresentados mostram que ROS inibe fortemente a atividade de nitrogenase e que a G. diazotrophicus muda o seu metabolismo redox durante a FBN aumentando a express˜ ao e atividade de enzimas detoxificadoras de oxigˆ enio que levam a uma menor quantidade de ROS gerada. N´ os su- gerimos que um forte controle da produ¸c˜ ao de ROS nesta fase cr´ıtica ´ e um mecanismo adaptativo que permite a ocorrˆ encia do processo de FBN.
O terceiro tema aborda a presen¸ca e atividade de uma via alternativa para a produ-
¸c˜ ao de asparagina-tRNA (Asn-tRNA) e glutamina-tRNA (Gln-tRNA) em G. diazotrophi-
cus. Essa via alternativa envolve a transamida¸c˜ ao de um tRNA acilado errˆ oneamente pela
enzima codificada pelos genes gatCAB. A ausˆ encia de genes codificando para a asparagina
sintetase e a falta de atividade desta enzima no extrato celular tamb´ em indicam que o
gatCAB pode ser respons´ avel pela s´ıntese deste amino´ acido na c´ elula. A influˆ encia da
asparagina na express˜ ao da nitrogenase tamb´ em foi observada. Mutantes aleat´ orios com
altera¸c˜ oes no metabolismo de asparagina foram analisados e apresentaram taxas alteradas
de FBN. N´ os sugerimos que a existˆ encia de uma via alternativa para a bios´ıntese de aspa-
ragina pode ser um mecanismo adotado por alguns organismos para manter a regula¸c˜ ao
da FBN sob um controle maior.
Gluconacetobacter diazotrophicus, is a nitrogen (N
2) fixating endophyte bacterium isolated from sugarcane, that is a strictly aerobic. The genome sequencing of this bacterium was completed in 2008, together with the first studies of proteomics. The work reported here was centered on the functional genomic of this bacteria. This study focuses on 3 different topics: the first concerns the identification of the transporters in the G. diazotrophicus genome; the second topic focuses on the influence of reactive oxygen species (ROS) in the biological nitrogen fixation (BNF) process; and the third topic focuses on the identification and analyses of an alternative route for aminoacylation and asparagine formation.
In the first topic we report that 45% of the transporters are primary active trans- porters, 30% are electrochemical potential-driven transporters (or secondary active trans- porters) and 12% are channel-type facilitators. Among these transporters are the 23 gene transporters of the TonB type involved in extracellular iron binding, the presence of 40 genes of the RND family and a large quantity of genes that can release heavy metals and other toxic composites thus providing the bacterium with resistance to inhospitable environments. Also noted were type IV secretion system transporters that enable the bacterium to transport macromolecules through its outer membrane to the plant. This probably has a relevant role in cell recognition during plant-bacterium interaction.
The second topic focuses on the influence of ROS in the BNF process. This process
is catalyzed by a nitrogenase and requires copious amounts of ATP. Nitrogenase activity is
extremely sensitive to inhibition by oxygen and reactive oxygen species (ROS). However,
the high oxidative metabolic rates required to sustain biological nitrogen fixation (BNF)
that ROS levels are, in fact, decreased in nitrogen-fixing cells due to the up regulation of transcript levels of six ROS detoxifying genes. A cluster analysis based on common expression patterns revealed the existence of a stable cluster with 99.8% similarity made up of the genes encoding the α -subunit of nitrogenase MoFe-protein, and the superoxide dismutase and catalase type E enzymes. Finally, nitrogenase activity was inhibited in a dose-dependent manner by paraquat, a redox cycler that increases cellular ROS levels.
Our data revealed that ROS can strongly inhibit nitrogenase activity, and G. diazotrophi- cus alters its redox metabolism during BNF by increasing antioxidant transcript levels resulting in a lower ROS generation. We suggest that the carefully controlled ROS pro- duction during this critical phase is an adaptive mechanism to allow nitrogen fixation.
We also confirmed the presence of an alternative route for asparaginyl-tRNA (Asn-
tRNA) and glutaminyl-tRNA (Gln-tRNA) formation. The alternative route involves tran-
samidation of incorrectly charged tRNA via gatCAB. The absence from the G. diazo-
trophicus genome of genes encoding tRNA-independent asparagine synthetase and the
lack of this enzyme in G. diazotrophicus extracts suggest that the gatCAB genes may be
responsible for biosynthesis of asparagine in this organism. The influence of asparagine in
the expression of nitrogenase gene was observed. Mutants with alterations in asparagine
metabolism also presented different rates of biological nitrogen fixation compared to the
wild type. We suggest that the presence of an alternative route to produce asparagine
may give the cell a tighter control over BNF.
Resumo vi
Abstract viii
Sum´ ario x
Lista de Figuras xiv
´ Indice de Figuras xx
Lista de Tabelas xxi
´ Indice de Tabelas xxii
Tabela de abrevia¸ c˜ oes e f´ ormulas qu´ımicas xxiii
1 Introduc˜ ao 1
1.1 A Fixa¸c˜ ao de Nitrogˆ enio: Origem e hist´ orico. . . . . 3
1.2 A Fixa¸c˜ ao Biol´ ogica de Nitrogˆ enio. . . . 7
1.2.1 O complexo enzim´ atico da nitrogenase . . . . 9
1.3 Gluconacetobacter diazotrophicus . . . . 11
1.3.1 Importˆ ancia biotecnol´ ogica . . . . 11
1.3.2 Isolamento e habitat natural . . . . 14
1.3.3 Taxonomia . . . . 15
1.3.4 Caracter´ısticas fisiol´ ogicas . . . . 16
2 Identifica¸ c˜ ao e an´ alise dos transportadores 19 2.1 Introdu¸c˜ ao . . . . 19
2.1.1 O sequenciamento de genomas . . . . 19
2.1.2 Anota¸c˜ ao de genomas . . . . 23
2.1.3 Ferramentas de bioinform´ atica . . . . 24
2.1.4 Transportadores e sistemas de transporte . . . . 25
2.2 Objetivos . . . . 30
2.3 Resultados e discuss˜ ao . . . . 31
2.3.1 Vis˜ ao geral dos transportadores. . . . 42
2.3.2 Transportadores prim´ arios . . . . 44
2.3.3 Transportadores secund´ arios . . . . 45
2.3.4 Poros e canais . . . . 47
2.4 Conclus˜ oes . . . . 48
3 As esp´ ecies reativas de oxigˆ enio durante a FBN 50 3.1 Introdu¸c˜ ao . . . . 50
3.1.1 O paradoxo da FBN em organismos aer´ obicos . . . . 50
3.1.2 A tolerˆ ancia de G. diazotrophicus a O
2. . . . 51
3.1.3 Prote¸c˜ ao respirat´ oria . . . . 52
3.1.4 Liga¸c˜ ao entre sistema respirat´ orio e ROS . . . . 54
3.1.5 Enzimas detoxificadoras de ROS . . . . 55
3.1.6 A influˆ encia de ROS na FBN . . . . 56
3.1.7 Modula¸c˜ ao de ROS durante a simbiose . . . . 57
3.1.8 Perspectivas . . . . 58
3.2 Objetivos . . . . 60
3.3 Resultados e Discuss˜ ao . . . . 61
3.3.1 Visualiza¸c˜ ao . . . . 61
3.3.2 Atividade Catal´ asica . . . . 63
3.3.3 Identifica¸c˜ ao dos genes respons´ aveis pela detoxificaxa¸c˜ ao de ROS no genoma de G. diazotrophicus . . . . 63
3.3.4 PCR em tempo real . . . . 67
3.3.5 Agrupamento . . . . 68
3.3.6 Fixa¸c˜ ao de nitrogˆ enio na presenca de paraquat . . . . 70
3.4 Conclus˜ oes . . . . 72
4 A via alternativa de aminoacila¸ c˜ ao de tRNA e o metabolismo de aspa- ragina 74 4.1 Introdu¸c˜ ao . . . . 74
4.1.1 A s´ıntese proteica . . . . 74
4.1.2 A via alternativa de aminoacila¸c˜ ao de tRNA. . . . 77
4.1.3 A utiliza¸c˜ ao da via alternativa para a produ¸c˜ ao de asparagina . . . 81
4.1.4 Influˆ encia de asparagina e glutamina na FBN . . . . 82
4.2 Objetivos . . . . 84
4.3 Resultados e discuss˜ ao . . . . 86
4.3.1 Localizac˜ ao e an´ alise dos genes da via de aminoacila¸c˜ ao de tRNA . 86 4.3.2 An´ alise da express˜ ao dos genes da via alternativa de s´ıntese prot´ eica 90 4.3.3 Influˆ encia de diferentes fontes de nitrogˆ enio na express˜ ao do gene
da nitrogenase em fun¸c˜ ao do tempo de crescimento . . . . 92
4.3.4 Utiliza¸c˜ ao da via alternativa de acila¸c˜ ao do tRNA para a forma¸c˜ ao de asparagina . . . . 97
4.3.5 Identifica¸c˜ ao da via alternativa em fixadores de nitrogˆ enio . . . 103
4.3.6 Screening dos mutantes auxotr´ oficos para asparagina . . . 104
4.3.7 Identifica¸c˜ ao e an´ alise dos mutantes . . . 105
4.4 Conclus˜ oes . . . 114
5 Materiais e M´ etodos 116 5.1 T´ ecnicas de bioinform´ atica . . . 116
5.1.1 Identifica¸c˜ ao de ORFs relacionadas ao sistema de transportadores no genoma da G. diazotrophicus PAL5 . . . 116
5.1.2 An´ alise dos clusters . . . 119
5.2 T´ ecnicas de biologia molecular . . . 119
5.2.1 Extra¸c˜ ao de DNA genˆ omico . . . 119
5.2.2 Eletroforese de DNA . . . 120
5.2.3 Extra¸c˜ ao do RNA total . . . 120
5.2.4 Eletroforese de RNA . . . 121
5.2.5 S´ıntese do cDNA . . . 121
5.2.6 Amplifica¸c˜ ao do cDNA por rea¸c˜ ao em cadeia da polimerase (PCR) 122 5.2.7 PCR em tempo real ou PCR quantitativo (qPCR) . . . 122
5.2.8 C´ alculo da quantifica¸c˜ ao relativa . . . 124
5.2.9 Obten¸c˜ ao dos mutantes aleat´ orios . . . 126
5.2.10 Caracteriza¸c˜ ao molecular dos mutantes aleat´ orios (PCR invertido) . 127 5.2.11 Purifica¸c˜ ao de DNA para rea¸c˜ ao de sequenciamento . . . 127
5.2.12 sequenciamento das regi˜ oes flanqueadores do transposon EZ-Tn5 ™ <KAN- 2>Tnp transposome ™ . . . 127
5.3 T´ ecnicas de microbiologia e bioqu´ımica . . . 128
5.3.1 Estirpes, meios e condi¸c˜ oes de cultivo . . . 128
5.3.2 Determina¸c˜ ao da produ¸c˜ ao de ROS em G. diazotrophicus . . . 129
5.3.3 Atividade de catalase . . . 130
5.3.4 Prepara¸c˜ ao de extrato celular livre de tRNA . . . 130
5.3.5 Atividade de asparagina sintetase . . . 130
5.3.6 Atividade de nitrogenase . . . 131
5.3.7 Determina¸c˜ ao de prote´ınas totais . . . 131
5.3.8 Dosagem de amino´ acidos livres por HPLC . . . 132 5.3.9 Varredura dos mutantes auxotr´ oficos para asparagina . . . 134
6 Vis˜ ao geral e perspectivas 135
Referˆ encias Bibliogr´ aficas 137
Apˆ endice 157
1.1 Estrutura do complexo da nitrogenase de Azotobacter vinelandii. As su- bunidades Fe-prote´ına est˜ ao coloridas em azul claro, marron e cinza. As subunidades da MoFe-prote´ına est˜ ao coloridas em verde, amarelo, azul es- curo e vermelho (Adaptado de Dixon [2004] por Guedes [2010]Oi). . . . 11 2.1 N´ umero genomas completos sequenciados at´ e setembro de 2009 (modificada
de http://www.genomesonline.org/gold statistics.htm - acesso em mar¸co de 2010) . . . . 20 2.2 N´ umero de projetos de sequenciamento de genoma depositados no GOLD ™
(modificada de http://www.genomesonline.org/gold statistics.htm - acesso em mar¸co de 2010) . . . . 21 2.3 Principal relevˆ ancia de projetos de genoma bacterianos realizados no mundo
(modificada de http://www.genomesonline.org/gold statistics.htm - acesso em mar¸co de 2010) . . . . 22 3.1 Express˜ ao relativa e atividade de redu¸c˜ ao do acetileno de c´ elulas de G.
diazotrophicus crescidas em meio LGI-P suplementado com 1 ou 20mM de
sulfato de amˆ onio. . . . . 61
3.2 Quantidade de ROS ´ e menor durante FBN. C´ elulas de G. diazotrophicus crescidas em condi¸c˜ oes de fixa¸c˜ ao (FIX) e n˜ ao-fixa¸c˜ ao de nitrogˆ enio (NFIX) foram incubadas com o probe CM-H2DCFDA, sens´ıvel a ROS. As Figuras A, C, E e G representam o campo claro das imagens. As Figuras B, D, F e H s˜ ao microscopias de fluorescˆ encia, e os pontos claros indicativos da presenca de ROS. Todas as imagens foram obtidas com o mesmo tempo de exposi¸c˜ ao para permitir a compara¸c˜ ao entre a intensidade dos sinais. Barra de escala: 10 μm. . . . 62 3.3 Atividade catal´ asica do extrato bruto de c´ elulas de G. diazotrophicus cresci-
das em condi¸c˜ oes de fixa¸c˜ ao (FIX) e n˜ ao-fixa¸c˜ ao de nitrogˆ enio. A atividade catal´ asica dos extratos brutos celulares foi medida monitorando-se consumo de per´ oxido de hidrogˆ enio a 240nm por 1 minuto ` a temperatura ambiente.
M´ edia +/- barra de erros de nove experimentos independentes s˜ ao mostrados. 63 3.4 Express˜ ao de enzimas de G. diazotrophicus envolvidas na detoxifi¸c˜ ao de
ROS durante o processo de FBN. Express˜ ao do mRNA correspondentes aos genes respons´ aveis pela detoxifica¸c˜ ao de ROS em c´ elulas fixando e n˜ ao- fixando nitrogˆ enio crescidas durante 72h. O n´ıvel dos transcritos ´ e represen- tado como a taxa (express˜ ao relativa) do valor absoluto do gene estudado pelo valor absoluto do gene na condi¸c˜ ao em que as c´ elulas n˜ ao fixam ni- trogˆ enio (NFIX). Os valores foram normalizados em rela¸c˜ ao a express˜ ao do gene constitutivo 23S. M´ edia +/- barra de erros de trˆ es experimentos independentes s˜ ao mostrados. . . . 67 3.5 Constru¸c˜ ao de clusters de express˜ ao dos genes de detoxifi¸c˜ ao de ROS revela
a presen¸ca de dois clusters principais: um formado pela gorB sozinha e
outro formado por gorA, kat, katC, nifD, sodA e katE. Esse cluster pode
ser dividido em trˆ es clusters menores: kat + gorA, katC e katE + sodA +
nifD. . . . 69
3.6 Efeitos de ROS no crescimento e na redu¸c˜ ao de acetileno ARA de c´ elulas de G. diazotrophicus. A) Efeito de diferentes concentra¸c˜ oes de paraquat (PQ) no crescimento de c´ elulas fixando (em preto) e n˜ ao-fixando (em cinza) nitrogˆ enio Depois de um per´ıodo inicial de 24h, foi adicionado PQ para uma concetra¸c˜ ao final de 0,5 e 5 mM (linhas tracejadas e pontilhadas, respectivamente) (B) ARA de c´ elulas depois de 72h de cultivo. A atividade foi medida depois de 48h na presen¸ca de 0,5 e 5mM de PQ. . . . 70 4.1 Dogma central da Biologia molecular proposto por Francis Crick em 1958 . 74 4.2 Mecanismo geral de atua¸c˜ ao das aminoacil-tRNA sintetases. Primeira-
mente a enzima se liga ao amin´ acido e o liga ` a uma mol´ ecula de AMP, proveniente da clivagem de um ATP. Em seguida a enzima liga essa poro aminoacil ao seu tRNA correspondente e libera a mol´ ecula de AMP. . . . . 75 4.3 Mecanismo geral de s´ıntese proteica. . . . . 76 4.4 Esquema e cartoon da via para a forma¸c˜ ao de Asn− tRN A
Asn(similar para
Gln − tRN A
Gln). Uma AspRS n˜ ao-discriminativa forma Asp − tRN A
Asn.
O aminoacil-tRNA formado ´ e ent˜ ao corrigido por uma amidotransferase
(gatCAB) na presen¸ca de ATP e de um doador do grupamento amida. . . 79
4.5 Alinhamento da por¸c˜ ao N-terminal de algumas aspartyl-tRNA sintetases bacterianas n˜ ao discriminativas. A por¸c˜ ao azul, indica a posi¸c˜ ao corres- pondente ` a Prolina 77 de arquaeas. Em bact´ erias, essa ´ e uma posi¸c˜ ao conservada, onde encontra-se sempre uma arginina, independente de ser uma aa-tRNS sintetase discriminativa ou n˜ ao. A posi¸c˜ ao vermelha, corres- pondente ` a asparagina (N) de E. coli, em enzimas n˜ ao discriminativas en- contramos sempre Treonina (T), Leucina (L) ou Alanina (A). J´ a na por¸c˜ ao marcada de amarelo (M87 de E. coli) a presen¸ca de uma leucina (L) di- minui fortemente a especificidade por tRN A
Aspe aumenta para tRN A
Asn. Foram usadas as seqˆ uencias dos seguintes organismos: Bordetella pertussis Tohama I, Escherichia coli str. K-12 substr. W3110, Helicobacter pylori 26695, Gluconacetobacter diazotrophicus PAl 5, Brucella melitensis bv. 1 str. 16M. . . . . 89 4.6 Localiza¸c˜ ao do gatCAB no genoma da G. diazotrophicus. . . . 90 4.7 Express˜ ao de enzimas da via alternativa de aminoacila¸c˜ ao de tRNA em
fun¸c˜ ao da disponibilidade de nitrogˆ enio - c´ elulas crescidas em meio LGI- P suplementado com 1 (FIX) ou 20 mM (NFIX) de sulfato de amˆ onio - ap´ os 72h de crescimento. A express˜ ao dos genes na condi¸c˜ ao de FIX de crescimento foi utilizada como calibradora e, portanto, fixada em 1. O n´ıvel dos transcritos ´ e representado como a taxa (express˜ ao relativa) do valor absoluto do gene estudado (Ct) pelo valor absoluto do gene na con- di¸c˜ ao calibradora. Os valores foram normalizados em rela¸c˜ ao ` a express˜ ao do gene constitutivo 23S. M´ edia +/- barra de erros de trˆ es experimentos independentes s˜ ao mostrados. . . . 91 4.8 Crescimento de G. diazotrophicus em meio LGI-P l´ıquido suplementado
com 1 ou 20mM de sulfato de amˆ onio ou suplementado com 20mM de as-
paragina, aspartato, glutamina ou glutamato. As c´ elulas foram cultivadas
a 30 ° C, 150 rpm. . . . 93
4.9 Express˜ ao do gene nifD em fun¸c˜ ao da disponibilidade de N no meio de cultura. As c´ elulas foram crescidas em meio LGI-P suplementado com 1 (FIX) ou 20 mM (NFIX) de sulfato de amˆ onio - e a express˜ ao relativa do gene nifD foi verificada. A express˜ ao do gene na condi¸c˜ ao FIX com 24h de cultivo foi utilizada como calibradora e, portanto, fixada em 1. O n´ıvel dos transcritos ´ e representado como a taxa (express˜ ao relativa) do valor absoluto do gene estudado (Ct) pelo valor absoluto do gene na con- di¸c˜ ao calibradora. Os valores foram normalizados em rela¸c˜ ao ` a express˜ ao do gene constitutivo 23S. M´ edia +/- barra de erros de trˆ es experimentos independentes s˜ ao mostrados. . . . 96 4.10 Rela¸c˜ ao entre os n´ıveis intracelulares de asparagina, glutamina e aspartato
(apresentados na Tabela 4.3) e a express˜ ao do nifD (apresentados na Fi- gura 4.9). Podemos observar no primeiro gr´ afico que enquanto os n´ıveis de asparagina est˜ ao at´ e em torno de 40 uM, ainda pode-se observar a ex- press˜ ao do gene nifD. A partir desta concentra¸c˜ ao a express˜ ao do gene nifD encontra-se sempre reprimida. A an´ alise com glutamina e aspartato n˜ ao mostra nenhuma rela¸c˜ ao entre as concentra¸c˜ oes intracelulares destes amino´ acidos e a express˜ ao do gene nifD. . . . 97 4.11 Atividade de asparagina sintetase dependente de tRNA. Quantidade de
[
14C]asparagina formada pela convers˜ ao de [
14C]aspartato por c´ elulas de G. diazotrophicis e E. coli (controle positivo) livres de tRNA. M´ edia +/- barra de erros de trˆ es experimentos independentes s˜ ao mostrados. . . 102 4.12 Exemplo de placas utilizadas para a sele¸c˜ ao dos mutantes auxotr´ oficos para
asparagina. Os mutantes que n˜ ao cresceram na placa “A” (meio LGI-P su-
plementado com sulfato de amˆ onio), mas cresceram na placa “B” (meio
LGI-P suplementado com asparagina) foram selecionadas para experimen-
tos subseq¨ uentes. . . 105
4.13 Representa¸c˜ ao gr´ afica da via metab´ olica do ciclo do ´ acido tricarboxilico, onde est´ a destacado (em vermelho) a enzima PEPCase. Fonte: Kegg - Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. . . 107 4.14 Atividade de nitrogenase (em nmoles de etileno . mg
−1. h
−1) da estirpe
selvagem PAL5 e mutante fosfoenolpiruvato carboxilase (MUT4) em meio LGIP semi-s´ olido suplementado com diferentes 1 mM de sulfato de amˆ onio ou diferentes concentra¸c˜ oes de asparagina (1, 5 ou 20 mM). M´ edia +/- barra de erros de dois experimentos independentes s˜ ao mostrados. . . 108 4.15 Representa¸c˜ ao gr´ afica via do metabolismo de glutamato, onde destaca-
se (em vermelho) a enzima Amidofosforibosil transferase. Fonte: Kegg - Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. . . 109 4.16 Atividade de nitrogenase (em nmoles de etileno . mg
−1. h
−1) da estirpe
selvagem PAL5 e mutante Amidofosforibosil transferase (MUT14) em meio LGIP semi-s´ olido suplementado com diferentes 1 mM de sulfato de amˆ onio ou diferentes concentra¸c˜ oes de asparagina (1, 5 ou 20 mM). M´ edia +/- barra de erros de dois experimentos independentes s˜ ao mostrados. . . 110 4.17 Atividade de nitrogenase (em nmoles de etileno . mg
−1. h
−1) da estirpe sel-
vagem PAL5 e mutante Permease do sistema de transporte de D-metionina metI (MUT98) em meio LGIP semi-s´ olido suplementado com diferentes 1 mM de sulfato de amˆ onio ou diferentes concentra¸c˜ oes de asparagina (1, 5 ou 20 mM). M´ edia +/- barra de erros de dois experimentos independentes s˜ ao mostrados. . . . 111 4.18 Representa¸c˜ ao gr´ afica da via de metabolismo de nitrogˆ enio, onde destaca-se
(em vermelho) a enzima Glutamato sintase. Fonte: Kegg - Kyoto Encyclo-
pedia of Genes and Genomes. . . 112
4.19 Atividade de nitrogenase (em nmoles de etileno . mg
−1. h
−1) da estirpe selvagem PAL5 e mutante Glutamato sintase (MUT35) em meio LGIP semi-s´ olido suplementado com diferentes 1 mM de sulfato de amˆ onio ou diferentes concentra¸c˜ oes de asparagina (1, 5 ou 20 mM). M´ edia +/- barra de erros de dois experimentos independentes s˜ ao mostrados. . . . 113 6.1 Esquema mostrando como a obten¸c˜ ao de determinados genes conferiu van-
tagens ` a G. diazotrophicus e a permitiu colonizar um novo nicho ecol´ ogico. 136
1.1 Exemplos de gˆ eneros de organismos diazotr´ oficos . . . . 8 2.1 Descri¸c˜ ao das ORFs identificadas com pertencentes ou relacionadas com o
sistema de transportes no genoma da G. diazotrophicus . . . . 32 2.2 Compara¸c˜ ao entre o sistema de transportes no genoma da G. diazotrophicus
com outros genomas publicados . . . . 43 2.3 Principais classes de transportadores anotados no genoma de G. diazotroph-
icus . . . . 44 3.1 Identifica¸c˜ ao dos genes respons´ aveis por detoxifica¸c˜ ao de ROS em G. dia-
zotrophicus . . . . 64 3.2 Tipos de catalase . . . . 66 4.1 Influˆ encia de diferentes fontes de nitrogˆ enio na atividade da nitrogenase,
utilizando-se o m´ etodo de redu¸c˜ ao do acetileno, em G. diazotrophicus cres- cida em meio LGI-P a 30 ° C ap´ os 72h de crescimento. . . . 83 4.2 Influˆ encia de diferentes fontes de nitrogˆ enio na express˜ ao do gene da nitro-
genase em fun¸c˜ ao do tempo de crescimento . . . . 94 4.3 Concentra¸c˜ ao em μ M medida por HPLC de amino´ acidos livres intracelula-
res de c´ elulas de G. diazotrophicus crescidas em meio LGI-P suplementado
com 1 (FIX) ou 20 mM (NFIX) de N H
4SO
4em fun¸c˜ ao do tempo de cultivo. 95
4.4 Identifica¸c˜ ao da enzima gatCAB, da via alternativa de acila¸c˜ ao de tRNA, em todos os organismos que n˜ ao possuem os genes que codificam para as enzimas asparagina sintetase A ou B (asnA e asnB ). . . . . 99 4.5 Identifica¸c˜ ao da via de s´ıntese de asparagina e da via alternativa de acila¸c˜ ao
de tRNA em organismos com capacidade de fixar nitrogˆ enio. . . 104 4.6 Seq¨ uˆ encias obtidas dos produtos de iPCR dos mutantes aleat´ orios. . . . 106 5.1 Primers qPCR . . . 124 5.2 Eficiˆ encia dos oligonucleot´ıdeos. Nome do gene, temperatura de desnatu-
ra¸c˜ ao (TM), o R
2da curva de eficiˆ encia e a eficiˆ encia de amplifica¸c˜ ao de cada um dos oligonucleot´ıdeos utilizados nesse trabalho. A eficiˆ encia foi calculada utilizando a f´ ormula E = 10
(−1/slope)e %E = (E − 1) ∗ 100 . . . . 126 5.3 Quantidades de ´ agar acrescidos aos meios l´ıquidos a fim de se obter meios
semi-s´ olidos ou s´ olidos. . . 129
qu´ımicas
23S DNA que codifica para o gene 23S aaRS aminoacil-tRNA sintetase
ABC “ATP-binding Cassette Transporter”
ADP Adenosina Difosfato
AdT Amidotransferase tRNA espec´ıfica AMP Adenosina monofosfato
ARA Ativididade de redu¸c˜ ao de acetileno
Asn Asparagina
Asp Aspartato
ATP Adenosina Trifosfato
BASF Badissche Anilin- und Soda-Fabrik BLAST “Basic Local Alignment Sequence Tool”
cDNA DNA complementar
COG ”Clusters of Orthologous Groups”
Ct “Threshold cycle”
D-AspRS Aspartil-tRNA sintetase espec´ıfica DNA Acido Desoxirribonucleico ´
DTT Ditiotreitol
EC “Enzyme Comission”
EDTA Acido etilenodiamino tetra-ac´ ´ etico
EMBL “European Molecular Biology Laboratories”
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecu´ aria
FAPERJ Funda¸c˜ ao de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro FBN Fixa¸c˜ ao Biol´ ogica de Nitrogˆ enio
Fe-prote´ına Ferro-prote´ına da nitrogenase
FIX c´ elulas crescidas com 1 mM de sulfato de amˆ onio
g Gramas
g/L Grama por Litro
GDB “Human Genome Database”
GDI Gluconacetobacter diazotrophicus
GLIMMER “Gene Locator and Interpolated Markov ModelER”
Gln Glutamina
Glu Glutamato
Glu/Asp- AdT
Glutamina/asparagina amidotransferase tRNA espec´ıfica
GOGAT Glutamato sintase
GOLD
T MGenomes OnLine Database
GR Glutationa redutase
GSDB “Genome Sequence Data Base”
GTP Guanosine-5’-triphosphate
h Hora
HPLC Cromatografia l´ıquida de alto desempenho IAA Acido indol ac´ ´ etico
iPCR PCR invertido
Kat Catalase
KCl Cloreto de pot´ assio
KEGG ”Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes”
kPa Kilopascal
LNCC Laborat´ orio Nacional de Computa¸c˜ ao Cient´ıfica Mb Milh˜ oes de pares de bases
MFS “Major Facilitator Superfamily”
mL Mililitro
mM Milimolar
MoFe- prote´ına
Prote´ına Ferro-Molibdˆ enio da nitrogenase
N aOH Hidr´ oxido de s´ odio
NCBI ”National Center for Biotechnology Information”
ND-AspRS Aspartil-tRNA sintetase n˜ ao discriminativa
NFIX c´ elulas crescidas com 20 mM de sulfato de amˆ onio N H
3Amˆ onia
N H
4Amˆ onio
(N H
4)
2SO
4Sulfato de amˆ onio
nmoles nanomoles
C Celsius
ORF Fase de leitura aberta
PCR Rea¸c˜ ao em cadeia da polimerase PDB “Protein Data Bank”
PEPCase Fosfoenol piruvato carboxilase pH Potencial Hidrogeniˆ onico
pHi Potencial Hidrogeniˆ onico interno pHo Potencial Hidrogeniˆ onico externo PHYLIP “Phylogeny Inference Package”
PIR “Protein Information Resourse”
PMSF Fenilmetilsulfonil fluorido
PQ Paraquat
qPCR PCR quantitativo RNA Acido ribonucleico ´
RND “Resistance Nodulation Division”
ROS Esp´ ecies reativas de oxigˆ enio rRNA RNA ribossˆ omico
SOD Super´ oxido dismutase
TAE Tris Acetato EDTA
TCA Acido tricloroac´ ´ etico
TCDB “Transport Classification Database”
TIGR The Institute for Genomic Research
TM Marca registrada
tRNA RNA transportador ou ARN de transferˆ encia UENF Universidade Estadual do Norte Fluminense UERJ Universidade Estadual do Rio de Janeiro UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro
w/v massa por volume
WGS ”Whole-Genome Shotgun Sequencing”
μ g Micrograma
μ M Micromolar
Introduc˜ ao
O desenvolvimento do equipamento e das t´ ecnicas que permitem o sequenciamento auto- matizado de fragmentos de DNA e de genomas completos est´ a na base do aparecimento da nova ´ area cient´ıfica da Genˆ omica. De fato, desde 1995, data em que foi disponibi- lizada a primeira sequˆ encia completa do genoma de um ser vivo (da esp´ ecie bacteriana Haemophilus influenza ), as abordagens genˆ omicas e p´ os-genˆ omicas vieram revolucionar a forma de investigar e de desenvolver qualquer atividade nas v´ arias vertentes da Bio- logia. De acordo com o banco de dados GOLD ™ - Genomes OnLine Database v. 3.0 (www.genomesonline.org) - existem hoje, mar¸co de 2010, cerca de 1100 genomas comple- tos publicados, incluindo o genoma humano, e acredita-se que at´ e o final de 2010, cerca de 5000 sequˆ encias estar˜ ao dispon´ıveis.
Esta quantidade de informa¸c˜ ao genˆ omica abriu as portas para o surgimento da pro- teˆ omica, que ´ e o estudo do conjunto das prote´ınas expressas em uma c´ elula. Veio tamb´ em incentivar a nova ´ area inter- e trans-disciplinar da Bioinform´ atica, que envolve a Biologia, a Estat´ıstica e a Inform´ atica. As informa¸c˜ oes geradas por essas abordagens permitiram a constru¸c˜ ao de numerosas bases de dados, com informa¸c˜ ao em escala genˆ omica e ferra- mentas computacionais associadas.
O grande desafio dos pesquisadores que atualmente trabalham nestas ´ areas de conhe-
cimento ´ e conseguir relacionar a grande quantidade de informa¸c˜ ao gerada pelas an´ alises
genˆ omicas e proteˆ omicas com os aspectos fisiol´ ogicos do organismo estudado, entender finalmente como os genes afetam o a fisiologia das c´ elulas e s˜ ao por ela afetados. A seu favor, aqueles que se aventuram por essa ´ area contam com essa enorme quantidade de in- forma¸c˜ ao gerada por an´ alises “high-throughput”. Por outro lado, essa grande quantidade de informa¸c˜ ao gera uma grande quantidade de perguntas e cabe ao pesquisador selecionar aquelas mais relevantes para a compreens˜ ao da fisiologia do organismo estudado.
Dentro deste cen´ ario esse trabalho foi dedicado ao estudo da genˆ omica funcional da bact´ eria Gluconacetobacter diazotrophicus. Seu sequenciamento foi finalizado em 2008 junto com os primeiros estudos de proteˆ omica. Devido ` a complexidade de seu genoma e de suas intera¸c˜ oes com a cana-de-a¸c´ ucar, seu principal hospedeiro, essa an´ alise funcional requer o conhecimento da fisiologia integrativa. No presente trabalho utilizamos diversas t´ ecnicas que v˜ ao desde a an´ alise da express˜ ao gˆ enica utilizando a t´ ecnica de PCR em tempo real (qPCR, de quantitative polimerase chain reaction), at´ e a quantifica¸c˜ ao de intermedi´ arios metab´ olicos por cromatografia, passando por t´ ecnicas de microscopia de fluorescˆ encia e enzimologia. Estes estudos foram focados principalmente em aspectos da fixa¸c˜ ao biol´ ogica de nitrogˆ enio e s´ıntese de prote´ınas e na habilidade da bact´ eria em fixar nitrogˆ enio na presen¸ca de oxigˆ enio. Apesar de voltados para uma poss´ıvel aplica¸c˜ ao biotecnol´ ogica, s˜ ao estudos que abrem novas perspectivas de compreens˜ ao de mecanismos fisiol´ ogicos do organismo estudado e que podem vir a ser utilizados por outros modelos de estudo.
Devido a variedade de temas abordados esta tese foi separada em seis cap´ıtulos:
• O primeiro cap´ıtulo (1) consiste numa introdu¸c˜ ao geral sobre a fixa¸c˜ ao de nitro- gˆ enio e sobre o modelo de estudo utilizado.
• O segundo cap´ıtulo (2) aborda o processo de identifica¸c˜ ao e an´ alise dos transpor- tadores de G. diazotrophicus.
• No terceiro cap´ıtulo (3) se encontra um estudo sobre a influˆ encia de esp´ ecies
reativas de oxigˆ enio (ROS) no processo de FBN e do estado redox da c´ elula durante este processo.
• O quarto cap´ıtulo (4) trata da existˆ encia de uma prov´ avel via alternativa de ami- noacila¸c˜ ao de tRNA em G. diazotrophicus, sua influˆ encia na forma¸c˜ ao de aspargina e suas implica¸c˜ oes no processo de FBN.
• O quinto cap´ıtulo (5) apresenta os materiais e m´ etodos utilizados para a realiza¸c˜ ao dos estudos tratados nos cap´ıtulos anteriores.
• O sexto cap´ıtulo (6) apresenta uma conclus˜ ao geral da tese e perspectivas deste trabalho e ´ e seguido pelas Referˆ encias bibliogr´ aficas e pelo Apˆ endice, que con- tˆ em os manuscritos dos trabalhos desenvolvidos durante esta tese.
1.1 A Fixa¸ c˜ ao de Nitrogˆ enio: Origem e hist´ orico.
Formas complexas e variadas de vida existem na Terra h´ a pelo menos 3,5 bilh˜ oes de anos,
e, independente de suas diferen¸cas entre si, todas s˜ ao fundamentadas na existˆ encia de ma-
cromol´ eculas biol´ ogicas. Estas macromol´ eculas podem ser divididas em quatro grandes
grupos: ´ acidos nucl´ eicos, prote´ınas, carboidratos e lip´ıdios. O nitrogˆ enio ´ e o elemento b´ a-
sico de dois destes grupos de macromol´ eculas: os ´ acidos nucl´ eicos e as prote´ınas. Embora
amplamente presente na sua forma orgˆ anica, a maior parte do nitrogˆ enio da Terra est´ a
na sua forma gasosa (N
2). A produ¸c˜ ao da forma b´ asica de nitrogˆ enio orgˆ anico, a amˆ onia
(N H
3) requer necessariamente a quebra do nitrogˆ enio atmosf´ erico e sua liga¸c˜ ao com ´ ato-
mos de hidrogˆ enio (H). O processo de transforma¸c˜ ao do nitrogˆ enio atmosf´ erico na sua
forma orgˆ anica (N H
3) ´ e chamado ent˜ ao de fixa¸c˜ ao de nitrogˆ enio. Esta rea¸c˜ ao, embora
seja termodinamicamente favor´ avel, n˜ ao ocorre espontaneamente visto que os dois ´ ato-
mos de nitrogˆ enio da mol´ ecula de N
2encontram-se unidos atrav´ es de uma tripla liga¸c˜ ao
muito est´ avel e necessitam, para o rompimento destas, uma energia de ativa¸c˜ ao muito
alta. Considerando-se a importˆ ancia da forma orgˆ anica do nitrogˆ enio para a forma¸c˜ ao de macromol´ eculas essenciais para a vida, o estudo do processo de fixa¸c˜ ao de nitrogˆ enio recebeu grande aten¸c˜ ao desde o final do s´ eculo XVIII. Foi nesta ´ epoca que descobriu-se que a amˆ onia era composta de um ´ atomo de nitrogˆ enio e trˆ es de hidrogˆ enio. A partir de tal descoberta, qu´ımicos do mundo todo tentavam sintetizar amˆ onia a partir destes gases, abundantes na natureza, sem sucesso. Foi o qu´ımico Fritz Haber que em 1909 chegou ` a solu¸c˜ ao deste problema de longa data na qu´ımica. Quando ele e seu assistente Robert Le Rossignol o conseguiram em dif´ıceis condi¸c˜ oes de laborat´ orio, o processo pro- duzia apenas uma pequena quantidade de amˆ onia em longos espa¸cos de tempo, excluindo qualquer esperan¸ca de produ¸c˜ ao industrial. Era preciso descobrir um catalisador para acelerar a rea¸c˜ ao. Ap´ os experiˆ encias com incont´ aveis metais, descobriu que o p´ o do raro metal ´ osmio (do qual existiam apenas 110 quilos no mundo) produzia o efeito desejado.
Num dos grandes dias da qu´ımica, 2 de julho de 1909, Haber fez uma demonstra¸c˜ ao de sua produ¸c˜ ao de amˆ onia, a uma taxa de setenta gotas por minuto, na presen¸ca de dois diretores t´ ecnicos de uma grande empresa qu´ımica (Badissche Anilin- und Soda-Fabrik, BASF), Alywin Mittasch e Carl Bosch. A BASF pressionou ent˜ ao Bosch e Mittasch a melhorar o processo de Haber. Embora a empresa tivesse comprado todo o estoque de
´
osmio do mundo, a equipe estava decidida a encontrar um catalisador mais r´ apido e mais abundante. Ap´ os quatro mil experiˆ encias, produziram um catalizador ideal, composto de ferro, ´ oxidos de alum´ınio, c´ alcio e pot´ assio. A receita continua praticamente sem mudan¸ca at´ e hoje. O processo Haber-Bosch, como veio a ser conhecido, responde por 99% do ni- trogˆ enio orgˆ anico produzido no mundo, o equivalente a cerca de 130 milh˜ oes de toneladas de amˆ onia por ano; 4/5 disso v˜ ao para os fertilizantes. Como o nitrogˆ enio fixado quase sempre foi o maior limitante na agricultura, a descoberta do processo de fixa¸c˜ ao de nitro- gˆ enio representou um enorme avan¸co para a humanidade e permitiu que esta alcan¸casse a incr´ıvel marca 6,6 bilh˜ oes bilh˜ oes de habitantes em 2007, em vez dos 3,6 bilh˜ oes que seriam o m´ aximo previsto sem essa descoberta [Goran, 1947].
Apesar da grande eficiˆ encia deste processo, ele ainda necessita empregar altas tem-
peraturas (400 a 600 ° C), press˜ oes elevadas (100 a 200 atm) e utiliza catalisadores a base de ferro. Isso representa um gasto enorme de fontes energ´ eticas n˜ ao renov´ aveis que ge- ralmente ´ e calculado em seis barris de petr´ oleo por tonelada de N H
3sintetizada. Con- siderando que a limita¸c˜ ao de nitrogˆ enio ´ e um dos principais problemas na produtividade agr´ıcola e que a utiliza¸c˜ ao de fertilizantes nitrogenados ´ e largamente utilizada, pode-se calcular que o gasto energ´ etico utilizado na produ¸c˜ ao destes fertilizantes chega ` a incr´ıvel marca de 5% da produ¸c˜ ao mundial de g´ as natural [Smil, 2000]. Al´ em disso, a larga utili- za¸c˜ ao de fertilizantes nitrogenados acabou com a necessidade da utiliza¸c˜ ao do tradicional meio de enriquecimento do solo por rotatividade das culturas e da utiliza¸c˜ ao de esterco animal para fertilizar o solo. O resultado disso ´ e uma cont´ınua perda de mat´ eria orgˆ anica do solo, levando-se em ´ ultima instˆ ancia a um desequil´ıbrio do solo e a perda da sua capa- cidade de reter ´ agua e manter popula¸c˜ oes de microrganismos. Atualmente, a maioria dos campos agr´ıcolas n˜ ao funciona como unidades recicladoras da mat´ eria orgˆ anica gerada.
Observa-se, ao contr´ ario, todo o rejeito animal e de plantas, que s˜ ao ricos em nitrogˆ e- nio, sendo dispensados como lixo comum causando um enorme impacto ambiental. Como agravante, tal problema ocorre principalmente em locais onde a pr´ atica inapropriada do cultivo agr´ıcola, incentivado pelos baixos pre¸cos dos fertilizantes nitrogenados que, aliado
`
a pol´ıtica de subs´ıdios agr´ıcolas, aumentam ainda mais o impacto de tais medidas. Nes- tas circunstˆ ancias apenas metade (no m´ aximo) no nitrogˆ enio aplicado no solo chega ` as plantas. O resto ´ e lixiviado pela chuva e atinge len¸c´ ois fre´ aticos, rios e ´ aguas costeiras.
O resultado ´ e a crescente eutrofiza¸c˜ ao de tais ambientes, altamente prejudicial ` a vida marinha. E h´ a de se considerar ainda o perigo para a sa´ ude humana quando tais len¸c´ ois fre´ aticos entram em contato com fontes de ´ agua pot´ avel.
Al´ em de todos estes problemas, a oxida¸c˜ ao da ur´ eia e do amˆ onio ` a nitrato progressi- vamente levam ` a acidifica¸c˜ ao do solo – um dos principais problemas agr´ıcolas no mundo.
Outro problema relacionado ´ e a emiss˜ ao de ´ oxidos do nitrogˆ enio (NOx) por microrganis-
mos agindo nos fertilizantes. Estes ´ oxidos s˜ ao altamente vol´ ateis, o que causa ` a perda de
quase 50% da amˆ onia aplicada, al´ em disto, estes ´ oxidos depois de volatilizados acabam
voltando para o solo, desta vez de uma maneira mais dr´ astica, atrav´ es da chuva ´ acida.
Alguns destes problemas podem ser contornados simplesmente pelo uso mais efici- ente dos fertilizantes aplicados, utilizando-se doses adequadas e respeitando-se os tem- pos entre as aplica¸c˜ oes. Uma outra abordagem que contorna os problemas descritos ´ e a utiliza¸c˜ ao da fixa¸c˜ ao biol´ ogica de nitrogˆ enio (FBN). A FBN ´ e um processo realizado por diferentes classes de microrganismos, exclusivamente procari´ oticos, que consiste na transforma¸c˜ ao do nitrogˆ enio atmosf´ erico em amˆ onia atrav´ es de uma enzima chamada de nitrogenase. Do ponto de vista energ´ etico, ele tamb´ em ´ e dispendioso para o microrga- nismo que o realiza, por´ em, por ser catalizado por uma enzima, a energia de ativa¸c˜ ao necess´ aria para a ocorrˆ encia do processo ´ e bem menor do que no processo inorgˆ anico. De fato, o pr´ oprio Fritz Haber chamou a aten¸c˜ ao para a FBN quando terminou seu discurso de aceita¸c˜ ao do Nobel de Qu´ımica, em 1920, com as seguintes palavras:
“Pode ser que esta n˜ ao seja a solu¸ c˜ ao final. As bact´ erias do nitrogˆ enio nos dizem que a Natureza, com suas sofisticadas formas de qu´ımica da mat´ eria viva, compreende e utiliza m´ etodos que n´ os ainda n˜ ao sabemos imitar. Neste meio tempo, nos basta que a ind´ ustria qu´ımica traga as riquezas nutritivas e venha ajudar o camponˆ es que, na boa terra, transforma pedras em p˜ ao.”
1Quatro anos depois deste discurso de Haber, em Aussig, na Rep´ ublica Tcheca, nasceu Johanna D¨ obereiner. Em 1950 ela se formou em agronomia pela Universidade de Munique apresentando monografia de conclus˜ ao de curso intitulada “Bact´ erias na fixa¸c˜ ao assimbi´ o- tica de nitrogˆ enio e a possibilidade de seu aproveitamento na agricultura”. Poucos meses depois emigrou para o Brasil, onde foi contratada pelo ent˜ ao Instituto de Ecologia e Ex- perimenta¸c˜ ao Agr´ıcola, atual Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia da Embrapa, localizado no munic´ıpio de Serop´ edica, estado do Rio de Janeiro. Brasileira naturalizada, publicou uma s´ erie de trabalhos sobre o enriquecimento seletivo de bact´ erias fixadoras de nitrogˆ enio. Os grupos que dirigiu na Embrapa e na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro iniciaram, em 1963, um extenso programa de pesquisas sobre v´ arios aspectos da fixa¸c˜ ao biol´ ogica do nitrogˆ enio por plantas cultivadas, acumulando dados e resultados
1Traduc˜ao livre de Fritz Haber, Haber, F. 1920. The synthesis of ammonia from its elements.
http://nobelprize.org/nobel prizes/chemistry/laureates/1918/haber-lecture.pdf
que indicam a superioridade desses recursos naturais sobre a utiliza¸c˜ ao de fertilizantes minerais.
Na introdu¸c˜ ao oficial do cultivo da soja no Brasil, no final da d´ ecada de 50, D¨ obe- reiner se posicionou a favor do aproveitamento das associa¸c˜ oes entre a planta e bact´ erias fixadoras de nitrogˆ enio, opondo-se ` a utiliza¸c˜ ao obrigat´ oria de adubos nitrogenados. A ado-
¸c˜ ao desta linha de pensamento resultou, ao longo dos anos seguintes, numa consider´ avel economia para o pa´ıs. Seus estudos sobre fixa¸c˜ ao biol´ ogica de nitrogˆ enio proporcionaram o desenvolvimento de uma tecnologia capaz de diminuir ou at´ e mesmo eliminar a depen- dˆ encia de aduba¸c˜ ao nitrogenada na cultura, poupando atualmente ao pa´ıs entre um e dois bilh˜ oes de d´ olares por ano. Tal tecnologia faz com que o Brasil tenha o menor custo de produ¸c˜ ao de soja do mundo, se estabelecendo como o segundo maior produtor mundial do gr˜ ao. As possibilidades abertas pelo achado em rela¸c˜ ao ` a atividade agr´ıcola motivaram a cria¸c˜ ao do Programa de Coopera¸c˜ ao Internacional em Fixa¸c˜ ao de Nitrogˆ enio nos Tr´ opicos, sob coordena¸c˜ ao de Johanna D¨ obereiner. Em 1997, assim como Fritz Haber em 1918, ela foi indicada para o Prˆ emio Nobel de Qu´ımica por seus trabalhos sobre a fixa¸c˜ ao biol´ ogica de nitrogˆ enio.
1.2 A Fixa¸ c˜ ao Biol´ ogica de Nitrogˆ enio.
O processo de FBN ´ e realizado por diferentes classes de microrganismos, chamados de mi-
crorganismos diazotr´ oficos. Eles s˜ ao exclusivamente procari´ oticos, mas podem ser arqueas
metanogˆ enicas ou bact´ erias aer´ obicas, anaer´ obicas, Gram positivas, Gram negativas, he-
terotr´ oficas, autotr´ oficas e fototr´ oficas.
Tabela 1.1: Exemplos de gˆ eneros de organismos diazotr´ oficos
De vida livre Simbi´oticos Endof´ıticos Aer´obicos Anaer´obicos Leguminosas N˜ao-leguminosas
Azotobacter Firmibacterias Rhizobium Frankia Azospirillum Beijerinkia Desulfovibrio Bradyrhizobium Anabaena Gluconacetobacter
Nostoc Rhodospirillum Azoarcus
Methanococcus Herbaspirillum