5. Discussão de Resultados
5.3 Género Bacillus
O género Bacillus consiste num grupo heterogéneo de organismos Gram positivos de largas dimensões (1×3-5 μm), formadores de esporos, normalmente catalase positivos, com forma de bastão e anaeróbios facultativos (apêndice 3) amplamente distribuídos na natureza, sendo estas características as que distinguem o género Bacillus dos restantes géneros de bactérias formadoras de endosporos, ou seja dos géneros Sporolactobacillus,
Clostridium, Sporosarcina e Thermoactinomycetes, de acordo com a 1.º edição
do Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Todar, 2005).
Tabela 13 – Isolamento de Bacillus spp. em diferentes alimentos
Alimento N.º de amostras N.º de amostras positivas
Mel 70 27
Farinha de centeio 14 14 Farinha de trigo 15 15 Anchovas frescas 100 0
Especiarias 30 30
Algumas das suas estirpes são patogénicos oportunistas ou obrigatórios de animais (afectando o Homem entre outros mamíferos) e insectos. Devido a sua capacidade de formar esporos, estas bactérias podem tolerar melhor as condições adversas relativamente a outros agentes enteropatogénicos. Assim, podem proliferar numa multiplicidade de ambientes, incluindo água e alimentos
Adaptado de Iurlina et al. Prevalence of Bacillus spp. in different food products collected in Argentina.
processados ou por processar (englobando produtos lácteos, cárneos, alimentos infantis, vegetais, especiarias, etc.), podendo atingir valores na ordem dos 38% de incidência em produtos alimentares (Ferreira & Sousa, 2000a; From et al, 2005; Murray et al, 2003).
Esta presença de Bacillus spp. aparenta ser independente da natureza dos géneros alimentícios. Contudo, de acordo com o estudo efectuado por Iurlina ocorre uma frequência de 100% do género Bacillus, em alimentos com um reduzido teor de água, como se verifica na tabela 13 (Iurlina et al, 2006).
Apesar de a produção de endosporos resistentes na presença de O2 permanecer uma característica intrínseca do género Bacillus, esta descrição teve de comportar um reajuste aquando da descoberta do Bacillus infernus, que é estritamente anaeróbico (Murray et al, 2003).
Com a excepção do B. anthracis e do B. cereus, as outras espécies de bacilos são geralmente percepcionadas como inconsequentes e de significado clínico reduzido. No entanto, certas estirpes de B. subtilis, B. pumilus, B. thuringiensis e B. licheniformis foram associadas a toxi-infecções alimentares (From et al, 2005; Rowan et al, 2001; Rowan et al, 2003).
Como contra-ponto, algumas das estirpes revelam-se de extrema importância clínica, por exemplo na produção de antibióticos (baseados no B. licheniformis,
B. subtilis ou Paenibacillus polymyxa entre outros), na geração de vitaminas
(com o B. megaterium a originar as vitaminas B2 e B12, ou a biotina e riboflavina com origem no B. subtilis), entre outras aplicações científicas e técnicas de elevado potencial comercial (Mikkola, 2006; Murray et al, 2003; Timmusk et al, 2005).
Várias estirpes do género Bacillus produzem compostos tóxicos, que quando combinados, em determinadas situações, actuam de uma forma sinérgica tornando-se mais eficazes. Estes efeitos sinérgicos das toxinas do género
Bacillus (entre a mesma estirpe ou estirpes diferentes) devem ser tomados em
A penetração passiva, tal como o potencial para bioacumulação nos tecidos de qualquer substância através da membrana plasmática, encontra-se dependente da capacidade hidrofóbica dessa mesma substância. Assim, a exposição prolongada a uma toxina hidrofóbica presente numa concentração insuficiente para induzir o seu efeito nefasto, poderá originar que essas mesmas toxinas sejam libertadas dos tecidos onde se encontram armazenadas sob determinadas condições. Porém, os metabolitos dessas mesmas toxinas são normalmente compostos mais polares, e consequentemente menos hidrofóbicos, perdendo assim a sua capacidade de acumulação nos tecidos e células de origem animal, tornando-se assim evidente a sua toxicidade ambiental (Mikkola, 2006).
Os resultados obtidos por Mikkola indiciam que as toxinas originadas por membros do género Bacillus, causam uma disrupção na homeostase dos iões celulares e danos na própria membrana plasmática, originando uma saída do conteúdo celular (Mikkola, 2006).
As bactérias formadoras de esporos são importantes na indústria alimentar por vários motivos, sendo os que se seguem os principais (Prescott et al, 1996b; Scheldeman et al, 2006):
• Os processos de pasteurização habituais, ainda que adequados para inactivar as células vegetativas, falham na eliminação dos esporos. Assim sendo, os esporos sobreviventes, não tendo nenhuma competição (ou bastante limitada), das células vegetativas irão germinar e proliferar rapidamente.
• Por último, existe uma preocupação crescente sobre o aumento da tolerância/resistência de certas estirpes de esporos ou células vegetativas a determinadas condições ou tratamentos, geralmente associados à paragem do crescimento (pH e temperaturas reduzidas), ou inclusivamente à inactivação de todo o material biológico presente (esterilização ou UHT). Estes “novos” bacilos, poderão ter sido seleccionadas pelo recurso a novos ingredientes e tecnologias de processamento e embalamento.
• A natureza ubíqua destes MOS torna virtualmente impossível prevenir a sua presença na matéria-prima ou ingredientes.
• Outro motivo de preocupação deve-se às características adesivas de alguns esporos, que irão facilitar a sua adesão à superfície de máquinas e equipamentos, originando a formação de biofilmes.
Na indústria alimentar, as situações anómalas com a sua origem no género
Bacillus, possuem basicamente duas origens. A primeira e motivo de
preocupação crescente, é a presença do B. cereus. A segunda deve-se aos danos causados aos géneros alimentícios pelos esporos, durante as várias etapas de produção, armazenamento e distribuição (Scheldeman et al, 2006). O apêndice 4 expõe algumas das características destas situações anómalas.
1.5.3.1 Bacillus cereus
O B. cereus é um patogénico alimentar, que foi isolado pela primeira vez em 1887. É um MO Gram positivo, formador de esporos, móbil com capacidade de crescer num meio em anaerobiose, não se encontrando ainda totalmente caracterizado a nível metabólico. É de referir que o B. cereus, B. thuringiensis,
B. anthracis e B. mycoides são profundamente relacionados, podendo estas
últimas três espécies ser consideradas subespécies do B. cereus. Todas elas apresentam células com dimensões superiores a 0.9 μm, produzindo um esporo cilíndrico ou elíptico de posição central a terminal (Doyle et al, 2001b; Rosenfeld et al, 2005).
O B. cereus encontra-se bastante disperso na natureza, sendo frequentemente isolado do solo e de plantas. A partir deste meio ambiente é facilmente disperso para os géneros alimentícios, nomeadamente aqueles de origem vegetal. Porém, através da contaminação cruzada, o B. cereus possui a capacidade de atingir outros alimentos, onde se englobam o arroz, farináceos, carne, leite, molhos e sobremesas (Doyle et al, 2001b; Ferreira & Sousa, 2000a; Grande et al, 2006; Opstal et al, 2004).
Contudo, permanece a questão de porque é que outros alimentos, especialmente vegetais e saladas não se encontram associados com a doença emética. Uma das possibilidades em discussão, é a de que apesar do B.
cereus ser uma presença comum no ambiente, as estirpes eméticas poderão
ser mais restritas na sua distribuição (Altayar & Sutherland, 2006).
A origem dos problemas relacionados com os produtos lácteos e o B. cereus deve-se à sua dispersão a partir do solo e ervas para os úberes das vacas e daí para o leite crú. Através da esporulação, os esporos do B. cereus sobrevivem à pasteurização e após a sua germinação, as células encontram-se isentas da competição das outras células vegetativas (Doyle et al, 2001b; Forsythe, 2002b).
É comummente encontrado em níveis reduzidos nos alimentos (< 102 UFC/g), os quais são considerados aceitáveis. Porém, as intoxicações alimentares tem a sua origem quando um alimento é sujeito a desvios do binómio tempo/temperatura, proporcionando que um nível reduzido de organismos se multiplique até níveis significativos (> 105 UFC/g) (Doyle et al, 2001b; Forsythe, 2002b).
O B. cereus é considerado a principal origem de toxi-infecções alimentares com origem no género Bacillus, devido à sua capacidade de produzir enterotoxinas e toxinas eméticas (From et al, 2005).
O B. cereus origina assim 2 tipos diferentes de toxi-infecções alimentares: a doença diarreica, reconhecida pela primeira vez após um surto num hospital, em Oslo, Noruega em 1948. A doença emética, foi descrita 20 anos depois após vários surtos em Londres, sendo que ambas as doenças são auto- limitantes e a recuperação ocorre num período de 24 horas (Doyle et al, 2001b; Forsythe, 2002b).
A doença emética, é originada pela ingestão de uma toxina resistente ao calor pré-formada no alimento. A toxina emética é um péptido de baixo peso
molecular (< 10.000 Da), estável ao aquecimento (126ºC, por 90 minutos), a pH extremos (valores situados entre 2 e 11) e resistente à tripsina. Esta toxina é elaborada durante a fase estacionária do crescimento, não se sabendo actualmente se a sua produção se encontra ligada à formação de esporos. Os sintomas desta toxi-infecção alimentar caracterizam-se por náuseas, vómitos, dores abdominais e possível diarreia. As estirpes que provocam este efeito tem um período de incubação de 1 a 6 horas, com uma duração média de 9 horas. Os sintomas deste tipo de toxi-infecção alimentar são semelhantes aos causados pelo St. Aureus (Duc et al, 2005; Ferreira & Sousa, 2000a; Forsythe, 2002b).
A toxina emética é considerada a mais funesta das toxinas do B. cereus, devido à existência de um histórico de falhas hepáticas fulminantes (Duc et al, 2005; Forsythe, 2002b).
A doença diarreica, é provocado por algumas estirpes devido à elaboração de uma toxina termo-lábil, produzida pelo B. cereus durante o seu crescimento no intestino delgado do Homem (Forsythe, 2002c).
Estudos das sequências genéticas revelaram que o B. cereus produz pelo menos dois tipos diferentes de enterotoxinas, com um elevado peso molecular que varia entre os 38 a 48 kDa. Duas dessas enterotoxinas encontram-se envolvidas em toxi-infecções alimentares (sendo uma delas a hemolisina), compreendendo três subunidades proteicas diferentes. A terceira enterotoxina é uma unidade proteica simples, não relacionada com toxi-infecções alimentares (Forsythe, 2002c; Rowan et al, 2003).
Estas enterotoxinas são inactivadas a 56ºC e são susceptíveis à tripsina. Os sintomas manifestam-se por uma diarreia aquosa, dores abdominais, náuseas e ainda que raramente vómitos, com um período de incubação de 6 a 24 horas, podendo os sintomas persistir por um período de 24 horas, altura em que o MO é excretado em elevadas quantidades (Ferreira & Sousa, 2000a; Forsythe, 2002b).
O mecanismo de acção da enterotoxina é semelhante ao das toxinas termo- lábil da E. coli (estirpes ETEC) e Vibrio cholerae, sendo evidente que vai estimular o sistema adenilciclase/AMPc, provocando uma diminuição da absorção de electrólitos no intestino e promovendo a excreção de electrólitos do enterócito para o lúmen intestinal (figura 5). Assim, a enterotoxina altera a permeabilidade vascular da pele e conduz, experimentalmente, à acumulação de fluidos no intestino do coelho, sendo letal para o rato. Os sintomas desta enfermidade são similares aos causados pelo Clostridium perfringens (Doyle et
al, 2001b; Ferreira & Sousa, 2000a; Forsythe, 2002b; Rowan et al, 2003).
A produção de lecitinase, bem como outras fosfolipases, proteases e enterotoxinas são reconhecidas como o factor virulento requerido pelos MOS patogénicos invasivos provocarem infecções sistémicas (Rowan et al, 2001). O tipo de doença dominante induzida pelo B. cereus difere de nação para nação. No Japão, a doença emética possui uma frequência 10 vezes superior à do tipo diarreico, enquanto na Europa e América do Norte, a doença diarreica possui uma frequência superior. Esta variação é atribuída às diferenças dos hábitos alimentares entre os vários países (Doyle et al, 2001b).
Outra característica evidente é a capacidade de algumas estirpes de B. cereus em produzir os dois tipos de toxinas (Doyle et al, 2001b; From et al, 2005). Relevante é também a mutação ocorrida em determinadas estirpes do B.
cereus, que se tornaram psicotróficas ao longo dos anos, tornando assim
possível o seu crescimento a temperaturas tão baixas quanto 4-6ºC, mantendo simultaneamente a sua capacidade de produzir toxinas (Finlay et al, 2000; Iurlina et al, 2006).
É de realçar, contudo, que foi atribuído ao B. thuringiensis, a capacidade de produzir enterotoxinas, passíveis de causar toxi-infecções alimentares em voluntários humanos. Esta característica poderá originar um problema grave, uma vez que a aplicação deste MO com a função de protecção de colheitas contra insectos, está a tornar-se de uso comum em vários países, encontrando-
se já reportado na literatura científica um surto com origem no B. thuringiensis (Doyle et al, 2001b).
Uma vez que o leite não é considerado a principal fonte de contaminação pelo
B. anthracis, encontram-se disponíveis poucos estudos sobre a resistência
térmica dos esporos do B. anthracis no leite. Contudo, um estudo recente concluiu que, sob condições de pasteurização normais, estas tinham um reduzido efeito na viabilidade dos esporos do B. anthracis, mas um tratamento UHT (120ºC durante 6 a 10 segundos) poderá inactivar os esporos (Xu et al, 2006).
1.5.3.2 Bacillus licheniformis
O B. licheniformis é um organismo Gram positivo, formador de endosporos, que pode ser isolado a partir do solo ou plantas em qualquer local a nível mundial, sendo comum a sua presença em géneros alimentícios. De uma forma geral é considerado como um agente inócuo (Mikkola et al, 2000; Veith et al, 2004).
Tabela 14 – Origem de isolados de B. licheniformis
Origem País Sintomas N.º de afectados UFC/ g
Gelado Reino Unido DE, V, D 2
Tandori‡ Reino Unido
Molho de salada‡ Reino Unido N, DA, D 6
Arroz de caril‡ Reino Unido V 1 1.1 × 106
Pudim de baunilha (reconstituído)‡
Finlândia DE, V, D 111 (1 fatal)
Alimento para Lcs (fórmula)‡ Finlândia 1 (1 fatal) Alimento para Lcs (fórmula)‡ Finlândia 1 (1 fatal) ‡
Mais de uma estirpe de Bacillus spp. presentes no alimento
Abreviaturas: DE, dores de estômago; V, vómitos; D, diarreia; N, náuseas, DA, dores abdominais.
Adaptado de Salkinoja-Salonen et al. Toxigenic strains of Bacillus licheniformis related to food poisoning.
Porém, o grupo subtilis, que compreende o B. licheniformis, B. subtilis e B.
pumilus, encontra-se associado a uma variedade de condições clínicas,
degradação de géneros alimentícios e toxi-infecções alimentares. O B.
licheniformis também se encontra associado a situações de septicemia,
peritonite, mortalidade infantil e toxi-infecções alimentares, sendo um contaminante comum dos produtos lácteos (Lindsay et al, 2000; MIkkola et al, 2000; Salkinoja-Salonen et al, 1999).
A maioria das toxi-infecções alimentares atribuídas ao género Bacillus, está associado ao B. cereus. Contudo, a relevância do grupo subtilis como organismos passíveis de causar toxi-infecções alimentares através da produção de toxinas eméticas ou enterotoxinas, encontra-se em ascensão (From et al, 2005; Salkinoja-Salonen et al, 1999).
Actualmente é de convicção geral que as enterotoxinas produzidas por Bacillus spp., são proteínas transcritas de genes similares aos das enterotoxinas do B.
cereus, devendo a temperatura óptima para a produção da toxina emética pelo
B. licheniformis, situar-se próximo dos 28º C (From et al, 2005; Salkinoja-
Salonen et al, 1999).
Em última instância, as estirpes do género Bacillus com capacidade para produzir toxinas, raramente se encontram presentes em amostras de água, alimentos e de complexos industriais. Adicionalmente, nenhuma das toxinas detectadas é semelhante à das enterotoxinas produzidas pelo B. cereus (From
et al, 2005).
Numa investigação conduzida por Lindsay, a citotoxicidade demonstrada pelo
B. licheniformis e B. pumilus, foi eliminada após aquecimento a 121ºC, durante
15 minutos. Estes efeitos são semelhantes aos exibidos pela toxina diarreica produzida por determinadas estirpes de B. cereus. Porém, estes resultados contrastam com os dados obtidos noutro ensaio, o qual demonstrava que os compostos citotóxicos elaborados por determinadas estirpes de B. licheniformis isoladas de alimentos envolvidos em toxi-infecções alimentares (leite crú e
alimentos para Lcs), possuíam uma resistência ao aquecimento (Lindsay et al, 2000; Salkinoja-Salonen et al, 1999).
Atendendo a que o B. licheniformis é um organismo formador de esporos e passível de sobreviver a todo o processamento industrial do leite (incluindo o processo de produção do leite em pó), estes factos evidenciam uma possível rota de infecção (Lindsay et al, 2000; Salkinoja-Salonen et al, 1999).
Assim, ainda que apesar de raras, várias estirpes de Bacillus spp. podem encontrar-se envolvidas em toxi-infecções alimentares através de géneros alimentícios considerados como seguros pelo público, como pizas ou pratos de massa, entre outros (From et al, 2005).
1.5.4 Outros microrganismos
Infecções com origem no Staphylococcus aureus e fórmulas adaptadas em pó para Lcs, foram relatadas em pelo menos uma situação (Umoh et al, 1985). De acordo com a literatura, não existem casos confirmados de Clostridium
botulinum como foco de infecção e fórmulas adaptadas em pó para Lcs.
Contudo, em 2001 no Reino Unido foi diagnosticado botulismo numa Lc de 5 meses de idade. Das cinco embalagens de leite adaptado ainda presentes em casa, uma revelou-se positiva para o C. botulinum tipo B. Todavia, não foi estabelecida nenhuma ligação entre o isolado na Lc e o isolado no leite adaptado (Brett et al, 2005; EFSA, 2004).
Ocasionalmente, ocorre a presença da aflatoxina M1 em leites em pó. A
quantidade da aflatoxina presente no leite fluído é reduzida durante o processo de desidratação, mas uma percentagem significativa sobrevive aos tratamentos permanecendo por largos períodos de tempo no produto final. A estabilidade de outras micotoxinas em produtos lácteos em pó ainda não foi investigada (EFSA, 2004).
2. Objectivos
Havendo conhecimento dos potenciais efeitos dos vários agentes patogénicos com significado em termos de saúde pública, nomeadamente em prematuros, recém-nascidos de baixo peso, imunocomprometidos e Lcs de uma forma geral, reveste-se de todo o interesse, o desenvolvimento de um estudo com o objectivo de avaliar a flora microbiana e possíveis agentes patogénicos em produtos lácteos em pó para recém-nascidos e Lcs a nível nacional.
Desta forma, o presente trabalho teve como objectivos gerais os seguintes itens:
1. Estimativa da flora microbiana patente em produtos alimentares em pó (avaliação centrada nas fórmulas e não nos produtos reconstituídos) e prontos a consumir destinados a recém-nascidos e Lcs (até um ano), independentemente da sua constituição e função, disponíveis no mercado nacional.
2. Comparação das várias gamas de produtos para alimentação infantil, pertencentes à mesma marca, de acordo com o perfil microbiano determinado.
3. Comparação entre marcas, acerca do conteúdo microbiano presente no seu portfólio comercial.
4. Avaliação da ocorrência da E. sakazakii, Salmonella spp. e outros agentes patogénicos presentes nos vários alimentos para recém- nascidos e Lcs disponíveis em Portugal Continental.
Como objectivos específicos, averiguaram-se os seguintes pontos:
1. Eventual caracterização das várias estirpes de E. sakazakii e Salmonella spp. presentes na gama de produtos analisados.
2. Avaliação de uma possível predominância de determinada estirpe em Portugal Continental.
3. M
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O critério de selecção foi baseado nas amostras disponibilizadas por cada uma das marcas, após pedido feito às mesmas, e com pleno conhecimento dos objectivos propostos nesta dissertação.
As amostras cedidas contemplavam leites hipoalergénicos, anti-regurgitação, anti-cólicas, anti-obstipação, adaptados, de transição e adequados a prematuros ou recém-nascidos de baixo peso.
Após, a aferição dos métodos laboratoriais inicialmente propostos usando as amostras disponibilizadas, procedeu-se à aquisição de produtos idênticos no mercado nacional. Durante esta fase que decorreu entre 15/07/06 e 17/07/06 as várias amostras foram obtidas, de acordo com a sua disponibilidade, em superfícies comerciais ou a nível farmacêutico, no distrito de Setúbal. Após a sua aquisição foram transportadas (em menos de uma hora) para o Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa.
Foram analisados um total de 4 tipos de produtos da Nestlé®, 5 produtos da NeoFarmacêutica® e 4 produtos com origem na Milte®. Para cada produto, independentemente da sua origem, foi analisado um lote, originando um plano de amostragem que engloba um total de 13 lotes (apêndice 5).
De todos os produtos disponibilizados por cada entidade, foi seleccionado para cada marca, o alimento para Lcs com maior procura a nível nacional, de acordo com informações obtidas a nível do comércio a retalho e farmacêutico. Para estes produtos foram então realizadas todas as análises laboratoriais descriminadas na tabela 15.
Relativamente aos alimentos para Lcs remanescentes de cada marca, foram verificados exclusivamente os níveis de MAT e a presença ou ausência de membros da família Enterobacteriaceae.
O número de amostras necessárias por cada lote oscilou entre as 30 nos alimentos para Lcs com maior expressão comercial de cada marca e as 10
amostras para os restantes produtos dessa marca (apêndice 5). O período de análise destas amostras decorreu entre 19/07/06 e 05/09/06.
Analisou-se um total de 190 amostras, repartidas da seguinte forma: 30 amostras de leite hipoalergénico, 20 amostras de leite anti-regurgitação, 10 amostras de leite anti-cólicas, 10 amostras de leite anti-obstipação, 10 amostras de leite para prematuros, 10 amostras de leite de transição e 100 amostras de leites adaptados.
Em adição aos produtos supracitados, a Milte® cedeu igualmente vários probióticos (apêndice 6).
Para a avaliação do conteúdo microbiano destes produtos, foram aplicados os procedimentos de pesquisa indicados na Farmacopeia Portuguesa para medicamentos com base em plantas, exclusivamente compostos por uma ou