Fundamento dos métodos

Método utilizado para detecção e semi-quantificação de auto-anticorpos no soro. Trata-se de um procedimento que utiliza anticorpos fluorescentes como marcadores para uma reacção de ligação antigénio-anticorpo. Na amostra em estudo os auto-anticorpos eventualmente presentes fixam-se aos antigénios do substrato. O anti-soro polivalente conjugado com fluoresceína adicionado ao substrato fixa-se ao anticorpo ligado. Depois da lavagem para remover o conjugado em excesso, o substrato é observado ao microscópio de fluorescência.

A IFI é a técnica com que se inicia a pesquisa da maior parte dos auto-anticorpos. Apresenta como vantagens a fácil execução, a elevada sensibilidade e a possibilidade de detecção simultânea de mais do que um auto-anticorpo. Apresenta no entanto importantes limitações

77 metodológicas e de interpretação, é uma técnica subjectiva, difícil de padronizar e os resultados são semi-quantitativos.

A escolha do substrato depende do tipo de anticorpo que se pretende pesquisar. Os substratos utilizados são os seguintes:

Células HEp-2

As células HEp-2 são células epiteliais humanas obtidas de carcinoma da laringe (human epithelioma type 2 cells). Estas células são utilizadas na pesquisa dos anticorpos antinucleares (ANA) e têm como vantagens o facto de possuírem um núcleo grande, grandes e vários nucléolos, grande diversidade de antigénios nucleares, elevada sensibilidade e especificidade e várias células nos diferentes estadios de mitose permitindo a detecção de anticorpos dirigidos contra antigénios que apenas são expressos durante o ciclo celular.

Os ANA constituem um vasto grupo de auto-anticorpos que reagem com diversos constituintes do núcleo: dsDNA, histonas, nucleossoma, antigénios nucleares extraíveis (ENA) – Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Jo-1 e Scl70, nucléolo, membrana nuclear e aparelho mitótico (centrómero, centríolo e fuso mitótico). O método tradicional para screening dos ANA no soro tem sido desde há muito o método de imunofluorescência indirecta, sendo as abordagens posteriores, no que respeita a técnicas e caracterização dos anticorpos, resultantes do padrão de fluorescência obtido.

A identificação das especificidades dos ANA em doentes com doenças sistémicas de base auto- imunitária, tais como o lúpus eritematoso sistémico (LES), esclerodermia, síndrome de Sjogren (SS), polimiosite (PM), dermatomiosite (DM), doença conectiva mista do tecido conjuntivo (MCTD) artrite reumatóide (AR) e outras, tem grande importância fisiopatológica e clínica. De facto, algumas especificidades dos ANA contribuem para o diagnóstico e podem ser utilizadas no estudo da evolução natural da doença, na monitorização terapêutica e ainda no estabelecimento do prognóstico.

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Tabela 2 – Padrões nucleares comuns e correlação com a clínica (Biorad.

Autoimmune CD, education and training tools [CD-ROM]. 2009).

Padrão nuclear Características Correlação clínica

Homogéneo Fluorescência difusa e uniforme dos núcleos em interfase, mitoses positivas

LES, lúpus induzido por fármacos, AR

Mosqueado Fluorescência granular fina ou grosseira dos núcleos em interfase, mitoses negativas

LES, MCTD, SS, PM, esclerodermia

Centrómero Numerosos pontos fluorescentes (46), mitoses positivas

CREST, cirrose biliar 1ª Nucleolar Coloração exclusiva dos

nucléolos, mitoses positivas ou negativas

Esclerodermia, miosite, LES

Em muitas circunstâncias são os perfis de tipos distintos de ANA que estão associados a certas doenças, sendo considerados marcadores para algumas delas. A título de exemplos, o anticorpo contra o antigénio Smith (Sm) e o anticorpo anti-dsDNA têm uma forte associação com o LES, enquanto que o ANA anti-centrómero está associado, frequentemente, a uma forma particular de esclerodermia – CREST: síndrome com calcinose, fenómeno de Raynaud, disfunção esofágica, esclerodactilia, telangiectasias.

Tabela 3 – Correlação de alguns ENA com a clínica (Biorad.

Autoimmune CD, education and training tools [CD-ROM]. 2009).

Anticorpo Correlação clínica

Anti Sm LES

Anti RNP MCTD, LES, miosite, esclerodermia, Anti SSA SS, LES, lúpus neo-natal

Anti SSB SS, LES Anti Jo-1 PM/DM Anti SCl70 Esclerodermia

79 Crithidia luciliae

Este substrato é utilizado na pesquisa de anticorpos anti-dsDNA. A Crithidia luciliae é um parasita flagelado, não patogénico para o Homem, que possui uma mitocôndria gigante que contém uma massa de dsDNA circular muito condensada. Esta massa de DNA, conhecida como o cinetoplasto, parece ser livre de histonas ou de quaisquer outros antigénios nucleares de mamíferos. A principal vantagem do teste de dsDNA usando a Crithidia luciliae é a sua grande especificidade, devido à natureza do dsDNA circular no cinetoplasto.

Substrato triplo (rim, estômago e fígado de roedores)

A imunofluorescência indirecta sobre cortes de tecidos de rim, estômago e fígado de roedores é o método utilizado na pesquisa dos anticorpos anti-mitocôndria (AMA), anticorpos anti-célula parietal (APCA), anticorpos anti-músculo liso (ASMA) e anticorpos anti-microssomas hepáticos e renais (anti-LKM). Os diferentes anticorpos são identificados de acordo com o aspecto e localização da fluorescência ao nível dos três tecidos.

Células VSM47

As células VSM47 são células musculares lisas (vascular smooth muscle) utilizadas na pesquisa de anticorpos anti-filamentos de actina (F-actina), por exemplo no caso de um ASMA positivo.

Granulócitos

As preparações de granulócitos humanos são utilizadas na pesquisa dos anticorpos anti- citoplasma dos neutrófilos (ANCA). As preparações apresentam granulócitos fixados com etanol e com formol para permitir a distinção dos dois padrões – cANCA (padrão citoplasmático, antigénio PR3) e pANCA (padrão perinuclear, antigénio MPO). Em certas situações recorre-se a granulócitos fixados pelo metanol para classificar o padrão xANCA.

Estômago de primata e suspensão de factor intrínseco

Esta preparação é utilizada na pesquisa de anticorpos anti-factor intrínseco (FI) e anti-célula parietal. As lâminas contêm secções de estômago de primata e gotas microscópicas de uma suspensão que contém FI.

80 Imunoensaios enzimáticos

MicroElisa

A metodologia de MicroElisa é utilizada para identificação e quantificação de autoanticorpos. A técnica está automatizada e é realizada no aparelho MAGO da Diamedix.

É um método imunoenzimático em sandwich que detecta o anticorpo no soro. Utilizam-se anticorpos monoclonais, quer para revestir as microplacas, que se unirão ao anticorpo presente na amostra, quer para detectar o anticorpo ligado nas microplacas sensibilizadas (reagente conjugado: anticorpos monoclonais ligados à peroxidase). O excedente é eliminado por lavagem da placa e a seguir adiciona-se o substrato que reagirá com o complexo formado, originando uma reacção de cor azul, que depois passa a amarelo quando se junta a solução de paragem (ácido). A absorvância (densidade óptica) das amostras e controlos é lida com um espectrofotómetro configurado com um comprimento de onda de 450 nm.

Este Laboratório de Imunologia dispõe de ensaios de MicroElisa para a pesquisa de anticorpos anti-dsDNA, anti-célula parietal, anti-antigénios mitocondriais M2 e antifosfolípidos (anti-β2- glicoproteína I e anti-cardiolipina).

Imunoblot

A metodologia Imunoblot é utilizada para identificação qualitativa de anticorpos. A técnica está automatizada e é realizada no aparelho EUROBlotMaster da Euroimmun. Os vários antigénios estão depositados numa membrana de nitrocelulose. Cada tira contém vários antigénios o que permite, num único teste, identificar vários anticorpos. O princípio do método é semelhante ao método ELISA. A tira é incubada com uma diluição do soro a analisar. Os anticorpos, se presentes, ligam-se aos respectivos antigénios e as ligações não específicas são removidas pela lavagem. A ligação é detectada por uma anti-globulina humana conjugada com uma enzima que se liga ao anticorpo. Esta reacção é revelada pela adição do substrato que após reacção com a enzima forma um composto corado.

Este Laboratório de Imunologia dispõe de imunoblots para a pesquisa de ANA, anticorpos contra antigénios hepáticos, auto-anticorpos associados a miosites, auto-anticorpos associados a

81 esclerose sistémica e anticorpos anti-mieloperoxidase (MPO), anti-proteinase 3 (PR3) e anti- membrana basal glomerular (GBM).

Doseamento do factor reumatóide

Os factores reumatóides são auto-anticorpos dirigidos contra o fragmento Fc das imunoglobulinas. São geralmente anticorpos da classe IgM. A sua pesquisa é mais frequente na confirmação de um diagnóstico clínico de artrite reumatóide. Encontram-se em cerca de 80% dos indivíduos com esta patologia após um ano de evolução e o seu título correlaciona-se com a severidade da doença.

Neste Laboratório de Imunologia o factor reumatóide é determinado por duas técnicas, uma técnica mais específica – Reacção de Waller-Rose, a qual será referida no sector da serologia e uma técnica mais sensível – o RA Teste, sendo este doseamento efectuado por nefelometria no aparelho BN ProSpec (Siemens).

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