Os cabidos perante a reforma: a capacidade de resistir

Nous avons montré que les C2-cer qui sont synthétiques et apportés de manière exogène, sont capables d’inhiber l’érythropoïèse. Pour vérifier que les céramides endogènes ont également cette capacité, nous avons provoqué la synthèse de céramides à partir de la sphingomyéline contenue dans la membrane plasmique en traitant les cellules avec la sphingomyélinase bactérienne (bSMase). Les cellules CD34+

ont été traitées avec 0,2 ; 0,5 ; 1 ; 1,5 ou 2 U/mL de bSMase puis stimulées après une heure avec 2 U/mL d’Epo pendant 4 jours. Les tests de viabilité montrent un effet cytotoxique important lorsque les cellules sont traitées à des concentrations supérieures à 0,5 U/mL (Figure 30B). Les résultats du test de coloration à la benzidine montrent que les traitements par la bSMase aux concentrations subtoxiques sont capables de diminuer le pourcentage de cellules positives à la benzidine (Figure 30A) de manière dépendante de la concentration. Ceci suggère que les céramides endogènes sont effectivement capables d’inhiber la différenciation comme observé avec les C2-cer. Comme le TNFα, la bSMase à 0,5 U/mL diminue de 50% le nombre de cellules contenant de l’Hb par rapport aux cellules traitées avec l’Epo. L’expression des globines α, β et γ

ainsi que de l’EpoR a été analysée par PCR. Les cellules CD34+

ont été traitées avec 0,5 U/mL de bSMase et 2 U/mL d’Epo pendant 4 jours. Les résultats obtenus montrent que la bSMase est capable de diminuer significativement l’expression des trois types de globines mais pas l’expression du récepteur à l’Epo (Figure 30C). Des extraits cytoplasmiques ont été réalisés sur les cellules CD34+ traitées avec 0,5 U/mL de bSMase et stimulées après une heure avec 2 U/mL d’Epo pendant 4 jours. L’expression des globines α, β et γ a été analysée par Western Blot. Les résultats obtenus montrent que la bSMase est capable de diminuer l’expression des globines α, β et γ dans les cellules CD34+ (Figure 30D). Ces résultats sont en accord avec le test de coloration à la benzidine et confirment l’impact des céramides endogènes sur la différenciation érythroïde des CSPH CD34+.

b. Dans les cellules TF-1 et K562

Les cellules TF-1 stimulées avec 2 U/mL d’Epo et les cellules K562 induites ou non par l’Acla ont été traitées avec 0,5 U/mL de bSMase pendant 3 jours. Les tests de viabilité ne montrent pas d’effet cytotoxique avec les différents traitements (Figure 31B et D). De manière similaire aux CSPH CD34+

, les tests de coloration à la benzidine montrent que les céramides générés par la bSMase sont capables de prévenir l’hémoglobinisation des cellules TF-1 (Figure 31A).Cependant, contrairement aux traitements avec les C2-cer ou le TNFα, la bSMase n’a pas d’effet sur l’induction de différenciation des cellules K562 par l’Acla. Les tests de coloration à la benzidine montrent en effet

4.2.3 Effet de la sphingomyélinase bactérienne de S. aureus sur l’érythropoïèse a. Dans les cellules CD34+

Nous avons montré que les C2-cer qui sont synthétiques et apportés de manière exogène, sont capables d’inhiber l’érythropoïèse. Pour vérifier que les céramides endogènes ont également cette capacité, nous avons provoqué la synthèse de céramides à partir de la sphingomyéline contenue dans la membrane plasmique en traitant les cellules avec la sphingomyélinase bactérienne (bSMase). Les cellules CD34+

ont été traitées avec 0,2 ; 0,5 ; 1 ; 1,5 ou 2 U/mL de bSMase puis stimulées après une heure avec 2 U/mL d’Epo pendant 4 jours. Les tests de viabilité montrent un effet cytotoxique important lorsque les cellules sont traitées à des concentrations supérieures à 0,5 U/mL (Figure 30B). Les résultats du test de coloration à la benzidine montrent que les traitements par la bSMase aux concentrations subtoxiques sont capables de diminuer le pourcentage de cellules positives à la benzidine (Figure 30A) de manière dépendante de la concentration. Ceci suggère que les céramides endogènes sont effectivement capables d’inhiber la différenciation comme observé avec les C2-cer. Comme le TNFα, la bSMase à 0,5 U/mL diminue de 50% le nombre de cellules contenant de l’Hb par rapport aux cellules traitées avec l’Epo. L’expression des globines α, β et γ

ainsi que de l’EpoR a été analysée par PCR. Les cellules CD34+

ont été traitées avec 0,5 U/mL de bSMase et 2 U/mL d’Epo pendant 4 jours. Les résultats obtenus montrent que la bSMase est capable de diminuer significativement l’expression des trois types de globines mais pas l’expression du récepteur à l’Epo (Figure 30C). Des extraits cytoplasmiques ont été réalisés sur les cellules CD34+ traitées avec 0,5 U/mL de bSMase et stimulées après une heure avec 2 U/mL d’Epo pendant 4 jours. L’expression des globines α, β et γ a été analysée par Western Blot. Les résultats obtenus montrent que la bSMase est capable de diminuer l’expression des globines α, β et γ dans les cellules CD34+ (Figure 30D). Ces résultats sont en accord avec le test de coloration à la benzidine et confirment l’impact des céramides endogènes sur la différenciation érythroïde des CSPH CD34+.

b. Dans les cellules TF-1 et K562

Les cellules TF-1 stimulées avec 2 U/mL d’Epo et les cellules K562 induites ou non par l’Acla ont été traitées avec 0,5 U/mL de bSMase pendant 3 jours. Les tests de viabilité ne montrent pas d’effet cytotoxique avec les différents traitements (Figure 31B et D). De manière similaire aux CSPH CD34+

, les tests de coloration à la benzidine montrent que les céramides générés par la bSMase sont capables de prévenir l’hémoglobinisation des cellules TF-1 (Figure 31A).Cependant, contrairement aux traitements avec les C2-cer ou le TNFα, la bSMase n’a pas d’effet sur l’induction de différenciation des cellules K562 par l’Acla. Les tests de coloration à la benzidine montrent en effet

que le pourcentage de cellules benzidine positives après traitement (A) est équivalent aux cellules cotraitées (A/bS) (Figure 31C). Ceci suggère que les céramides ne sont pas responsables de la diminution de la production d’Hb dans les cellules K562.

que le pourcentage de cellules benzidine positives après traitement (A) est équivalent aux cellules cotraitées (A/bS) (Figure 31C). Ceci suggère que les céramides ne sont pas responsables de la diminution de la production d’Hb dans les cellules K562.

Figure 30 : Effet de la sphingomyélinase bactérienne de S. aureus sur la production d'hémoglobine dans les cellules CD34+

Les cellules CD34+ stimulées par l’Epo (E) ont été traitées avec différentes concentrations de sphingomyélinase bactérienne (bS) pendant 4 jours.

A. L’effet des traitements sur la différenciation érythroïde a été évalué par un test de coloration à la benzidine.

B. La viabilité des cellules a été évaluée par un test d’exclusion au bleu de Trypan.

Les données représentent la moyenne de 3 expériences indépendantes et ont été analysées par ANOVA en mesures répétées suivi du test de Dunnet (Graphpad Prism). (* : p<0,05).

Les cellules CD34+

stimulées par l’Epo (E) ont été traitées avec 0,5 U/mL de bS pendant 4 jours.

C. Les ARN totaux ont été extraits puis l’expression des globines α, β et γ et de l’EpoR a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats ont été normalisés par rapport au gène de l’actine β et calculés par la méthode du 2-ΔΔCT

. Les données représentent la moyenne de 3 expériences indépendantes et ont été analysées par un test de Student pour échantillons appariés (Graphpad Prism). (* : p<0,05 ; ** : p<0,01).

D. L’expression des globines α, β et γ a été analysée par Western Blot à partir d’extraits cytoplasmiques de cellules CD34+

stimulées par l’Epo (E) et traitées avec 0,5 U/mL de sphingomyélinase bactérienne (bS) pendant 4 jours. L’actine β est utilisée comme contrôle interne de dépôt des échantillons. L’expression relative correspond au rapport de l’intensité de la bande correspondant à la protéine étudiée sur celle de l’actine β, le contrôle étant normalisé à un. Les résultats montrent une expérience représentative parmi 3.

Figure 30 : Effet de la sphingomyélinase bactérienne de S. aureus sur la production d'hémoglobine dans les cellules CD34+

Les cellules CD34+ stimulées par l’Epo (E) ont été traitées avec différentes concentrations de sphingomyélinase bactérienne (bS) pendant 4 jours.

A. L’effet des traitements sur la différenciation érythroïde a été évalué par un test de coloration à la benzidine.

B. La viabilité des cellules a été évaluée par un test d’exclusion au bleu de Trypan.

Les données représentent la moyenne de 3 expériences indépendantes et ont été analysées par ANOVA en mesures répétées suivi du test de Dunnet (Graphpad Prism). (* : p<0,05).

Les cellules CD34+

stimulées par l’Epo (E) ont été traitées avec 0,5 U/mL de bS pendant 4 jours.

C. Les ARN totaux ont été extraits puis l’expression des globines α, β et γ et de l’EpoR a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats ont été normalisés par rapport au gène de l’actine β et calculés par la méthode du 2-ΔΔCT

. Les données représentent la moyenne de 3 expériences indépendantes et ont été analysées par un test de Student pour échantillons appariés (Graphpad Prism). (* : p<0,05 ; ** : p<0,01).

D. L’expression des globines α, β et γ a été analysée par Western Blot à partir d’extraits cytoplasmiques de cellules CD34+

stimulées par l’Epo (E) et traitées avec 0,5 U/mL de sphingomyélinase bactérienne (bS) pendant 4 jours. L’actine β est utilisée comme contrôle interne de dépôt des échantillons. L’expression relative correspond au rapport de l’intensité de la bande correspondant à la protéine étudiée sur celle de l’actine β, le contrôle étant normalisé à un. Les résultats montrent une expérience représentative parmi 3.

Figure 31 : Effet de la sphingomyélinase bactérienne de S. Aureus sur la formation d'hémoglobine dans les cellules TF-1 et K562

Les cellules TF-1 stimulées par l’Epo (E) et les cellules K562 induites par l’Acla (A) ont été traitées avec 0,5 U/mL de SMase bactérienne (bS) pendant 3 jours.

A, C. L’effet des traitements sur la différenciation érythroïde a été évalué par un test de coloration à la benzidine.

B, D La viabilité des cellules a été évaluée par un test d’exclusion au bleu de Trypan.

Les données représentent la moyenne de 3 expériences indépendantes et ont été analysées par ANOVA en mesures répétées suivi du test de Dunnet (Graphpad Prism) (*,$

: p<0,01). Les * correspondent à une différence significative par rapport au contrôle et les $ par rapport au point Acla.

Figure 31 : Effet de la sphingomyélinase bactérienne de S. Aureus sur la formation d'hémoglobine dans les cellules TF-1 et K562

Les cellules TF-1 stimulées par l’Epo (E) et les cellules K562 induites par l’Acla (A) ont été traitées avec 0,5 U/mL de SMase bactérienne (bS) pendant 3 jours.

A, C. L’effet des traitements sur la différenciation érythroïde a été évalué par un test de coloration à la benzidine.

B, D La viabilité des cellules a été évaluée par un test d’exclusion au bleu de Trypan.

Les données représentent la moyenne de 3 expériences indépendantes et ont été analysées par ANOVA en mesures répétées suivi du test de Dunnet (Graphpad Prism) (*,$

: p<0,01). Les * correspondent à une différence significative par rapport au contrôle et les $ par rapport au point Acla.