Fundamentos de um poder: as atividades religiosas dos cabidos catedralícios

3.1.1 Cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques CD34+

3.1.1.1 Isolement des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques CD34+

Les échantillons de sang de cordon ombilical sont fournis par la maternité de la Clinique E. Bohler (Luxembourg) avec l’accord du comité d’éthique de la clinique et du comité d’éthique de recherche après consentement des futurs parents sur la procédure. Le sang de cordon est récupéré dans des tubes de 50 mL contenant 20 U/mL (unités/mL) d’héparine (Ratiopharm, Allemagne) diluée dans du DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, Lonza, Belgique). Le sang est alors dilué au 1/3 dans du DPBS contenant 2 mM d’EDTA (éthyl diamine tetraacétate, MP Biomedicals, Belgique) puis déposé dans des tubes avec filtres contenant 15 mL de Ficoll-Paque Premium (GE Healthcare, Pays-Bas). L’ensemble est centrifugé 16 minutes à 800 g, afin de permettre la séparation des cellules en fonction de leur densité grâce au Ficoll. Les globules rouges et les granulocytes, qui sont plus denses que le Ficoll, vont sédimenter au fond du tube. Les cellules mononuclées, parmi lesquelles se trouvent les cellules CD34+

, sont présentes à l’interface entre le Ficoll et le plasma. Après centrifugation, les cellules mononuclées sont récupérées, lavées avec du DPBS-EDTA puis comptées. Des billes magnétiques couplées à des anticorps anti-CD34 (CD34 microbead kit, Miltenyi Biotec, Allemagne) sont mises en contact avec les cellules pendant 30 minutes à 4°C. Puis les cellules sont lavées avec 10 mL de tampon MACS (Magnetic Cell Sorting : EDTA 2 mM, sérum albumine bovine (SAB) 5%) et déposées sur la colonne de purification magnétique (LS MACS separation column, Miltenyi Biotec) préalablement équilibrée avec 2 mL de tampon MACS. Après trois lavages avec 3 mL de tampon MACS, les cellules sont éluées par 4 mL de tampon MACS mécaniquement grâce à un piston. Les 4 mL obtenus sont déposés sur une seconde colonne préalablement équilibrée. Après trois lavages successifs, une élution finale dans 4 mL de tampon MACS permet de récupérer les cellules CD34+

.

La caractérisation des cellules après isolation a été effectuée au laboratoire par le Dr. Christina Grigorakaki (Grigorakaki et al., 2011). Après enrichissement (J-3), la population cellulaire évaluée par cytométrie de flux est constituée à95,4% ± 0,65 de cellules CD34+

alors que les populations minoritaires sont représentées par des cellules exprimant les marqueurs CD36, CD235a (GPA) (érythrocytaires), CD41 (mégacaryocytaires), CD11b (myélo-monocytaires) et CD24 (granulocytes et lymphocytes B).

3 Matériels et méthodes

3.1 Culture cellulaire et traitements

3.1.1 Cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques CD34+

3.1.1.1 Isolement des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques CD34+

Les échantillons de sang de cordon ombilical sont fournis par la maternité de la Clinique E. Bohler (Luxembourg) avec l’accord du comité d’éthique de la clinique et du comité d’éthique de recherche après consentement des futurs parents sur la procédure. Le sang de cordon est récupéré dans des tubes de 50 mL contenant 20 U/mL (unités/mL) d’héparine (Ratiopharm, Allemagne) diluée dans du DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, Lonza, Belgique). Le sang est alors dilué au 1/3 dans du DPBS contenant 2 mM d’EDTA (éthyl diamine tetraacétate, MP Biomedicals, Belgique) puis déposé dans des tubes avec filtres contenant 15 mL de Ficoll-Paque Premium (GE Healthcare, Pays-Bas). L’ensemble est centrifugé 16 minutes à 800 g, afin de permettre la séparation des cellules en fonction de leur densité grâce au Ficoll. Les globules rouges et les granulocytes, qui sont plus denses que le Ficoll, vont sédimenter au fond du tube. Les cellules mononuclées, parmi lesquelles se trouvent les cellules CD34+

, sont présentes à l’interface entre le Ficoll et le plasma. Après centrifugation, les cellules mononuclées sont récupérées, lavées avec du DPBS-EDTA puis comptées. Des billes magnétiques couplées à des anticorps anti-CD34 (CD34 microbead kit, Miltenyi Biotec, Allemagne) sont mises en contact avec les cellules pendant 30 minutes à 4°C. Puis les cellules sont lavées avec 10 mL de tampon MACS (Magnetic Cell Sorting : EDTA 2 mM, sérum albumine bovine (SAB) 5%) et déposées sur la colonne de purification magnétique (LS MACS separation column, Miltenyi Biotec) préalablement équilibrée avec 2 mL de tampon MACS. Après trois lavages avec 3 mL de tampon MACS, les cellules sont éluées par 4 mL de tampon MACS mécaniquement grâce à un piston. Les 4 mL obtenus sont déposés sur une seconde colonne préalablement équilibrée. Après trois lavages successifs, une élution finale dans 4 mL de tampon MACS permet de récupérer les cellules CD34+

.

La caractérisation des cellules après isolation a été effectuée au laboratoire par le Dr. Christina Grigorakaki (Grigorakaki et al., 2011). Après enrichissement (J-3), la population cellulaire évaluée par cytométrie de flux est constituée à95,4% ± 0,65 de cellules CD34+

alors que les populations minoritaires sont représentées par des cellules exprimant les marqueurs CD36, CD235a (GPA) (érythrocytaires), CD41 (mégacaryocytaires), CD11b (myélo-monocytaires) et CD24 (granulocytes et lymphocytes B).

3.1.1.2 Conditions de culture des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques CD34+

Les CSPH CD34+ isolés sont comptés et mises en culture dans un incubateur à 37°C, 95% d'humidité et 5% de CO2 à une concentration de 2x105 cellules/mL dans un milieu sans sérum (Stem Line Medium II, Sigma, Belgique) additionné d’un mélange d’antibiotiques, de L-glutamine (Lonza), de SCF (50 ng/mL) et d’IL-3 (10 ng/mL) (ReliaTech, Allemagne) qui permettent la croissance et la survie in vitro des CSH. La composition du milieu différenciant est basée sur le protocole établi par Carlile et al. (Carlile et al., 2004). Après 3 jours de culture, l’érythropoïèse est induite par l’ajout de 2 U/mL d’érythropoïétine recombinante humaine (Epo) (Epoïétine β, NeoRecormon, Roche, France). L’ajout de l’Epo correspond au jour 0 (J0). Au jour 4, les cellules sont centrifugées 7 minutes à 340 g, puis cultivées dans un milieu contenant 10 ng/mL de SCF et 2 U/mL d’Epo. Enfin, au jour 6, les cellules sont centrifugées et reprises dans du milieu contenant 2 U/mL d’Epo (Tableau 1). Les inhibiteurs de SMase, de mTOR et de la SphK1 sont ajoutés une heure avant le traitement au TNFα et le TNFα, la bSMase, les C2-cer, les DH et la S1P sont ajoutés une heure avant le traitement à l’Epo. Les cellules sont traitées à nouveau aux jours 4 et 6 après le changement de milieu (Figure 23).

3.1.1.3 Efficacité du milieu différenciant

L’efficacité du milieu différenciant a été évaluée en réalisant une coloration de May-Grünwald-Giemsa (MGG) et un test de coloration à la benzidine (cf Matériels et méthodes 3.3 et 3.4 respectivement) aux jours 0, 4, 6, et 9 de culture. La présence des différents stades de l’érythropoïèse et de réticulocytes à 9 jours de culture ainsi qu’un pourcentage de cellules produisant de l’Hb atteignant 80% témoigne de la capacité à reproduire l’érythropoïèse in vitro à partir des CSPH CD34+

isolés (Figure 24).

3.1.2 Les lignées érythroleucémiques humaines

Les lignées cellulaires utilisées sont cultivées dans du milieu de culture RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute, Lonza, Belgique) contenant 10% de SVF (sérum de veau fœtal) et 5% d'un mélange d'antibiotiques (pénicilline 100 U/mL, streptomycine 100 µg/ml, Cambrex) et d'antifongiques (25 µg/ml amphotéricine B). Les cultures sont placées dans un incubateur à 37°C, 95% d'humidité et 5% de CO2. Le comptage des cellules s'effectue sur cellules de Malassez au microscope optique. La viabilité des cellules est évaluée par le test d'exclusion au bleu de Trypan. La viabilité cellulaire correspond au nombre de cellules viables / nombre de cellules totales x100.

3.1.1.2 Conditions de culture des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques CD34+

Les CSPH CD34+ isolés sont comptés et mises en culture dans un incubateur à 37°C, 95% d'humidité et 5% de CO2 à une concentration de 2x105 cellules/mL dans un milieu sans sérum (Stem Line Medium II, Sigma, Belgique) additionné d’un mélange d’antibiotiques, de L-glutamine (Lonza), de SCF (50 ng/mL) et d’IL-3 (10 ng/mL) (ReliaTech, Allemagne) qui permettent la croissance et la survie in vitro des CSH. La composition du milieu différenciant est basée sur le protocole établi par Carlile et al. (Carlile et al., 2004). Après 3 jours de culture, l’érythropoïèse est induite par l’ajout de 2 U/mL d’érythropoïétine recombinante humaine (Epo) (Epoïétine β, NeoRecormon, Roche, France). L’ajout de l’Epo correspond au jour 0 (J0). Au jour 4, les cellules sont centrifugées 7 minutes à 340 g, puis cultivées dans un milieu contenant 10 ng/mL de SCF et 2 U/mL d’Epo. Enfin, au jour 6, les cellules sont centrifugées et reprises dans du milieu contenant 2 U/mL d’Epo (Tableau 1). Les inhibiteurs de SMase, de mTOR et de la SphK1 sont ajoutés une heure avant le traitement au TNFα et le TNFα, la bSMase, les C2-cer, les DH et la S1P sont ajoutés une heure avant le traitement à l’Epo. Les cellules sont traitées à nouveau aux jours 4 et 6 après le changement de milieu (Figure 23).

3.1.1.3 Efficacité du milieu différenciant

L’efficacité du milieu différenciant a été évaluée en réalisant une coloration de May-Grünwald-Giemsa (MGG) et un test de coloration à la benzidine (cf Matériels et méthodes 3.3 et 3.4 respectivement) aux jours 0, 4, 6, et 9 de culture. La présence des différents stades de l’érythropoïèse et de réticulocytes à 9 jours de culture ainsi qu’un pourcentage de cellules produisant de l’Hb atteignant 80% témoigne de la capacité à reproduire l’érythropoïèse in vitro à partir des CSPH CD34+

isolés (Figure 24).

3.1.2 Les lignées érythroleucémiques humaines

Les lignées cellulaires utilisées sont cultivées dans du milieu de culture RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute, Lonza, Belgique) contenant 10% de SVF (sérum de veau fœtal) et 5% d'un mélange d'antibiotiques (pénicilline 100 U/mL, streptomycine 100 µg/ml, Cambrex) et d'antifongiques (25 µg/ml amphotéricine B). Les cultures sont placées dans un incubateur à 37°C, 95% d'humidité et 5% de CO2. Le comptage des cellules s'effectue sur cellules de Malassez au microscope optique. La viabilité des cellules est évaluée par le test d'exclusion au bleu de Trypan. La viabilité cellulaire correspond au nombre de cellules viables / nombre de cellules totales x100.

Figure 23 : Conditions de culture et de traitement

L’isolement des cellules CD34+

correspondant au jour -3 est réalisé grâce à des billes magnétiques couplées à un anticorps anti-CD34. Après isolement, les cellules CD34+

sont cultivées pendant 3 jours en présence de 10 ng/mL d’interleukine 3 (IL-3) et de 50 ng/mL de SCF (Stem cell factor) afin qu’elles prolifèrent. Ces cellules sont capables de se différencier en cellules érythroïdes en réponse à l’Epo à 2 U/mL. Au jour +4, les cellules sont cultivées en présence de SCF et d’Epo et au jour +6 avec de l’Epo seule.

Les cellules TF-1 sont privées de GM-CSF la veille du traitement (-GM-CSF) puis cultivées pendant 3 jours en présence de 10 U/mL d’Epo afin de produire de l’Hb et d’exprimer des marqueurs érythroïdes. Les cellules K562 sont capables de se différencier après 3 jours de traitement par 10 nM d’Aclacinomycine (Acla). Le GW4869 (GW), la désipramine (Des), le PF-543 (PF), la rapamycine (Rap), les céramides C2 (C2-cer), les dihydrocéramides C2 (DH), la sphingomyélinase bactérienne (bSMase), la sphingosine-1-phosphate (S1P) et/ou le TNFα seront ajoutés à la culture au jour zéro, une heure avant l’addition de l’Epo.

Figure 23 : Conditions de culture et de traitement

L’isolement des cellules CD34+

correspondant au jour -3 est réalisé grâce à des billes magnétiques couplées à un anticorps anti-CD34. Après isolement, les cellules CD34+

sont cultivées pendant 3 jours en présence de 10 ng/mL d’interleukine 3 (IL-3) et de 50 ng/mL de SCF (Stem cell factor) afin qu’elles prolifèrent. Ces cellules sont capables de se différencier en cellules érythroïdes en réponse à l’Epo à 2 U/mL. Au jour +4, les cellules sont cultivées en présence de SCF et d’Epo et au jour +6 avec de l’Epo seule.

Les cellules TF-1 sont privées de GM-CSF la veille du traitement (-GM-CSF) puis cultivées pendant 3 jours en présence de 10 U/mL d’Epo afin de produire de l’Hb et d’exprimer des marqueurs érythroïdes. Les cellules K562 sont capables de se différencier après 3 jours de traitement par 10 nM d’Aclacinomycine (Acla). Le GW4869 (GW), la désipramine (Des), le PF-543 (PF), la rapamycine (Rap), les céramides C2 (C2-cer), les dihydrocéramides C2 (DH), la sphingomyélinase bactérienne (bSMase), la sphingosine-1-phosphate (S1P) et/ou le TNFα seront ajoutés à la culture au jour zéro, une heure avant l’addition de l’Epo.

Tableau 1 : Composition des milieux de culture des cellules CD34+

Tableau 1 : Composition des milieux de culture des cellules CD34+

Figure 24 : Efficacité du milieu différenciant

L’efficacité du milieu différenciant a été évaluée par une coloration de MGG après 9 jours de culture des CSPH CD34+

. Les différents stades de l’érythropoïèse sont reproduits in vitro. Le pourcentage de cellules produisant de l’Hb a été évalué aux jours indiqués par un test de coloration à la benzidine.

Pro-E : Pro-érythroblaste, E. Baso. : érythroblaste basophile, E. Poly : érythroblaste polychromatophile, E. Ortho : érythroblaste orthochromatophile.

Figure 24 : Efficacité du milieu différenciant

L’efficacité du milieu différenciant a été évaluée par une coloration de MGG après 9 jours de culture des CSPH CD34+

. Les différents stades de l’érythropoïèse sont reproduits in vitro. Le pourcentage de cellules produisant de l’Hb a été évalué aux jours indiqués par un test de coloration à la benzidine.

Pro-E : Pro-érythroblaste, E. Baso. : érythroblaste basophile, E. Poly : érythroblaste polychromatophile, E. Ortho : érythroblaste orthochromatophile.

3.1.2.1 Les cellules TF-1

La lignée TF-1 a été établie en 1989 à partir de cellules prélevées chez un patient atteint d’érythroleucémie (leucémie myéloïde aiguë). Elles montrent une dépendance pour de nombreuses cytokines pour leur prolifération et leur survie en culture dont le GM-CSF que nous utiliserons pour la maintenance des ces cellules à 5 ng/mL (ReliaTech, Allemagne). Le milieu de culture est renouvelé tous les trois jours et le nombre de cellules est maintenu à 3x105

/mL. La différenciation érythroïde des cellules TF-1 est induite avec 10 U/mL d’Epo (Lui et al., 2006, Buck et al., 2008) après 12h de privation en GM-CSF. Après décongélation et mise en culture, les cellules TF-1 répondent à l’Epo au bout de dix passages.

3.1.2.2 Les cellules K562

La lignée K562 a été établie à partir des cellules prélevées dans le liquide pleural d’une patiente atteinte d’une leucémie myéloïde chronique en phase blastique. Les cellules K562 expriment des marqueurs spécifiques de différenciation érythroïde comme les globines et l’EpoR, et sont capables de produire de l’Hb sous l’effet de l’aclacinomycine A (Acla) (10 nM) et de l’hémine (Trentesaux

et al., 1993, Buck et al., 2009). En revanche, elles ne répondent pas à l’Epo. Le milieu de culture est renouvelé tous les 3 jours et le nombre de cellules est maintenu à 2x105

cellules/mL.