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Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ

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Estudos de genˆ omica funcional em Gluconacetobacter diazotrophicus : ˆ enfase no metabolismo redox e nas vias alternativas de aminoacila¸ c˜ ao e

s´ıntese de asparagina

Sylvia Maria Campbell Alqu´ eres

Rio de Janeiro

2010

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Estudos de genˆ omica funcional em Gluconacetobacter diazotrophicus : ˆ enfase no metabolismo redox e nas vias alternativas de aminoacila¸ c˜ ao e

s´ıntese de asparagina

Sylvia Maria Campbell Alqu´ eres

Orientador: Orlando B. Martins

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de P´ os-Gradua¸c˜ ao em Qu´ımica Biol´ ogica, Instituto de Bioqu´ımica M´ edica da UFRJ, como parte dos requisitos necess´ arios ` a obten¸c˜ ao do t´ıtulo de Doutor em Qu´ımica Biol´ ogica.

Rio de Janeiro

2010

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Estudos de genˆ omica funcional em Gluconacetobacter diazotrophicus: ˆ enfase no metabolismo redox e nas vias alternativas de aminoacila¸c˜ ao e s´ıntese de asparagina

Orientador: Orlando Bonif´ acio Martins

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de P´ os-Gradua¸c˜ ao em Qu´ımica Biol´ ogica, Instituto de Bioqu´ımica M´ edica da UFRJ, como parte dos requisitos necess´ arios ` a

obten¸c˜ ao do t´ıtulo de Doutor em Qu´ımica Biol´ ogica.

Aprovada por:

Prof. Dr. Alexandre Rosado Inst. Microbiologia CCS - UFRJ

Prof. Dr. F´ abio Lopes Olivares

Centro de Biociˆ encias e Biotecnologia IB - UFRJ

Prof. Dr. Jos´ e Ivo Baldani

Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia - EMBRAPA

Prof. Dr. Russolina Zingali

Inst. Bioqu´ımica M´ edica CCS - UFRJ

Prof. Dr. Orlando Martins

Inst. Bioqu´ımica M´ edica CCS - UFRJ

Prof. Dr. Adriana Hemerly

Inst. Bioqu´ımica M´ edica CCS - UFRJ

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A minha fam´ılia: meus pais, irm˜ ` aos e Tin. Ao Carlos Eduardo.

Agradecimentos

Ao Orlando. J´ a faz 10 anos que eu entrei no seu laborat´ orio e em todo esse tempo eu devo ter pensado um milh˜ ao de vezes ”uau, como eu sou sortuda de estar aqui”. Al´ em de gostar muito da maneira como vocˆ e pensa as quest˜ oes experimentais, da maneira com que vocˆ e coloca os problemas cient´ıficos, eu ainda tive a oportunidade de ver o seu engajamento na luta por fazer UFRJ uma faculdade melhor, mais integrada, com mais recursos, que acolhesse mais alunos, e que em ultima instˆ ancia, desempenhasse o seu papel de fazer do Rio uma cidade melhor.

Ao meu orientador e amigo Alex que sempre me ajudou muito em todos os trabalhos desenvolvidos, com bom humor e otimismo e uma leveza de se encarar os experimentos que sempre tornou o ambiente do laborat´ orio mais divertido e entusiasmante.

Ao meu irm˜ ao Welington, que foi essencial para minha forma¸c˜ ao como bioqu´ımica.

Foi quem me explicou tudo sobre o ent˜ ao departamento de bioquimica m´ edica, quem me deu aulas de metabolismo energ´ etico, me preparou para as provas do mestrado, e discutiu n˜ ao s´ o experimentos e mas tamb´ em muitas coisas da vida.

Ao Z´ e, grande figura deste laborat´ orio. Quero agradecer pela grande ajuda nos experimentos, mas principalmente na reda¸c˜ ao do paper, ao tomar a frente e fazer as coisas acontecerem quando eu estava demorando muito.

Ao professor Jonathan Trent, por abrir meus olhos para ver a poesia e o caos escon- didos nos processos celulares.

Ao Eduardo Mattos, quem me explicou o b´ asico de Glucona, quando eu n˜ ao tinha nem id´ eia de por onde come¸car a estudar o assunto novo. Pelas cr´ıticas claras e essenciais ao trabalho.

Professor Ivo Baldani que me recebeu em seu laborat´ orio onde passei ´ otimos mo-

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inclusive), pelo excelente ambiente de trabalho.

A professora Adriana Hemerly pela revis˜ ao e acompanhamento desta tese e por abrir seu laborat´ orio sempre que precisei fazer experimentos. E ao pessoal do JB, que me recebeu muito bem quando fui fazer experimentos l´ a.

Ao professor Paulo Ferreira.

Ao Marcelo Bertalan, por toda a ajuda com a bioinform´ atica.

A Helma, que al´ em de um doce ´ e uma ´ otima companheira de trabalho, pela ajuda nos testes de ARA e discuss˜ oes sobre os projetos.

Ao Luc, pela ajuda na constru¸c˜ ao dos mutantes aleat´ orios.

A Maria Clara, Milane e Marcos Sorgine, pela grande ajuda nos primeiros qPCRs. ` Ao Jordano, pela ajuda na realiza¸c˜ ao das HPLC.

Ao Marcus e a Renata, que durante o desenvolvimento da tese tiraram in´ umeras d´ uvidas sobre sistema respirat´ orio, mitocˆ ondrias, ROS e etc. E deram ´ otimas dicas para o trabalho.

Ao Ricardo por me ensinar a importˆ ancia de se fazer ciˆ encia usando uma pergunta e apenas duas amostras.

Ao Ramon e Nathalia, meus melhores amigos. Por estarem presentes nos principais momentos da minha vida. Por dividirem comigo uma vis˜ ao original e clara sobre a vida e sobre as pessoas.

Ao professor Pedro pelo incentivo sempre.

Ao Rodrigo, meu orientador de mestrado que sempre foi um exemplo para mim.

As meninas Aline, Cynthia, Vivi e Roberta, que trouxeram uma vida nova ao nosso ` laborat´ orio.

A Tereza, Patr´ıcia e Leonardo, da secretaria de p´ ` os gradua¸c˜ ao.

(8)

A Gluconacetobacter diazotrophicus ´ e um organismo endof´ıtico estritamente aer´ obico, iso- lado de cana-de-a¸c´ ucar, que fixa nitrogˆ enio (N

2

). Seu sequenciamento foi finalizado em 2008 junto com os primeiros estudos de proteˆ omica. Dentro deste cen´ ario esse trabalho foi dedicado ao estudo da genˆ omica funcional desta bact´ eria. Estes estudos foram focados em trˆ es diferentes temas: o primeiro deles foi a identifica¸c˜ ao dos tranportadores presentes na bact´ eria pela an´ alise de seu genoma, o segundo tema foi a influˆ encia de esp´ ecies reativas de oxigˆ enio (ROS) no processo de fixa¸c˜ ao biol´ ogica de nitrogˆ enio (FBN) por essa bact´ eria;

e o terceiro foi a an´ alise de uma via alternativa para a aminoacila¸c˜ ao de tRNA e produ¸c˜ ao de asparagina.

Dentro do primeiro tema estudado observou-se que cerca de 45% dos tranportadores anotados pertecem ` a classe de transportadores ativos prim´ arios, 30% ` a classe de trans- portadores ativos secund´ arios e 12% s˜ ao relacionados ` a forma¸c˜ ao de poros e canais na membrana celular. Entre os transportadores identificados vale ressaltar a presen¸ca de 23 genes transportadores do tipo TonB que est˜ ao ligados ` a capta¸c˜ ao de ferro extracelular, a presen¸ca de 40 genes da fam´ılia RND e uma grande quantidade de genes para exportar metais pesados e outros compostos t´ oxicos, que podem conceder ` a bact´ eria uma not´ a- vel resistˆ encia a ambientes in´ ospitos, e a presen¸ca de transportadores de um sistema de secre¸c˜ ao do tipo IV, que confere ` a bact´ eria a capacidade de transportar macromol´ eculas atrav´ es de seu envelope at´ e a planta. Acredita-se que isso tenha um papel relevante no reconhecimento celular, no curso da intera¸c˜ ao planta-bact´ eria.

Dentro do segundo tema estudado abordamos a influˆ encia de ROS no processo de

(9)

ATP fornecida pela respira¸c˜ ao aer´ obica. No entanto, a atividade da nitrogenase ´ e ex- tremamente sens´ıvel ` a presen¸ca de oxigˆ enio e possivelmente ` a ROS. Neste trabalho n´ os exploramos esse paradoxo e mostramos que de fato os n´ıveis de ROS s˜ ao diminuidos du- rante o processo de FBN devido ao aumento na express˜ ao de seis enzimas detoxificadoras de ROS. Um agrupamento baseando-se nos padr˜ oes de express˜ ao de cada um destes genes revelou a existˆ encia de um grupo formado pelos genes das enzimas super´ oxido dismutase, catalase do tipo E e subunidade MoFe da nitrogenase que apresenta 99,8% de similari- dade de responta nos padr˜ oes de express˜ ao frente as diferentes condi¸c˜ oes apresentadas.

Finalmente, a atividade da nitrogenase foi inibida de maneira dose-dependente por Para- quat, que aumenta os n´ıveis de ROS intracelulares. Os resultados apresentados mostram que ROS inibe fortemente a atividade de nitrogenase e que a G. diazotrophicus muda o seu metabolismo redox durante a FBN aumentando a express˜ ao e atividade de enzimas detoxificadoras de oxigˆ enio que levam a uma menor quantidade de ROS gerada. N´ os su- gerimos que um forte controle da produ¸c˜ ao de ROS nesta fase cr´ıtica ´ e um mecanismo adaptativo que permite a ocorrˆ encia do processo de FBN.

O terceiro tema aborda a presen¸ca e atividade de uma via alternativa para a produ-

¸c˜ ao de asparagina-tRNA (Asn-tRNA) e glutamina-tRNA (Gln-tRNA) em G. diazotrophi-

cus. Essa via alternativa envolve a transamida¸c˜ ao de um tRNA acilado errˆ oneamente pela

enzima codificada pelos genes gatCAB. A ausˆ encia de genes codificando para a asparagina

sintetase e a falta de atividade desta enzima no extrato celular tamb´ em indicam que o

gatCAB pode ser respons´ avel pela s´ıntese deste amino´ acido na c´ elula. A influˆ encia da

asparagina na express˜ ao da nitrogenase tamb´ em foi observada. Mutantes aleat´ orios com

altera¸c˜ oes no metabolismo de asparagina foram analisados e apresentaram taxas alteradas

de FBN. N´ os sugerimos que a existˆ encia de uma via alternativa para a bios´ıntese de aspa-

ragina pode ser um mecanismo adotado por alguns organismos para manter a regula¸c˜ ao

da FBN sob um controle maior.

(10)

Gluconacetobacter diazotrophicus, is a nitrogen (N

2

) fixating endophyte bacterium isolated from sugarcane, that is a strictly aerobic. The genome sequencing of this bacterium was completed in 2008, together with the first studies of proteomics. The work reported here was centered on the functional genomic of this bacteria. This study focuses on 3 different topics: the first concerns the identification of the transporters in the G. diazotrophicus genome; the second topic focuses on the influence of reactive oxygen species (ROS) in the biological nitrogen fixation (BNF) process; and the third topic focuses on the identification and analyses of an alternative route for aminoacylation and asparagine formation.

In the first topic we report that 45% of the transporters are primary active trans- porters, 30% are electrochemical potential-driven transporters (or secondary active trans- porters) and 12% are channel-type facilitators. Among these transporters are the 23 gene transporters of the TonB type involved in extracellular iron binding, the presence of 40 genes of the RND family and a large quantity of genes that can release heavy metals and other toxic composites thus providing the bacterium with resistance to inhospitable environments. Also noted were type IV secretion system transporters that enable the bacterium to transport macromolecules through its outer membrane to the plant. This probably has a relevant role in cell recognition during plant-bacterium interaction.

The second topic focuses on the influence of ROS in the BNF process. This process

is catalyzed by a nitrogenase and requires copious amounts of ATP. Nitrogenase activity is

extremely sensitive to inhibition by oxygen and reactive oxygen species (ROS). However,

the high oxidative metabolic rates required to sustain biological nitrogen fixation (BNF)

(11)

that ROS levels are, in fact, decreased in nitrogen-fixing cells due to the up regulation of transcript levels of six ROS detoxifying genes. A cluster analysis based on common expression patterns revealed the existence of a stable cluster with 99.8% similarity made up of the genes encoding the α -subunit of nitrogenase MoFe-protein, and the superoxide dismutase and catalase type E enzymes. Finally, nitrogenase activity was inhibited in a dose-dependent manner by paraquat, a redox cycler that increases cellular ROS levels.

Our data revealed that ROS can strongly inhibit nitrogenase activity, and G. diazotrophi- cus alters its redox metabolism during BNF by increasing antioxidant transcript levels resulting in a lower ROS generation. We suggest that the carefully controlled ROS pro- duction during this critical phase is an adaptive mechanism to allow nitrogen fixation.

We also confirmed the presence of an alternative route for asparaginyl-tRNA (Asn-

tRNA) and glutaminyl-tRNA (Gln-tRNA) formation. The alternative route involves tran-

samidation of incorrectly charged tRNA via gatCAB. The absence from the G. diazo-

trophicus genome of genes encoding tRNA-independent asparagine synthetase and the

lack of this enzyme in G. diazotrophicus extracts suggest that the gatCAB genes may be

responsible for biosynthesis of asparagine in this organism. The influence of asparagine in

the expression of nitrogenase gene was observed. Mutants with alterations in asparagine

metabolism also presented different rates of biological nitrogen fixation compared to the

wild type. We suggest that the presence of an alternative route to produce asparagine

may give the cell a tighter control over BNF.

(12)

Resumo vi

Abstract viii

Sum´ ario x

Lista de Figuras xiv

´ Indice de Figuras xx

Lista de Tabelas xxi

´ Indice de Tabelas xxii

Tabela de abrevia¸ c˜ oes e f´ ormulas qu´ımicas xxiii

1 Introduc˜ ao 1

1.1 A Fixa¸c˜ ao de Nitrogˆ enio: Origem e hist´ orico. . . . . 3

1.2 A Fixa¸c˜ ao Biol´ ogica de Nitrogˆ enio. . . . 7

1.2.1 O complexo enzim´ atico da nitrogenase . . . . 9

1.3 Gluconacetobacter diazotrophicus . . . . 11

1.3.1 Importˆ ancia biotecnol´ ogica . . . . 11

1.3.2 Isolamento e habitat natural . . . . 14

1.3.3 Taxonomia . . . . 15

1.3.4 Caracter´ısticas fisiol´ ogicas . . . . 16

2 Identifica¸ c˜ ao e an´ alise dos transportadores 19 2.1 Introdu¸c˜ ao . . . . 19

2.1.1 O sequenciamento de genomas . . . . 19

2.1.2 Anota¸c˜ ao de genomas . . . . 23

2.1.3 Ferramentas de bioinform´ atica . . . . 24

2.1.4 Transportadores e sistemas de transporte . . . . 25

(13)

2.2 Objetivos . . . . 30

2.3 Resultados e discuss˜ ao . . . . 31

2.3.1 Vis˜ ao geral dos transportadores. . . . 42

2.3.2 Transportadores prim´ arios . . . . 44

2.3.3 Transportadores secund´ arios . . . . 45

2.3.4 Poros e canais . . . . 47

2.4 Conclus˜ oes . . . . 48

3 As esp´ ecies reativas de oxigˆ enio durante a FBN 50 3.1 Introdu¸c˜ ao . . . . 50

3.1.1 O paradoxo da FBN em organismos aer´ obicos . . . . 50

3.1.2 A tolerˆ ancia de G. diazotrophicus a O

2

. . . . 51

3.1.3 Prote¸c˜ ao respirat´ oria . . . . 52

3.1.4 Liga¸c˜ ao entre sistema respirat´ orio e ROS . . . . 54

3.1.5 Enzimas detoxificadoras de ROS . . . . 55

3.1.6 A influˆ encia de ROS na FBN . . . . 56

3.1.7 Modula¸c˜ ao de ROS durante a simbiose . . . . 57

3.1.8 Perspectivas . . . . 58

3.2 Objetivos . . . . 60

3.3 Resultados e Discuss˜ ao . . . . 61

3.3.1 Visualiza¸c˜ ao . . . . 61

3.3.2 Atividade Catal´ asica . . . . 63

3.3.3 Identifica¸c˜ ao dos genes respons´ aveis pela detoxificaxa¸c˜ ao de ROS no genoma de G. diazotrophicus . . . . 63

3.3.4 PCR em tempo real . . . . 67

3.3.5 Agrupamento . . . . 68

3.3.6 Fixa¸c˜ ao de nitrogˆ enio na presenca de paraquat . . . . 70

3.4 Conclus˜ oes . . . . 72

4 A via alternativa de aminoacila¸ c˜ ao de tRNA e o metabolismo de aspa- ragina 74 4.1 Introdu¸c˜ ao . . . . 74

4.1.1 A s´ıntese proteica . . . . 74

4.1.2 A via alternativa de aminoacila¸c˜ ao de tRNA. . . . 77

4.1.3 A utiliza¸c˜ ao da via alternativa para a produ¸c˜ ao de asparagina . . . 81

4.1.4 Influˆ encia de asparagina e glutamina na FBN . . . . 82

4.2 Objetivos . . . . 84

4.3 Resultados e discuss˜ ao . . . . 86

(14)

4.3.1 Localizac˜ ao e an´ alise dos genes da via de aminoacila¸c˜ ao de tRNA . 86 4.3.2 An´ alise da express˜ ao dos genes da via alternativa de s´ıntese prot´ eica 90 4.3.3 Influˆ encia de diferentes fontes de nitrogˆ enio na express˜ ao do gene

da nitrogenase em fun¸c˜ ao do tempo de crescimento . . . . 92

4.3.4 Utiliza¸c˜ ao da via alternativa de acila¸c˜ ao do tRNA para a forma¸c˜ ao de asparagina . . . . 97

4.3.5 Identifica¸c˜ ao da via alternativa em fixadores de nitrogˆ enio . . . 103

4.3.6 Screening dos mutantes auxotr´ oficos para asparagina . . . 104

4.3.7 Identifica¸c˜ ao e an´ alise dos mutantes . . . 105

4.4 Conclus˜ oes . . . 114

5 Materiais e M´ etodos 116 5.1 T´ ecnicas de bioinform´ atica . . . 116

5.1.1 Identifica¸c˜ ao de ORFs relacionadas ao sistema de transportadores no genoma da G. diazotrophicus PAL5 . . . 116

5.1.2 An´ alise dos clusters . . . 119

5.2 T´ ecnicas de biologia molecular . . . 119

5.2.1 Extra¸c˜ ao de DNA genˆ omico . . . 119

5.2.2 Eletroforese de DNA . . . 120

5.2.3 Extra¸c˜ ao do RNA total . . . 120

5.2.4 Eletroforese de RNA . . . 121

5.2.5 S´ıntese do cDNA . . . 121

5.2.6 Amplifica¸c˜ ao do cDNA por rea¸c˜ ao em cadeia da polimerase (PCR) 122 5.2.7 PCR em tempo real ou PCR quantitativo (qPCR) . . . 122

5.2.8 C´ alculo da quantifica¸c˜ ao relativa . . . 124

5.2.9 Obten¸c˜ ao dos mutantes aleat´ orios . . . 126

5.2.10 Caracteriza¸c˜ ao molecular dos mutantes aleat´ orios (PCR invertido) . 127 5.2.11 Purifica¸c˜ ao de DNA para rea¸c˜ ao de sequenciamento . . . 127

5.2.12 sequenciamento das regi˜ oes flanqueadores do transposon EZ-Tn5 ™ <KAN- 2>Tnp transposome ™ . . . 127

5.3 T´ ecnicas de microbiologia e bioqu´ımica . . . 128

5.3.1 Estirpes, meios e condi¸c˜ oes de cultivo . . . 128

5.3.2 Determina¸c˜ ao da produ¸c˜ ao de ROS em G. diazotrophicus . . . 129

5.3.3 Atividade de catalase . . . 130

5.3.4 Prepara¸c˜ ao de extrato celular livre de tRNA . . . 130

5.3.5 Atividade de asparagina sintetase . . . 130

5.3.6 Atividade de nitrogenase . . . 131

5.3.7 Determina¸c˜ ao de prote´ınas totais . . . 131

(15)

5.3.8 Dosagem de amino´ acidos livres por HPLC . . . 132 5.3.9 Varredura dos mutantes auxotr´ oficos para asparagina . . . 134

6 Vis˜ ao geral e perspectivas 135

Referˆ encias Bibliogr´ aficas 137

Apˆ endice 157

(16)

1.1 Estrutura do complexo da nitrogenase de Azotobacter vinelandii. As su- bunidades Fe-prote´ına est˜ ao coloridas em azul claro, marron e cinza. As subunidades da MoFe-prote´ına est˜ ao coloridas em verde, amarelo, azul es- curo e vermelho (Adaptado de Dixon [2004] por Guedes [2010]Oi). . . . 11 2.1 N´ umero genomas completos sequenciados at´ e setembro de 2009 (modificada

de http://www.genomesonline.org/gold statistics.htm - acesso em mar¸co de 2010) . . . . 20 2.2 N´ umero de projetos de sequenciamento de genoma depositados no GOLD ™

(modificada de http://www.genomesonline.org/gold statistics.htm - acesso em mar¸co de 2010) . . . . 21 2.3 Principal relevˆ ancia de projetos de genoma bacterianos realizados no mundo

(modificada de http://www.genomesonline.org/gold statistics.htm - acesso em mar¸co de 2010) . . . . 22 3.1 Express˜ ao relativa e atividade de redu¸c˜ ao do acetileno de c´ elulas de G.

diazotrophicus crescidas em meio LGI-P suplementado com 1 ou 20mM de

sulfato de amˆ onio. . . . . 61

(17)

3.2 Quantidade de ROS ´ e menor durante FBN. C´ elulas de G. diazotrophicus crescidas em condi¸c˜ oes de fixa¸c˜ ao (FIX) e n˜ ao-fixa¸c˜ ao de nitrogˆ enio (NFIX) foram incubadas com o probe CM-H2DCFDA, sens´ıvel a ROS. As Figuras A, C, E e G representam o campo claro das imagens. As Figuras B, D, F e H s˜ ao microscopias de fluorescˆ encia, e os pontos claros indicativos da presenca de ROS. Todas as imagens foram obtidas com o mesmo tempo de exposi¸c˜ ao para permitir a compara¸c˜ ao entre a intensidade dos sinais. Barra de escala: 10 μm. . . . 62 3.3 Atividade catal´ asica do extrato bruto de c´ elulas de G. diazotrophicus cresci-

das em condi¸c˜ oes de fixa¸c˜ ao (FIX) e n˜ ao-fixa¸c˜ ao de nitrogˆ enio. A atividade catal´ asica dos extratos brutos celulares foi medida monitorando-se consumo de per´ oxido de hidrogˆ enio a 240nm por 1 minuto ` a temperatura ambiente.

M´ edia +/- barra de erros de nove experimentos independentes s˜ ao mostrados. 63 3.4 Express˜ ao de enzimas de G. diazotrophicus envolvidas na detoxifi¸c˜ ao de

ROS durante o processo de FBN. Express˜ ao do mRNA correspondentes aos genes respons´ aveis pela detoxifica¸c˜ ao de ROS em c´ elulas fixando e n˜ ao- fixando nitrogˆ enio crescidas durante 72h. O n´ıvel dos transcritos ´ e represen- tado como a taxa (express˜ ao relativa) do valor absoluto do gene estudado pelo valor absoluto do gene na condi¸c˜ ao em que as c´ elulas n˜ ao fixam ni- trogˆ enio (NFIX). Os valores foram normalizados em rela¸c˜ ao a express˜ ao do gene constitutivo 23S. M´ edia +/- barra de erros de trˆ es experimentos independentes s˜ ao mostrados. . . . 67 3.5 Constru¸c˜ ao de clusters de express˜ ao dos genes de detoxifi¸c˜ ao de ROS revela

a presen¸ca de dois clusters principais: um formado pela gorB sozinha e

outro formado por gorA, kat, katC, nifD, sodA e katE. Esse cluster pode

ser dividido em trˆ es clusters menores: kat + gorA, katC e katE + sodA +

nifD. . . . 69

(18)

3.6 Efeitos de ROS no crescimento e na redu¸c˜ ao de acetileno ARA de c´ elulas de G. diazotrophicus. A) Efeito de diferentes concentra¸c˜ oes de paraquat (PQ) no crescimento de c´ elulas fixando (em preto) e n˜ ao-fixando (em cinza) nitrogˆ enio Depois de um per´ıodo inicial de 24h, foi adicionado PQ para uma concetra¸c˜ ao final de 0,5 e 5 mM (linhas tracejadas e pontilhadas, respectivamente) (B) ARA de c´ elulas depois de 72h de cultivo. A atividade foi medida depois de 48h na presen¸ca de 0,5 e 5mM de PQ. . . . 70 4.1 Dogma central da Biologia molecular proposto por Francis Crick em 1958 . 74 4.2 Mecanismo geral de atua¸c˜ ao das aminoacil-tRNA sintetases. Primeira-

mente a enzima se liga ao amin´ acido e o liga ` a uma mol´ ecula de AMP, proveniente da clivagem de um ATP. Em seguida a enzima liga essa poro aminoacil ao seu tRNA correspondente e libera a mol´ ecula de AMP. . . . . 75 4.3 Mecanismo geral de s´ıntese proteica. . . . . 76 4.4 Esquema e cartoon da via para a forma¸c˜ ao de Asn− tRN A

Asn

(similar para

Gln − tRN A

Gln

). Uma AspRS n˜ ao-discriminativa forma Asp − tRN A

Asn

.

O aminoacil-tRNA formado ´ e ent˜ ao corrigido por uma amidotransferase

(gatCAB) na presen¸ca de ATP e de um doador do grupamento amida. . . 79

(19)

4.5 Alinhamento da por¸c˜ ao N-terminal de algumas aspartyl-tRNA sintetases bacterianas n˜ ao discriminativas. A por¸c˜ ao azul, indica a posi¸c˜ ao corres- pondente ` a Prolina 77 de arquaeas. Em bact´ erias, essa ´ e uma posi¸c˜ ao conservada, onde encontra-se sempre uma arginina, independente de ser uma aa-tRNS sintetase discriminativa ou n˜ ao. A posi¸c˜ ao vermelha, corres- pondente ` a asparagina (N) de E. coli, em enzimas n˜ ao discriminativas en- contramos sempre Treonina (T), Leucina (L) ou Alanina (A). J´ a na por¸c˜ ao marcada de amarelo (M87 de E. coli) a presen¸ca de uma leucina (L) di- minui fortemente a especificidade por tRN A

Asp

e aumenta para tRN A

Asn

. Foram usadas as seqˆ uencias dos seguintes organismos: Bordetella pertussis Tohama I, Escherichia coli str. K-12 substr. W3110, Helicobacter pylori 26695, Gluconacetobacter diazotrophicus PAl 5, Brucella melitensis bv. 1 str. 16M. . . . . 89 4.6 Localiza¸c˜ ao do gatCAB no genoma da G. diazotrophicus. . . . 90 4.7 Express˜ ao de enzimas da via alternativa de aminoacila¸c˜ ao de tRNA em

fun¸c˜ ao da disponibilidade de nitrogˆ enio - c´ elulas crescidas em meio LGI- P suplementado com 1 (FIX) ou 20 mM (NFIX) de sulfato de amˆ onio - ap´ os 72h de crescimento. A express˜ ao dos genes na condi¸c˜ ao de FIX de crescimento foi utilizada como calibradora e, portanto, fixada em 1. O n´ıvel dos transcritos ´ e representado como a taxa (express˜ ao relativa) do valor absoluto do gene estudado (Ct) pelo valor absoluto do gene na con- di¸c˜ ao calibradora. Os valores foram normalizados em rela¸c˜ ao ` a express˜ ao do gene constitutivo 23S. M´ edia +/- barra de erros de trˆ es experimentos independentes s˜ ao mostrados. . . . 91 4.8 Crescimento de G. diazotrophicus em meio LGI-P l´ıquido suplementado

com 1 ou 20mM de sulfato de amˆ onio ou suplementado com 20mM de as-

paragina, aspartato, glutamina ou glutamato. As c´ elulas foram cultivadas

a 30 ° C, 150 rpm. . . . 93

(20)

4.9 Express˜ ao do gene nifD em fun¸c˜ ao da disponibilidade de N no meio de cultura. As c´ elulas foram crescidas em meio LGI-P suplementado com 1 (FIX) ou 20 mM (NFIX) de sulfato de amˆ onio - e a express˜ ao relativa do gene nifD foi verificada. A express˜ ao do gene na condi¸c˜ ao FIX com 24h de cultivo foi utilizada como calibradora e, portanto, fixada em 1. O n´ıvel dos transcritos ´ e representado como a taxa (express˜ ao relativa) do valor absoluto do gene estudado (Ct) pelo valor absoluto do gene na con- di¸c˜ ao calibradora. Os valores foram normalizados em rela¸c˜ ao ` a express˜ ao do gene constitutivo 23S. M´ edia +/- barra de erros de trˆ es experimentos independentes s˜ ao mostrados. . . . 96 4.10 Rela¸c˜ ao entre os n´ıveis intracelulares de asparagina, glutamina e aspartato

(apresentados na Tabela 4.3) e a express˜ ao do nifD (apresentados na Fi- gura 4.9). Podemos observar no primeiro gr´ afico que enquanto os n´ıveis de asparagina est˜ ao at´ e em torno de 40 uM, ainda pode-se observar a ex- press˜ ao do gene nifD. A partir desta concentra¸c˜ ao a express˜ ao do gene nifD encontra-se sempre reprimida. A an´ alise com glutamina e aspartato n˜ ao mostra nenhuma rela¸c˜ ao entre as concentra¸c˜ oes intracelulares destes amino´ acidos e a express˜ ao do gene nifD. . . . 97 4.11 Atividade de asparagina sintetase dependente de tRNA. Quantidade de

[

14

C]asparagina formada pela convers˜ ao de [

14

C]aspartato por c´ elulas de G. diazotrophicis e E. coli (controle positivo) livres de tRNA. M´ edia +/- barra de erros de trˆ es experimentos independentes s˜ ao mostrados. . . 102 4.12 Exemplo de placas utilizadas para a sele¸c˜ ao dos mutantes auxotr´ oficos para

asparagina. Os mutantes que n˜ ao cresceram na placa “A” (meio LGI-P su-

plementado com sulfato de amˆ onio), mas cresceram na placa “B” (meio

LGI-P suplementado com asparagina) foram selecionadas para experimen-

tos subseq¨ uentes. . . 105

(21)

4.13 Representa¸c˜ ao gr´ afica da via metab´ olica do ciclo do ´ acido tricarboxilico, onde est´ a destacado (em vermelho) a enzima PEPCase. Fonte: Kegg - Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. . . 107 4.14 Atividade de nitrogenase (em nmoles de etileno . mg

−1

. h

−1

) da estirpe

selvagem PAL5 e mutante fosfoenolpiruvato carboxilase (MUT4) em meio LGIP semi-s´ olido suplementado com diferentes 1 mM de sulfato de amˆ onio ou diferentes concentra¸c˜ oes de asparagina (1, 5 ou 20 mM). M´ edia +/- barra de erros de dois experimentos independentes s˜ ao mostrados. . . 108 4.15 Representa¸c˜ ao gr´ afica via do metabolismo de glutamato, onde destaca-

se (em vermelho) a enzima Amidofosforibosil transferase. Fonte: Kegg - Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. . . 109 4.16 Atividade de nitrogenase (em nmoles de etileno . mg

−1

. h

−1

) da estirpe

selvagem PAL5 e mutante Amidofosforibosil transferase (MUT14) em meio LGIP semi-s´ olido suplementado com diferentes 1 mM de sulfato de amˆ onio ou diferentes concentra¸c˜ oes de asparagina (1, 5 ou 20 mM). M´ edia +/- barra de erros de dois experimentos independentes s˜ ao mostrados. . . 110 4.17 Atividade de nitrogenase (em nmoles de etileno . mg

−1

. h

−1

) da estirpe sel-

vagem PAL5 e mutante Permease do sistema de transporte de D-metionina metI (MUT98) em meio LGIP semi-s´ olido suplementado com diferentes 1 mM de sulfato de amˆ onio ou diferentes concentra¸c˜ oes de asparagina (1, 5 ou 20 mM). M´ edia +/- barra de erros de dois experimentos independentes s˜ ao mostrados. . . . 111 4.18 Representa¸c˜ ao gr´ afica da via de metabolismo de nitrogˆ enio, onde destaca-se

(em vermelho) a enzima Glutamato sintase. Fonte: Kegg - Kyoto Encyclo-

pedia of Genes and Genomes. . . 112

(22)

4.19 Atividade de nitrogenase (em nmoles de etileno . mg

−1

. h

−1

) da estirpe selvagem PAL5 e mutante Glutamato sintase (MUT35) em meio LGIP semi-s´ olido suplementado com diferentes 1 mM de sulfato de amˆ onio ou diferentes concentra¸c˜ oes de asparagina (1, 5 ou 20 mM). M´ edia +/- barra de erros de dois experimentos independentes s˜ ao mostrados. . . . 113 6.1 Esquema mostrando como a obten¸c˜ ao de determinados genes conferiu van-

tagens ` a G. diazotrophicus e a permitiu colonizar um novo nicho ecol´ ogico. 136

(23)

1.1 Exemplos de gˆ eneros de organismos diazotr´ oficos . . . . 8 2.1 Descri¸c˜ ao das ORFs identificadas com pertencentes ou relacionadas com o

sistema de transportes no genoma da G. diazotrophicus . . . . 32 2.2 Compara¸c˜ ao entre o sistema de transportes no genoma da G. diazotrophicus

com outros genomas publicados . . . . 43 2.3 Principais classes de transportadores anotados no genoma de G. diazotroph-

icus . . . . 44 3.1 Identifica¸c˜ ao dos genes respons´ aveis por detoxifica¸c˜ ao de ROS em G. dia-

zotrophicus . . . . 64 3.2 Tipos de catalase . . . . 66 4.1 Influˆ encia de diferentes fontes de nitrogˆ enio na atividade da nitrogenase,

utilizando-se o m´ etodo de redu¸c˜ ao do acetileno, em G. diazotrophicus cres- cida em meio LGI-P a 30 ° C ap´ os 72h de crescimento. . . . 83 4.2 Influˆ encia de diferentes fontes de nitrogˆ enio na express˜ ao do gene da nitro-

genase em fun¸c˜ ao do tempo de crescimento . . . . 94 4.3 Concentra¸c˜ ao em μ M medida por HPLC de amino´ acidos livres intracelula-

res de c´ elulas de G. diazotrophicus crescidas em meio LGI-P suplementado

com 1 (FIX) ou 20 mM (NFIX) de N H

4

SO

4

em fun¸c˜ ao do tempo de cultivo. 95

(24)

4.4 Identifica¸c˜ ao da enzima gatCAB, da via alternativa de acila¸c˜ ao de tRNA, em todos os organismos que n˜ ao possuem os genes que codificam para as enzimas asparagina sintetase A ou B (asnA e asnB ). . . . . 99 4.5 Identifica¸c˜ ao da via de s´ıntese de asparagina e da via alternativa de acila¸c˜ ao

de tRNA em organismos com capacidade de fixar nitrogˆ enio. . . 104 4.6 Seq¨ uˆ encias obtidas dos produtos de iPCR dos mutantes aleat´ orios. . . . 106 5.1 Primers qPCR . . . 124 5.2 Eficiˆ encia dos oligonucleot´ıdeos. Nome do gene, temperatura de desnatu-

ra¸c˜ ao (TM), o R

2

da curva de eficiˆ encia e a eficiˆ encia de amplifica¸c˜ ao de cada um dos oligonucleot´ıdeos utilizados nesse trabalho. A eficiˆ encia foi calculada utilizando a f´ ormula E = 10

(−1/slope)

e %E = (E − 1) ∗ 100 . . . . 126 5.3 Quantidades de ´ agar acrescidos aos meios l´ıquidos a fim de se obter meios

semi-s´ olidos ou s´ olidos. . . 129

(25)

qu´ımicas

23S DNA que codifica para o gene 23S aaRS aminoacil-tRNA sintetase

ABC “ATP-binding Cassette Transporter”

ADP Adenosina Difosfato

AdT Amidotransferase tRNA espec´ıfica AMP Adenosina monofosfato

ARA Ativididade de redu¸c˜ ao de acetileno

Asn Asparagina

Asp Aspartato

ATP Adenosina Trifosfato

BASF Badissche Anilin- und Soda-Fabrik BLAST “Basic Local Alignment Sequence Tool”

cDNA DNA complementar

COG ”Clusters of Orthologous Groups”

Ct “Threshold cycle”

D-AspRS Aspartil-tRNA sintetase espec´ıfica DNA Acido Desoxirribonucleico ´

DTT Ditiotreitol

EC “Enzyme Comission”

(26)

EDTA Acido etilenodiamino tetra-ac´ ´ etico

EMBL “European Molecular Biology Laboratories”

EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecu´ aria

FAPERJ Funda¸c˜ ao de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro FBN Fixa¸c˜ ao Biol´ ogica de Nitrogˆ enio

Fe-prote´ına Ferro-prote´ına da nitrogenase

FIX c´ elulas crescidas com 1 mM de sulfato de amˆ onio

g Gramas

g/L Grama por Litro

GDB “Human Genome Database”

GDI Gluconacetobacter diazotrophicus

GLIMMER “Gene Locator and Interpolated Markov ModelER”

Gln Glutamina

Glu Glutamato

Glu/Asp- AdT

Glutamina/asparagina amidotransferase tRNA espec´ıfica

GOGAT Glutamato sintase

GOLD

T M

Genomes OnLine Database

GR Glutationa redutase

GSDB “Genome Sequence Data Base”

GTP Guanosine-5’-triphosphate

h Hora

HPLC Cromatografia l´ıquida de alto desempenho IAA Acido indol ac´ ´ etico

iPCR PCR invertido

Kat Catalase

KCl Cloreto de pot´ assio

(27)

KEGG ”Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes”

kPa Kilopascal

LNCC Laborat´ orio Nacional de Computa¸c˜ ao Cient´ıfica Mb Milh˜ oes de pares de bases

MFS “Major Facilitator Superfamily”

mL Mililitro

mM Milimolar

MoFe- prote´ına

Prote´ına Ferro-Molibdˆ enio da nitrogenase

N aOH Hidr´ oxido de s´ odio

NCBI ”National Center for Biotechnology Information”

ND-AspRS Aspartil-tRNA sintetase n˜ ao discriminativa

NFIX c´ elulas crescidas com 20 mM de sulfato de amˆ onio N H

3

Amˆ onia

N H

4

Amˆ onio

(N H

4

)

2

SO

4

Sulfato de amˆ onio

nmoles nanomoles

C Celsius

ORF Fase de leitura aberta

PCR Rea¸c˜ ao em cadeia da polimerase PDB “Protein Data Bank”

PEPCase Fosfoenol piruvato carboxilase pH Potencial Hidrogeniˆ onico

pHi Potencial Hidrogeniˆ onico interno pHo Potencial Hidrogeniˆ onico externo PHYLIP “Phylogeny Inference Package”

PIR “Protein Information Resourse”

PMSF Fenilmetilsulfonil fluorido

(28)

PQ Paraquat

qPCR PCR quantitativo RNA Acido ribonucleico ´

RND “Resistance Nodulation Division”

ROS Esp´ ecies reativas de oxigˆ enio rRNA RNA ribossˆ omico

SOD Super´ oxido dismutase

TAE Tris Acetato EDTA

TCA Acido tricloroac´ ´ etico

TCDB “Transport Classification Database”

TIGR The Institute for Genomic Research

TM Marca registrada

tRNA RNA transportador ou ARN de transferˆ encia UENF Universidade Estadual do Norte Fluminense UERJ Universidade Estadual do Rio de Janeiro UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro

w/v massa por volume

WGS ”Whole-Genome Shotgun Sequencing”

μ g Micrograma

μ M Micromolar

(29)

Introduc˜ ao

O desenvolvimento do equipamento e das t´ ecnicas que permitem o sequenciamento auto- matizado de fragmentos de DNA e de genomas completos est´ a na base do aparecimento da nova ´ area cient´ıfica da Genˆ omica. De fato, desde 1995, data em que foi disponibi- lizada a primeira sequˆ encia completa do genoma de um ser vivo (da esp´ ecie bacteriana Haemophilus influenza ), as abordagens genˆ omicas e p´ os-genˆ omicas vieram revolucionar a forma de investigar e de desenvolver qualquer atividade nas v´ arias vertentes da Bio- logia. De acordo com o banco de dados GOLD ™ - Genomes OnLine Database v. 3.0 (www.genomesonline.org) - existem hoje, mar¸co de 2010, cerca de 1100 genomas comple- tos publicados, incluindo o genoma humano, e acredita-se que at´ e o final de 2010, cerca de 5000 sequˆ encias estar˜ ao dispon´ıveis.

Esta quantidade de informa¸c˜ ao genˆ omica abriu as portas para o surgimento da pro- teˆ omica, que ´ e o estudo do conjunto das prote´ınas expressas em uma c´ elula. Veio tamb´ em incentivar a nova ´ area inter- e trans-disciplinar da Bioinform´ atica, que envolve a Biologia, a Estat´ıstica e a Inform´ atica. As informa¸c˜ oes geradas por essas abordagens permitiram a constru¸c˜ ao de numerosas bases de dados, com informa¸c˜ ao em escala genˆ omica e ferra- mentas computacionais associadas.

O grande desafio dos pesquisadores que atualmente trabalham nestas ´ areas de conhe-

cimento ´ e conseguir relacionar a grande quantidade de informa¸c˜ ao gerada pelas an´ alises

(30)

genˆ omicas e proteˆ omicas com os aspectos fisiol´ ogicos do organismo estudado, entender finalmente como os genes afetam o a fisiologia das c´ elulas e s˜ ao por ela afetados. A seu favor, aqueles que se aventuram por essa ´ area contam com essa enorme quantidade de in- forma¸c˜ ao gerada por an´ alises “high-throughput”. Por outro lado, essa grande quantidade de informa¸c˜ ao gera uma grande quantidade de perguntas e cabe ao pesquisador selecionar aquelas mais relevantes para a compreens˜ ao da fisiologia do organismo estudado.

Dentro deste cen´ ario esse trabalho foi dedicado ao estudo da genˆ omica funcional da bact´ eria Gluconacetobacter diazotrophicus. Seu sequenciamento foi finalizado em 2008 junto com os primeiros estudos de proteˆ omica. Devido ` a complexidade de seu genoma e de suas intera¸c˜ oes com a cana-de-a¸c´ ucar, seu principal hospedeiro, essa an´ alise funcional requer o conhecimento da fisiologia integrativa. No presente trabalho utilizamos diversas t´ ecnicas que v˜ ao desde a an´ alise da express˜ ao gˆ enica utilizando a t´ ecnica de PCR em tempo real (qPCR, de quantitative polimerase chain reaction), at´ e a quantifica¸c˜ ao de intermedi´ arios metab´ olicos por cromatografia, passando por t´ ecnicas de microscopia de fluorescˆ encia e enzimologia. Estes estudos foram focados principalmente em aspectos da fixa¸c˜ ao biol´ ogica de nitrogˆ enio e s´ıntese de prote´ınas e na habilidade da bact´ eria em fixar nitrogˆ enio na presen¸ca de oxigˆ enio. Apesar de voltados para uma poss´ıvel aplica¸c˜ ao biotecnol´ ogica, s˜ ao estudos que abrem novas perspectivas de compreens˜ ao de mecanismos fisiol´ ogicos do organismo estudado e que podem vir a ser utilizados por outros modelos de estudo.

Devido a variedade de temas abordados esta tese foi separada em seis cap´ıtulos:

• O primeiro cap´ıtulo (1) consiste numa introdu¸c˜ ao geral sobre a fixa¸c˜ ao de nitro- gˆ enio e sobre o modelo de estudo utilizado.

• O segundo cap´ıtulo (2) aborda o processo de identifica¸c˜ ao e an´ alise dos transpor- tadores de G. diazotrophicus.

• No terceiro cap´ıtulo (3) se encontra um estudo sobre a influˆ encia de esp´ ecies

(31)

reativas de oxigˆ enio (ROS) no processo de FBN e do estado redox da c´ elula durante este processo.

• O quarto cap´ıtulo (4) trata da existˆ encia de uma prov´ avel via alternativa de ami- noacila¸c˜ ao de tRNA em G. diazotrophicus, sua influˆ encia na forma¸c˜ ao de aspargina e suas implica¸c˜ oes no processo de FBN.

• O quinto cap´ıtulo (5) apresenta os materiais e m´ etodos utilizados para a realiza¸c˜ ao dos estudos tratados nos cap´ıtulos anteriores.

• O sexto cap´ıtulo (6) apresenta uma conclus˜ ao geral da tese e perspectivas deste trabalho e ´ e seguido pelas Referˆ encias bibliogr´ aficas e pelo Apˆ endice, que con- tˆ em os manuscritos dos trabalhos desenvolvidos durante esta tese.

1.1 A Fixa¸ c˜ ao de Nitrogˆ enio: Origem e hist´ orico.

Formas complexas e variadas de vida existem na Terra h´ a pelo menos 3,5 bilh˜ oes de anos,

e, independente de suas diferen¸cas entre si, todas s˜ ao fundamentadas na existˆ encia de ma-

cromol´ eculas biol´ ogicas. Estas macromol´ eculas podem ser divididas em quatro grandes

grupos: ´ acidos nucl´ eicos, prote´ınas, carboidratos e lip´ıdios. O nitrogˆ enio ´ e o elemento b´ a-

sico de dois destes grupos de macromol´ eculas: os ´ acidos nucl´ eicos e as prote´ınas. Embora

amplamente presente na sua forma orgˆ anica, a maior parte do nitrogˆ enio da Terra est´ a

na sua forma gasosa (N

2

). A produ¸c˜ ao da forma b´ asica de nitrogˆ enio orgˆ anico, a amˆ onia

(N H

3

) requer necessariamente a quebra do nitrogˆ enio atmosf´ erico e sua liga¸c˜ ao com ´ ato-

mos de hidrogˆ enio (H). O processo de transforma¸c˜ ao do nitrogˆ enio atmosf´ erico na sua

forma orgˆ anica (N H

3

) ´ e chamado ent˜ ao de fixa¸c˜ ao de nitrogˆ enio. Esta rea¸c˜ ao, embora

seja termodinamicamente favor´ avel, n˜ ao ocorre espontaneamente visto que os dois ´ ato-

mos de nitrogˆ enio da mol´ ecula de N

2

encontram-se unidos atrav´ es de uma tripla liga¸c˜ ao

muito est´ avel e necessitam, para o rompimento destas, uma energia de ativa¸c˜ ao muito

(32)

alta. Considerando-se a importˆ ancia da forma orgˆ anica do nitrogˆ enio para a forma¸c˜ ao de macromol´ eculas essenciais para a vida, o estudo do processo de fixa¸c˜ ao de nitrogˆ enio recebeu grande aten¸c˜ ao desde o final do s´ eculo XVIII. Foi nesta ´ epoca que descobriu-se que a amˆ onia era composta de um ´ atomo de nitrogˆ enio e trˆ es de hidrogˆ enio. A partir de tal descoberta, qu´ımicos do mundo todo tentavam sintetizar amˆ onia a partir destes gases, abundantes na natureza, sem sucesso. Foi o qu´ımico Fritz Haber que em 1909 chegou ` a solu¸c˜ ao deste problema de longa data na qu´ımica. Quando ele e seu assistente Robert Le Rossignol o conseguiram em dif´ıceis condi¸c˜ oes de laborat´ orio, o processo pro- duzia apenas uma pequena quantidade de amˆ onia em longos espa¸cos de tempo, excluindo qualquer esperan¸ca de produ¸c˜ ao industrial. Era preciso descobrir um catalisador para acelerar a rea¸c˜ ao. Ap´ os experiˆ encias com incont´ aveis metais, descobriu que o p´ o do raro metal ´ osmio (do qual existiam apenas 110 quilos no mundo) produzia o efeito desejado.

Num dos grandes dias da qu´ımica, 2 de julho de 1909, Haber fez uma demonstra¸c˜ ao de sua produ¸c˜ ao de amˆ onia, a uma taxa de setenta gotas por minuto, na presen¸ca de dois diretores t´ ecnicos de uma grande empresa qu´ımica (Badissche Anilin- und Soda-Fabrik, BASF), Alywin Mittasch e Carl Bosch. A BASF pressionou ent˜ ao Bosch e Mittasch a melhorar o processo de Haber. Embora a empresa tivesse comprado todo o estoque de

´

osmio do mundo, a equipe estava decidida a encontrar um catalisador mais r´ apido e mais abundante. Ap´ os quatro mil experiˆ encias, produziram um catalizador ideal, composto de ferro, ´ oxidos de alum´ınio, c´ alcio e pot´ assio. A receita continua praticamente sem mudan¸ca at´ e hoje. O processo Haber-Bosch, como veio a ser conhecido, responde por 99% do ni- trogˆ enio orgˆ anico produzido no mundo, o equivalente a cerca de 130 milh˜ oes de toneladas de amˆ onia por ano; 4/5 disso v˜ ao para os fertilizantes. Como o nitrogˆ enio fixado quase sempre foi o maior limitante na agricultura, a descoberta do processo de fixa¸c˜ ao de nitro- gˆ enio representou um enorme avan¸co para a humanidade e permitiu que esta alcan¸casse a incr´ıvel marca 6,6 bilh˜ oes bilh˜ oes de habitantes em 2007, em vez dos 3,6 bilh˜ oes que seriam o m´ aximo previsto sem essa descoberta [Goran, 1947].

Apesar da grande eficiˆ encia deste processo, ele ainda necessita empregar altas tem-

(33)

peraturas (400 a 600 ° C), press˜ oes elevadas (100 a 200 atm) e utiliza catalisadores a base de ferro. Isso representa um gasto enorme de fontes energ´ eticas n˜ ao renov´ aveis que ge- ralmente ´ e calculado em seis barris de petr´ oleo por tonelada de N H

3

sintetizada. Con- siderando que a limita¸c˜ ao de nitrogˆ enio ´ e um dos principais problemas na produtividade agr´ıcola e que a utiliza¸c˜ ao de fertilizantes nitrogenados ´ e largamente utilizada, pode-se calcular que o gasto energ´ etico utilizado na produ¸c˜ ao destes fertilizantes chega ` a incr´ıvel marca de 5% da produ¸c˜ ao mundial de g´ as natural [Smil, 2000]. Al´ em disso, a larga utili- za¸c˜ ao de fertilizantes nitrogenados acabou com a necessidade da utiliza¸c˜ ao do tradicional meio de enriquecimento do solo por rotatividade das culturas e da utiliza¸c˜ ao de esterco animal para fertilizar o solo. O resultado disso ´ e uma cont´ınua perda de mat´ eria orgˆ anica do solo, levando-se em ´ ultima instˆ ancia a um desequil´ıbrio do solo e a perda da sua capa- cidade de reter ´ agua e manter popula¸c˜ oes de microrganismos. Atualmente, a maioria dos campos agr´ıcolas n˜ ao funciona como unidades recicladoras da mat´ eria orgˆ anica gerada.

Observa-se, ao contr´ ario, todo o rejeito animal e de plantas, que s˜ ao ricos em nitrogˆ e- nio, sendo dispensados como lixo comum causando um enorme impacto ambiental. Como agravante, tal problema ocorre principalmente em locais onde a pr´ atica inapropriada do cultivo agr´ıcola, incentivado pelos baixos pre¸cos dos fertilizantes nitrogenados que, aliado

`

a pol´ıtica de subs´ıdios agr´ıcolas, aumentam ainda mais o impacto de tais medidas. Nes- tas circunstˆ ancias apenas metade (no m´ aximo) no nitrogˆ enio aplicado no solo chega ` as plantas. O resto ´ e lixiviado pela chuva e atinge len¸c´ ois fre´ aticos, rios e ´ aguas costeiras.

O resultado ´ e a crescente eutrofiza¸c˜ ao de tais ambientes, altamente prejudicial ` a vida marinha. E h´ a de se considerar ainda o perigo para a sa´ ude humana quando tais len¸c´ ois fre´ aticos entram em contato com fontes de ´ agua pot´ avel.

Al´ em de todos estes problemas, a oxida¸c˜ ao da ur´ eia e do amˆ onio ` a nitrato progressi- vamente levam ` a acidifica¸c˜ ao do solo – um dos principais problemas agr´ıcolas no mundo.

Outro problema relacionado ´ e a emiss˜ ao de ´ oxidos do nitrogˆ enio (NOx) por microrganis-

mos agindo nos fertilizantes. Estes ´ oxidos s˜ ao altamente vol´ ateis, o que causa ` a perda de

quase 50% da amˆ onia aplicada, al´ em disto, estes ´ oxidos depois de volatilizados acabam

(34)

voltando para o solo, desta vez de uma maneira mais dr´ astica, atrav´ es da chuva ´ acida.

Alguns destes problemas podem ser contornados simplesmente pelo uso mais efici- ente dos fertilizantes aplicados, utilizando-se doses adequadas e respeitando-se os tem- pos entre as aplica¸c˜ oes. Uma outra abordagem que contorna os problemas descritos ´ e a utiliza¸c˜ ao da fixa¸c˜ ao biol´ ogica de nitrogˆ enio (FBN). A FBN ´ e um processo realizado por diferentes classes de microrganismos, exclusivamente procari´ oticos, que consiste na transforma¸c˜ ao do nitrogˆ enio atmosf´ erico em amˆ onia atrav´ es de uma enzima chamada de nitrogenase. Do ponto de vista energ´ etico, ele tamb´ em ´ e dispendioso para o microrga- nismo que o realiza, por´ em, por ser catalizado por uma enzima, a energia de ativa¸c˜ ao necess´ aria para a ocorrˆ encia do processo ´ e bem menor do que no processo inorgˆ anico. De fato, o pr´ oprio Fritz Haber chamou a aten¸c˜ ao para a FBN quando terminou seu discurso de aceita¸c˜ ao do Nobel de Qu´ımica, em 1920, com as seguintes palavras:

“Pode ser que esta n˜ ao seja a solu¸ c˜ ao final. As bact´ erias do nitrogˆ enio nos dizem que a Natureza, com suas sofisticadas formas de qu´ımica da mat´ eria viva, compreende e utiliza m´ etodos que n´ os ainda n˜ ao sabemos imitar. Neste meio tempo, nos basta que a ind´ ustria qu´ımica traga as riquezas nutritivas e venha ajudar o camponˆ es que, na boa terra, transforma pedras em p˜ ao.”

1

Quatro anos depois deste discurso de Haber, em Aussig, na Rep´ ublica Tcheca, nasceu Johanna D¨ obereiner. Em 1950 ela se formou em agronomia pela Universidade de Munique apresentando monografia de conclus˜ ao de curso intitulada “Bact´ erias na fixa¸c˜ ao assimbi´ o- tica de nitrogˆ enio e a possibilidade de seu aproveitamento na agricultura”. Poucos meses depois emigrou para o Brasil, onde foi contratada pelo ent˜ ao Instituto de Ecologia e Ex- perimenta¸c˜ ao Agr´ıcola, atual Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia da Embrapa, localizado no munic´ıpio de Serop´ edica, estado do Rio de Janeiro. Brasileira naturalizada, publicou uma s´ erie de trabalhos sobre o enriquecimento seletivo de bact´ erias fixadoras de nitrogˆ enio. Os grupos que dirigiu na Embrapa e na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro iniciaram, em 1963, um extenso programa de pesquisas sobre v´ arios aspectos da fixa¸c˜ ao biol´ ogica do nitrogˆ enio por plantas cultivadas, acumulando dados e resultados

1Traduc˜ao livre de Fritz Haber, Haber, F. 1920. The synthesis of ammonia from its elements.

http://nobelprize.org/nobel prizes/chemistry/laureates/1918/haber-lecture.pdf

(35)

que indicam a superioridade desses recursos naturais sobre a utiliza¸c˜ ao de fertilizantes minerais.

Na introdu¸c˜ ao oficial do cultivo da soja no Brasil, no final da d´ ecada de 50, D¨ obe- reiner se posicionou a favor do aproveitamento das associa¸c˜ oes entre a planta e bact´ erias fixadoras de nitrogˆ enio, opondo-se ` a utiliza¸c˜ ao obrigat´ oria de adubos nitrogenados. A ado-

¸c˜ ao desta linha de pensamento resultou, ao longo dos anos seguintes, numa consider´ avel economia para o pa´ıs. Seus estudos sobre fixa¸c˜ ao biol´ ogica de nitrogˆ enio proporcionaram o desenvolvimento de uma tecnologia capaz de diminuir ou at´ e mesmo eliminar a depen- dˆ encia de aduba¸c˜ ao nitrogenada na cultura, poupando atualmente ao pa´ıs entre um e dois bilh˜ oes de d´ olares por ano. Tal tecnologia faz com que o Brasil tenha o menor custo de produ¸c˜ ao de soja do mundo, se estabelecendo como o segundo maior produtor mundial do gr˜ ao. As possibilidades abertas pelo achado em rela¸c˜ ao ` a atividade agr´ıcola motivaram a cria¸c˜ ao do Programa de Coopera¸c˜ ao Internacional em Fixa¸c˜ ao de Nitrogˆ enio nos Tr´ opicos, sob coordena¸c˜ ao de Johanna D¨ obereiner. Em 1997, assim como Fritz Haber em 1918, ela foi indicada para o Prˆ emio Nobel de Qu´ımica por seus trabalhos sobre a fixa¸c˜ ao biol´ ogica de nitrogˆ enio.

1.2 A Fixa¸ c˜ ao Biol´ ogica de Nitrogˆ enio.

O processo de FBN ´ e realizado por diferentes classes de microrganismos, chamados de mi-

crorganismos diazotr´ oficos. Eles s˜ ao exclusivamente procari´ oticos, mas podem ser arqueas

metanogˆ enicas ou bact´ erias aer´ obicas, anaer´ obicas, Gram positivas, Gram negativas, he-

terotr´ oficas, autotr´ oficas e fototr´ oficas.

(36)

Tabela 1.1: Exemplos de gˆ eneros de organismos diazotr´ oficos

De vida livre Simbi´oticos Endof´ıticos Aer´obicos Anaer´obicos Leguminosas N˜ao-

leguminosas

Azotobacter Firmibacterias Rhizobium Frankia Azospirillum Beijerinkia Desulfovibrio Bradyrhizobium Anabaena Gluconacetobacter

Nostoc Rhodospirillum Azoarcus

Methanococcus Herbaspirillum

Os organismos diazotr´ oficos s˜ ao divididos em trˆ es grupos principais:

• os de vida livre, que podem viver e fixar N

2

independentemente de outros organis- mos. A capacidade de fixar N

2

por microorganismos de vida livre est´ a amplamente distribuida entre as bact´ erias e arqueas do solo e da ´ agua. Todos os grupos fisiol´ o- gicos tem algum representante que ´ e capaz de realizar este processo com maior ou menor eficiˆ encia [Baldani et al., 1997].

• os que vivem em simbiose com outros organismos. Os exemplos mais conheci- dos fazem parte dos gˆ eneros Rhizobium e Bradyrhizobium, que infectam as ra´ızes de plantas leguminosas e estimulam a produc˜ ao de n´ odulos, dentro dos quais as bacterias fixam N

2

, enquanto a planta responde fornecendo nutrientes orgˆ anicos produzidos durante a fotoss´ıntese. Tais n´ odulos possuem condi¸c˜ oes otimizadas para uma m´ axima eficiˆ encia do processo de fixa¸c˜ ao. Outra bact´ eria fixadora de N

2

que estabelece rela¸c˜ oes simbi´ oticas (por´ em com plantas n˜ ao-leguminosas) ´ e a cianobact´ e- ria Anaebaena azollae, que vive en pequenos poros da planta aqu´ atica Azolla. Outro exemplo ´ e o o gˆ enero Frankia, uma bact´ eria que se assemelha a Estreptomicetes, que forma n´ odulos em ´ arvores, arbustos e herb´ aceas [Baldani et al., 1997].

• A intera¸c˜ ao entre bact´ erias diazotr´ oficas e gram´ıneas ´ e um tipo particular de asso-

cia¸c˜ ao entre planta/diazotr´ oficos conhecido como coloniza¸c˜ ao endof´ıtica. A asso-

cia¸c˜ ao endof´ıtica ´ e caracterizada por uma coloniza¸c˜ ao de diversos tecidos vegetais

por bact´ erias diazotr´ oficas que promovem o crescimento da planta sem causar qual-

quer sintoma de doen¸ca [D¨ obereiner, 1992]. Baldani e colaboradores sugeriram a

(37)

separac˜ ao do grupo entre os ”endof´ıticos associativos ou facultativos” para os micro- organismos que s˜ ao capazes de colonizar a superf´ıcie e o interior da raiz e sobreviver bem no solo, e os ”end´ ofiticos obrigat´ orios ” que n˜ ao sobrevivem no solo mas coloni- zam o interior das ra´ızes e a parte a´ erea da planta [Baldani et al., 1997]. H´ a, por´ em, outros autores que discordam quanto ao uso da terminologia ”endof´ıtico obrigat´ orio”

pois estas bact´ erias podem crescer em meio de cultura sem a presen¸ca de extratos de vegetais [Reinhold-Hurek e Hurek, 1998]. Mais recentemente, devido a dificuldade de separa¸c˜ ao entre esses dois grupos esta classifica¸c˜ ao foi abandonada. A lista de di- azotr´ oficos endof´ıticos que colonizam plantas n˜ ao-leguminosas inclui v´ arias bact´ erias do gˆ enero Azospirillum (A. brasilense, A. lipoferum, A. amazonense, A. irakense), Herbaspirillum seropedicae, H. rubrisubalbicans, G. diazotrophicus, Azoarcus sp. e Burkholderia sp. Estas bact´ erias foram isoladas de cana-de-a¸c´ ucar, plantas forra- geiras, cereais e outros hospedeiros e s˜ ao descritas em detalhes em publica¸c˜ oes de D¨ obereiner e Baldani [D¨ obereiner et al., 1993, Baldani et al., 1997].

Organismos fixadores de nitrogˆ enio que estabeleceram simbiose com plantas superiores sempre foram o foco da aten¸c˜ ao dos pesquisadores que estudam o processo de FBN.

De fato, as maiores contribui¸c˜ oes em nitrogˆ enio fixado por FBN foram detectadas em oceanos e plantas leguminosas. No entanto, evidˆ encias recentes de significativa FBN em gram´ıneas de importˆ ancia econˆ omica, em especial cana-de-a¸c´ ucar (Saccharum sp.), arroz (Oryza sativa), gram´ıneas forrageiras, como Leptochloa fusca despertaram novos interesses nos estudos de fixa¸c˜ ao de nitrogˆ enio e o estudo da FBN em gram´ıneas ganhou novo folego [Baldani et al., 1997, James, 2000].

1.2.1 O complexo enzim´ atico da nitrogenase

Em organismos diazotr´ oficos, o processo de redu¸c˜ ao do nitrogˆ enio ´ e catalizado pela ni-

trogenase, que ´ e um complexo de metaloenzimas com caracter´ısticas mecˆ anicas e estrutu-

rais conservadas [Rees e Howard, 2000, Lawson e Smith, 2002, Dixon e Kahn, 2004]. Es-

tas enzimas contˆ em dois componentes que s˜ ao nomeados de acordo com o metal de

(38)

sua composi¸c˜ ao. O componente dim´ erico menor, conhecido como Ferro-prote´ına (Fe- prote´ına, produto do gene nifH ), que funciona como um doador de el´ etrons dependente de ATP para o maior componente heterotetramerico, conhecido como prote´ına Ferro- molibdˆ enio (MoFe-prote´ına, produto do gene nifD K), que cont´ em o s´ıtio catal´ıtico da enzima [Dixon e Kahn, 2004]. O complexo da nitrogenase ´ e codificado pelos genes estru- turais nifHDK. A Ferro-prote´ına cont´ em um n´ ucleo 4Fe-4S, j´ a a MoFe-prote´ına (codifi- cada pelos genes nifDK ), cont´ em dois grupos prost´ eticos: Centro P [8Fe–7S] e o cofator ferro molibdˆ enio. Estes componentes apresentam forte homologia entre diferentes micro- organismos diazotr´ oficos, podendo o componente I de um organismo ser combinado ao componente II de outro, tornando o complexo nitrogenase ativo [Detroy et al., 1967].

Um modelo estrutural do complexo nitrogenase de Azotobacter vinelandii est´ a apre- sentado na Figura 1.1 Todos os diazotr´ oficos tˆ em um sistema ferro-molibdˆ enio nitroge- nase, mas em condi¸c˜ oes de ausˆ encia de molibdˆ enio, alguns organismos como A. vinelandii e Rhodobacter capsulatus - induzem a s´ıntese de nitrogenases alternativas contendo como co-fatores o ferro-van´ adio ou ferro-ferro [Eady, 1996]. O mecanismo enzim´ atico da ni- trogenase requer a redu¸c˜ ao da Fe-prote´ına por doadores de el´ etrons como ferredoxina e flavodoxina, a transferˆ encia de el´ etrons para a MoFe-prote´ına atrav´ es de um processo de- pendente da hidr´ olise de Mg-ATP e a transferˆ encia de el´ etrons para o substrato ligado ao s´ıtio ativo da MoFe-prote´ına [Dixon e Kahn, 2004]. Em condi¸c˜ oes ´ otimas, a estequiome- tria global da rea¸c˜ ao ´ e [Simpson e Burris, 1984]:

N

2

+ 8e

+ 8H + 16AT P → 2N H

3

+ H

2

+ 16ADP + P i (1.1)

Devido ` a sensibilidade das nitrogenases ao oxigˆ enio e ao alto custo energ´ etico da

FBN, esse processo em diazotr´ oficos ´ e estritamente regulado [Postgate, 1998]. Em pro-

teobact´ erias, a s´ıntese do complexo enzim´ atico da nitrogenase depende da atividade da

prote´ına NifA em conjunto com a o promotor σv

54

respons´ avel pela ativa¸c˜ ao da transcri¸c˜ ao

dos genes nif (genes da fixa¸c˜ ao do nitrogˆ enio), que codificam a nitrogenase e outras prote´ı-

nas necess´ arias para a s´ıntese desta enzima, matura¸c˜ ao dos seus componentes, transporte

(39)

de el´ etrons e regula¸c˜ ao da transcri¸c˜ ao [Merrick, 1992].

Figura 1.1: Estrutura do complexo da nitrogenase de Azotobacter vinelandii. As subu- nidades Fe-prote´ına est˜ ao coloridas em azul claro, marron e cinza. As subunidades da MoFe-prote´ına est˜ ao coloridas em verde, amarelo, azul escuro e vermelho (Adaptado de Dixon [2004] por Guedes [2010]Oi).

1.3 Gluconacetobacter diazotrophicus

1.3.1 Importˆ ancia biotecnol´ ogica

As maiores contribui¸c˜ oes da FBN s˜ ao detectadas em oceanos (devido a a¸c˜ ao das cia- nobact´ erias) e em plantas leguminosas (devido a a¸c˜ ao das bact´ erias simbi´ oticas), mas atualmente grandes esfor¸cos tˆ em sido feitos para que essa fixa¸c˜ ao seja estendida para ou- tras esp´ ecies que colonizam plantas n˜ ao leguminosas, principalmente gram´ıneas de grande importˆ ancia econˆ omica. No caso do Brasil a cultura de cana-de-a¸c´ ucar (Saccharum spp.;

fam´ılia Poaceae ) ´ e considerada estrat´ egica no desenvolvimento, gra¸cas ao Pr´ o ´ Alcool, um

programa que visa iniciativar o uso do etanol alternativamente a combust´ıveis f´ osseis

[Zanin et al., 2000]. Al´ em disso, o Brasil ´ e o maior produtor mundial de cana-de-a¸c´ ucar

segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estat´ıstica (IBGE). Neste cen´ ario ´ e necess´ a-

rio o desenvolvimento de tecnologias capazes de diminuir o custo de produ¸c˜ ao da cana-de-

a¸c´ ucar e que permitam um aumento da produtividade das ´ areas plantadas. A descoberta

(40)

de que a associa¸c˜ ao de plantas da fam´ılia Poacea (Gramineae) com algumas bact´ erias dia- zotr´ oficas era capaz de promover o crescimento vegetal [Baldani et al., 1997] estimulou as pequisas nesta ´ area. Entre essas pesquisas, resultados bastante promissores foram obtidos em plantas de cana-de-a¸c´ ucar inoculadas com G. diazotrophicus. A inocula¸c˜ ao de plantas de cana-de-a¸c´ ucar micropropagadas com a estirpe Pal5, aumentou o peso fresco da parte a´ erea da planta em 28% [Baldani et al., 1999]. Outra evidˆ encia da contribui¸c˜ ao de G.

diazotrophicus na FBN foi demonstrada pela inocula¸c˜ ao de plantas de cana-de-a¸c´ ucar mi- cropropagadas com a estirpe selvagem Pal5 e seu mutante n˜ ao fixador (nif -), seguida da medi¸c˜ ao de

15

N incorporado aos tecidos vegetais [Sevilla et al., 2001]. Oliveira e colabo- radores demonstraram que a inocula¸c˜ ao combinada de bact´ erias diazotr´ oficas endof´ıticas e associativas promove um efeito sinerg´ıstico quando comparado com a inocula¸c˜ ao indi- vidual da bact´ eria em plantas micropropagadas de cana-de-a¸c´ ucar [Oliveira et al., 2002].

Aumentos da ordem de 30% no ac´ umulo de nitrogˆ enio via FBN foram observados nestas plantas. Al´ em da variedade existente entre estirpes de bact´ erias na eficiˆ encia durante a associa¸c˜ ao, existem tamb´ em diferen¸cas entre os diversos cultivares de cana-de-a¸c´ ucar na capacidade de obten¸c˜ ao do nitrogˆ enio via FBN. Recentemente, Oliveira e colaboradores demonstraram, em cana-de-a¸c´ ucar, que a contribui¸c˜ ao da FBN foi influenciada pela com- bina¸c˜ ao das esp´ ecies presentes no in´ oculo, gen´ otipo da planta, tipo de solo e fertiliza¸c˜ ao de nitrogˆ enio. As diferen¸cas de FBN entre os diferentes cultivares indicam que fatores gen´ eticos da planta regulam a eficiˆ encia do processo [Oliveira et al., 2006].

Desse modo, essa bact´ eria torna-se um modelo de estudo de organismos fixadores de nitrogˆ enio, tanto pela compreens˜ ao da fixa¸c˜ ao biol´ ogica de nitrogˆ enio (FBN) propria- mente dita quanto pelo seu potencial biotecnol´ ogico como, por exemplo, pela possibilidade de substitui¸c˜ ao de fertilizantes nitrogenados em diferentes culturas de importˆ ancia econˆ o- mica, principalmente na cana-de-a¸c´ ucar. De fato, tem sido largamente documentado que G. diazotrophicus pode aumentar a taxa de crescimento da cana-de-a¸c´ ucar, e este benef´ıcio

´

e associado a algumas caracter´ısticas fisiol´ ogicas desta esp´ ecie:

• A primeira delas ´ e a capacidade de fixar nitrogˆ enio atmosf´ erico. A transferˆ encia

(41)

do nitrogˆ enio bacteriologicamente fixado ao vegetal contribui com uma parcela do nitrogˆ enio necess´ ario para o desenvolvimento da planta hospedeira,

• A produ¸c˜ ao de fatores estimulantes do crescimento vegetal, destacando-se a pro- du¸c˜ ao dos fitormˆ onios auxina (como o ´ acido 3-indol ac´ etico, IAA) e giberilina, que tˆ em sido amplamente detectados em culturas deste end´ ofito [Lee et al., 2000, Mu˜ noz-Rojas e Caballero-Mellado, 2003, Muthukumarasamy et al., 2006].

• Aumento da disponibilidade de nutrientes atrav´ es da solubiliza¸c˜ ao de F´ osforo (P) e Zinco (Zn) [Linu et al., 2009, Saravanan et al., 2007].

• Outro exemplo de importˆ ancia biotecnol´ ogica est´ a relacionado a processos de con- trole biol´ ogico, devido a uma atividade antagonista contra Xanthomonas albilineans, como resultado da produ¸c˜ ao de uma bacteriocina similar ` a lisozima. A G. diazo- trophicus ´ e capaz de inibir o crescimento deste fitopat´ ogeno respons´ avel pela doen¸ca da escaldadeira folia na cana-de-a¸c´ ucar, possivelmente atrav´ es da destrui¸c˜ ao da pa- rede celular da cepa patogˆ enica [Pi˜ n´ on et al., 2002, Blanco et al., 2005].

• Al´ em disso, a coloniza¸c˜ ao por G. diazotrophicus leva a um aumento da densi- dade de pˆ elos radiculares, da taxa de ra´ızes secund´ arias e da superf´ıcie radicular [Bashan e Levanony, 1990] que resulta num aumento da absor¸c˜ ao de ´ agua e nutri- entes, aumentando assim a capacidade da planta de produzir e suportar estresses ambientais [Baldani et al., 1983, Kapulnik et al., 1985].

• Outro aspecto que deve ser destacado tamb´ em ´ e que, diferentemente da intera¸c˜ ao

riz´ obio/ leguminosa, na associa¸c˜ ao G. diazotrophicus-planta n˜ ao h´ a forma¸c˜ ao de

n´ odulos ou qualquer outra estrutura formada ou induzida pela bact´ eria, o que sugere

uma intera¸c˜ ao muito bem sucedida no interior da planta promovendo o crescimento

vegetal sem causar nenhum sintoma de doen¸ca, cujo mecanismo molecular precisa

ser melhor entendido [Baldani e Baldani, 2005].

(42)

1.3.2 Isolamento e habitat natural

O primeiro isolamento do microrganismo utilizado neste estudo foi feito por Cavalcante e D¨ obereiner, a partir de ra´ızes e caules de diversas variedades de cana-de-a¸c´ ucar-de ac´ ucar (Saccharum officinarum ) cultivadas em diferentes regi˜ oes do Brasil. O orga- nismo foi descrito como “uma nova bact´ eria ´ acido-tolerante fixadora de nitrogˆ enio” e foi nomeada Saccharobacter nitrocaptans [Cavalcante e D¨ obereiner, 1988]. Ap´ os seu pri- meiro isolamento, a associa¸c˜ ao de G. diazotrophicus com a cana-de-a¸c´ ucar foi confir- mada por novos isolamentos a partir de variedades de cana-de-a¸c´ ucar cultivadas co- mercialmente na Austr´ alia [Li e MacRae, 1991], M´ exico [Fuentes-Ramirez et al., 1993] e de plantas provenientes de Cuba cultivadas em estufas no Canad´ a [Dong et al., 1995].

Al´ em da cana-de-a¸c´ ucar, G. diazotrophicus foi isolada de outras plantas que s˜ ao propa- gadas vegetativamente e alta sacarose como por exemplo o capim Cameroon (Pennise- tum purpureum ) [D¨ obereiner et al., 1993], batata (Ipomoea batatas) [Paula et al., 1991, Paula et al., 1992], sorgo (Sorghum vulgare ) [Paula et al., 1991] e abacaxi (Annanas sp.) [Tapia-Hern´ andez et al., 2000]. At´ e 1991, a ausˆ encia G. diazotrophicus, na rizosfera de cana-de-a¸c´ ucar [Cavalcante e D¨ obereiner, 1988], assim como sua ausˆ encia no interior de plantas diferentes da cana-de-a¸c´ ucar cultivadas junto com a cana-de-a¸c´ ucar [Reis et al., 1994]

refor¸caram a id´ eia da do car´ ater endof´ıtico desta bact´ eria e de sua associa¸c˜ ao exclusiva com plantas que acumulam sacarose e que propagam vegetativamente [D¨ obereiner et al., 1993].

No entanto, a partir de 1991 a G. diazotrophicus foi detectada ocasionalmente na rizosfera de cana-de-a¸c´ ucar [Li e MacRae, 1991], na rizosfera e tecidos de plantas de caf´ e (Coffea

arabica L.) [Jim´ enez-Salgado et al., 1997] e do cereal Eleusine coracana [Loganathan et al., 1999], que n˜ ao cont´ em alta concentra¸c˜ ao de sacarose e sua propaga¸c˜ ao ´ e por sementes, bem como

Saccharococcus sacchari, um inseto-praga da cana-de-a¸c´ ucar [Ashbolt e Inkerman, 1990,

Caballero-Mellado et al., 1995].

(43)

1.3.3 Taxonomia

Ao primeiro isolamento, o microrganismo utilizado neste estudo foi nomeado Saccharo- bacter nitrocaptans [Cavalcante e D¨ obereiner, 1988], mas com base em experimentos de hibridiza¸c˜ ao RNA/DNA e DNA/DNA seu nome foi modificado para Acetobacter nitro- captans. Foi s´ o alguns meses depois que Gillis e colaboradores, baseados em estudos de hibridiza¸c˜ ao de DNA, na presen¸ca de flagela¸c˜ ao lateral e na capacidade de oxidar o acetato e lactato a CO

2

e ´ agua, sugeriram o nome oficial de Acetobacter diazotrophicus, nome com o qual ainda hoje continua a se reconhecer esta esp´ ecie, e definir o tipo de estirpe LMG 7603 (D¨ obereiner PAL 5

T

= ATCC 49037) [Gillis et al., 1989]. Tradicional- mente a famil´ıa Acetobacteraceae era dividida nos gˆ eneros Acetobacter e Gluconobacter [Swings, 1992]. No entanto, em 1997, Yamada e colaboradores propuseram um novo re- gime na taxonomia da fam´ılia, e a dividiram nos gˆ eneros: Acetobacter, Acetobacteraceae, Gluconobacter, Gluconoacetobacter e Acidomonas, com base na sequˆ encia parcial do gene 16S do RNA ribossomal e do tipo ubiquinona predominante [Yamada et al., 1997]. Em 1998, Yamada e colaboradores corrigiram o nome do gˆ enero Gluconoacetobacter para Gluconacetobacter, e foi s´ o a partir de ent˜ ao que a primeira estirpe fixadora de nitro- gˆ enio descrita nesta fam´ılia passou a ser conhecida oficialmente como Gluconacetobacter diazotrophicus [Yamada et al., 1998].

A fam´ılia Acetobacteraceae pertence a uma subclasse α-Proteobacteria [Young, 1992].

S˜ ao bact´ erias aer´ obicas, Gram negativas, caracterizadas por sua capacidade de oxidar o etanol a ´ acido ac´ etico em meio de cultura com pH neutro ou ´ acido [De Ley et al., 1984, Swings, 1992]. Genotipicamente a fam´ılia Acetobacteraceae pode ser diferenciada de ou- tras α -Proteobacterias pela presen¸ca de dois s´ıtios de restri¸c˜ ao SphI e NcoI dentros do gene 16S do DNA ribossomal [Caballero-Mellado et al., 1999, Jim´ enez-Salgado et al., 1997].

Os gˆ eneros Acetobacter, Gluconacetobacter e Acidomonas, ao contr´ ario Gluconobacter,

s˜ ao capazes oxidar completamente etanol e lactato a CO

2

e H

2

O (Swings, 1992). Embora

o gˆ enero Gluconacetobacter compartilhe com outros membros de sua fam´ılia a capacidade

de oxidar etanol, ele ´ e o ´ unico gˆ enero da fam´ılia (descrito at´ e agora), que tem esp´ ecies com

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