Gama de Trabalho e Linearidade

Dada a elevada disparidade de valores registados em intoxicações fatais apresentados na Tabela 2, chegando a atingir mais de três ordens de grandeza entre o valor mais baixo e o mais alto, na definição da gama de trabalho foi inicialmente escolhido um intervalo entre 50 e 5000 ng/mL para todos os inseticidas. Assim, uma vez que se pretendia implementar o método na rotina do laboratório, assegurou-se que os valores mais baixos registados estavam inseridos na gama de trabalho. Nos casos em que o inseticida se encontrasse em concentrações acima do limite superior da gama de trabalho a conclusão sobre qual o agente responsável pela morte não seria afetada, podendo ser suficiente para a conclusão do processo médico-legal a observação de que determinado inseticida se encontra presente numa concentração superior a um determinado limite, definido com base em valores fatais conhecidos e registados. Há ainda a acrescentar que a determinação forense da presença destes pesticidas é realizada por indicação do médico patologista após a autópsia, em que o médico pode detetar a cor ou o odor característico de alguns pesticidas, quando estes se encontram no conteúdo gástrico [44, 70].

Uma vez escolhida a gama de trabalho foi utilizado o “método dos mínimos

quadrados” para estimar os parâmetros de um modelo por regressão linear simples, em que

de acordo com os critérios internos do STF-N é aceite um valor absoluto do coeficiente de correlação ( ) superior a 0,99 para um intervalo de confiança de 95% [138]. Contudo, valores de muito próximos da unidade não significam que o melhor modelo é o linear simples [155], uma vez que na regressão pelo método dos mínimos quadrados, a redução de resíduos nas concentrações mais elevadas tem mais impacto na minimização da soma

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dos quadrados. Consequentemente, as concentrações muito pequenas são negligenciadas. Deste modo, um pré-requisito para a realização de regressão linear simples é o emprego de uma gama de concentrações que apresentem variabilidade comparável, também denominada por homogeneidade de variâncias ou homocedasticidade [137]. O Guia RELACRE 13 [144], em linha com a norma ISO 8466-1 [156], propõe a realização do teste estatístico para a verificação da homocedasticidade entre o primeiro e o último nível da curva de calibração [138]:

ou

(tal que ) _{(equação 1)}

em que e correspondem aos valores de variância nos limites inferior e superior da gama, respetivamente. Posteriormente é realizada a comparação dos valores obtidos com o valor tabelado da distribuição F de Snedecor / Fisher ( ).

Se , as diferenças de variâncias não são significativas e a gama de trabalho está bem ajustada. Nas situações em que as diferenças entre as

variâncias são significativas e a gama de trabalho deve ser reduzida até que tal deixe de se verificar. Na Tabela 13 encontram-se os valores obtidos no estudo da homocedasticidade. Como referido anteriormente, na determinação por GC-ECD o fentião não foi considerado e a gama de calibração do pirimifos-metilo foi encurtada para 500-5000 ng/mL, devido à baixa sensibilidade do detetor, sendo que o primeiro não foi detetado no cromatograma em amostras fortificadas a 5000 ng/mL e o segundo a 50 ng/mL.

Tabela 13 – Valores de variância e do teste PG obtidos no estudo da homocedasticidade

GC-ECD GC-MS Inseticidas PG PG Clorfenvinfos 3,35x10-6 7,80x10-2 23285,36 3,06x10-7 1,98x10-2 64732,91 Clorpirifos 2,84x10-6 5,06x10-2 17821,80 2,63x10-7 5,66x10-3 21504,95 Diazinão 1,65x10-7 7,01x10-4 4242,90 3,17x10-7 8,27x10-3 26063,62 Dimetoato 4,01x10-7 1,54x10-2 38323,00 4,47x10-7 1,68x10-2 37686,66 Fentião n/a n/a n/a 2,04x10-6 4,36x10-2 21357,13 Fosalona 4,22x10-6 6,87x10-2 16293,82 3,09x10-6 2,65x10-2 85687,83 Malatião 4,60x10-7 7,30x10-3 15862,24 5,01x10-7 1,32x10-2 26417,26 Paratião 2,77x10-6 1,58x10-2 5689,69 8,38x10-8 6,99x10-3 83376,13 Pirimifos-metilo 2,07x10-7 5,45x10-5 263,07 8,37x10-7 2,40x10-2 28627,10 Quinalfos 1,22x10-8 2,67x10-4 21936,95 4,47x10-7 1,25x10-2 28053,62

n/a – não aplicável, porque o detetor não é sensível para a gama em estudo

Nota: as gamas de trabalho em estudo estavam compreendidas entre 50 e 5000 ng/mL para todos os compostos, exceto para o pirimifos-metilo por GC-ECD, entre 500 e 5000 ng/mL.

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Os resultados obtidos com 10 réplicas (Tabela 13) mostraram que as variâncias eram significativamente diferentes, [157] (9 graus de liberdade no denominador e no numerador). Foram então estudadas gamas de trabalho mais estreitas e as variâncias foram também significativamente diferentes (dados apresentados em Anexo B). Assim, numa situação de heterocedasticidade, vários autores propõem a utilização de diferentes modelos de regressão para ultrapassar esta dificuldade, tais como regressão linear ponderada, regressão polinomial ou a transformação [33, 155, 158]. O princípio da regressão linear ponderada consiste na atribuição de maior importância aos pontos experimentais com menor variância, normalmente os pontos no limite inferior da gama de trabalho. Este modelo é aplicado numa situação em que o coeficiente de variação é constante ao longo da gama, isto é, o desvio-padrão aumenta proporcionalmente com a concentração. Uma vez que os coeficientes de variação de AA/API nos limites inferior e

superior (CVinf e CVsup, respetivamente) das gamas de trabalho são muito próximos

(Tabela 14), considerou-se que o sejam também ao longo da gama e, por isso, foi realizada a regressão linear ponderada.

Tabela 14 – Valores dos coeficientes de variação de AA/API nos limites da gama de trabalho

Inseticidas

GC-ECD GC-MS

CVinf (%) CVsup (%) CVinf (%) CVsup (%) Clorfenvinfos 5,86 7,51 5,10 7,17 Clorpirifos 4,26 6,80 5,42 6,78 Diazinão 9,21 7,34 6,03 8,25 Dimetoato 9,84 7,84 6,72 7,68

Fentião n/a n/a 8,30 7,39

Fosalona 9,29 6,05 4,16 7,30 Malatião 7,50 7,11 6,71 7,26 Paratião 8,75 7,24 6,12 9,16 Pirimifos-metilo 9,83 9,18 9,80 9,40 Quinalfos 8,97 7,93 5,94 6,60

n/a – não aplicável, porque o detetor não é sensível para a gama em estudo

Se o erro relativo médio aumentar ou diminuir ao longo da gama de trabalho o conjunto de dados poderá ajustar-se melhor a um modelo não-linear, em que o mais simples é o modelo quadrático. A aplicação de modelos mais complexos é encarada com cautela pois é pretendido que em métodos analíticos o sinal varie linearmente com a concentração do analito.

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Os fatores de ponderação, wi, mais comuns , , √ , , e √ ,

são usados para determinar os parâmetros das curvas de calibração a partir das equações [158, 159]: ∑ ∑ ∑ ∑ ∑ ∑ (∑ ) (equação 2) ∑ ∑ ∑ ∑ ∑ ∑ (∑ ) (equação 3) ∑ ∑ ∑ ∑ √∑ ∑ (∑ ) √∑ ∑ (∑ ) (equação 4)

em que wi é o fator de ponderação escolhido e ( , ) é o par de dados, onde é a

concentração e o valor da razão entre as áreas do analito e do padrão interno, AA/API.

Estes parâmetros da regressão linear podem ser estimados a partir de equações adaptadas destas, em que é removido o fator de ponderação wi de todos os somatórios e ∑ é

substituído por (número de níveis estudados) [158, 159].

Uma vez estimados os parâmetros da curva (Anexo C) com os diferentes fatores de ponderação acima apresentados, foi determinada a concentração ( ) para os diferentes

valores de , e para cada fator de ponderação, assim como a soma dos erros relativos percentuais, ∑( ), para escolher qual o melhor fator. O erro relativo percentual compara a concentração determinada ( ) por regressão linear ponderada com aquela que era esperada, a concentração nominal ( ):

(equação 5)

O modelo que apresentar a menor soma de é o escolhido. Na Tabela 15 são apresentados os valores encontrados das somas dos erros relativos percentuais para os diferentes fatores de ponderação estudados para cada composto, quer por GC-ECD, quer por GC-MS-SIM.

De acordo com os resultados obtidos, a menor soma de erros relativos foi apresentada pela regressão linear com o fator de ponderação para praticamente todos os compostos, na análise por GC-ECD e por GC-MS-SIM. A exceção foi o pirimifos-

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metilo, em GC-ECD com a gama mais curta, para o qual a menor soma dos erros relativos percentuais correspondeu ao uso do fator . Neste caso, com o fator obteve-se a segunda menor soma. No trabalho de Raposo et al. [33] o fator de ponderação foi o escolhido para 6 dos 8 inseticidas estudados, em linha com os resultados aqui apresentados. Também de acordo com Almeida et al. [158] na maioria dos métodos em que o desvio-padrão varia proporcionalmente com a concentração o fator de ponderação escolhido é . A regressão linear simples foi a que apresentou a maior acumulação de erros relativos, o que reforça a necessidade de empregar fatores de ponderação aquando da preparação de curvas de calibração. Fruto da menor relevância dada às concentrações mais baixas na regressão linear simples, o maior contributo para a ∑( ) advém destas. Assim, a calibração linear ponderada permite a utilização de gamas de trabalho maiores com um grau de fidelidade superior relativamente à calibração linear simples [158].

Tabela 15 – Valores das somas dos erros relativos percentuais obtidos com os vários fatores de ponderação √ √ GC-ECD Clorfenvinfos 234,82 67,53 55,97 119,45 67,71 69,06 119,69 (%) Clorpirifos 215,97 75,76 57,70 126,54 81,49 63,04 132,82 Diazinão 75,63 78,41 67,74 97,22 84,74 81,74 106,08 Dimetoato 246,59 76,53 68,38 126,92 76,41 89,12 121,59 Fosalona 732,34 190,46 142,64 365,70 182,25 190,15 344,77 Malatião 497,42 147,25 119,78 271,66 150,83 175,71 274,01 Paratião 271,08 86,01 67,27 150,53 92,08 80,65 158,18 Pirimifos-metilo 34,35 31,25 27,99 32,81 30,42 26,93 32,35 Quinalfos 371,26 108,76 89,40 198,98 104,17 115,32 192,59 ∑(∑( )) 2228,67 718,66 583,19 1243,83 720,89 759,62 1229,58 GC-MS Clorfenvinfos 498,82 152,60 128,95 278,80 151,32 197,08 269,79 (%) Clorpirifos 443,82 114,28 88,36 223,89 120,65 100,37 228,98 Diazinão 298,73 127,21 108,70 197,61 135,86 133,49 205,70 Dimetoato 360,01 131,96 114,00 220,59 130,59 162,96 214,00 Fentião 569,42 164,12 136,42 306,72 162,64 186,38 298,64 Fosalona 563,52 179,00 147,52 320,54 180,55 202,10 315,11 Malatião 612,41 167,06 127,60 299,95 165,28 198,43 296,17 Paratião 297,61 98,24 89,89 172,03 99,34 129,65 168,91 Pirimifos-metilo 130,51 71,58 65,81 96,89 72,63 81,10 99,59 Quinalfos 550,98 157,32 131,17 297,64 159,04 204,26 295,26 ∑(∑( )) 4325,83 1363,38 1138,43 2414,67 1377,89 1595,81 2392,15

Nota: as gamas de trabalho em estudo estavam compreendidas entre 50 e 5000 ng/mL para todos os compostos, exceto para o pirimifos-metilo por GC-ECD, 500 e 5000 ng/mL.

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Dado que o fator de ponderação apresentou a menor soma dos para quase todos os IOFs refletiu-se no somatório global dos erros, ∑(∑( )) (Tabela 15), para os dois conjuntos de pesticidas e, por isso, foi selecionado nas fases seguintes deste trabalho para todos os inseticidas.

4.4.3 Limiares Analíticos