Seletividade e Confirmação da Identidade

Num contexto laboratorial, a avaliação da seletividade é realizada pela comparação entre os resultados obtidos na análise de amostras brancas não fortificadas das matrizes pretendidas com aqueles obtidos através da análise de amostras das mesmas matrizes fortificadas com os analitos a determinar, com o objetivo de identificar eventuais sinais interferentes que, de algum modo, condicionem os resultados obtidos nas amostras

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fortificadas [6, 8]. São utilizadas no mínimo dez amostras fortificadas e dez não fortificadas [138].

Para o estudo deste parâmetro em amostras de sangue preparou-se uma mistura de 30 mL a partir de seis amostras de sangue de homens e mulheres, de sangue periférico ou cardíaco, obtidas post-mortem, referentes a processos já analisados no STF-N que respeitavam os prazos legais para a sua eliminação, e cujos resultados, analisados por outros procedimentos analíticos, foram negativos para o grupo de compostos selecionado.

A comparação de cromatogramas (Figura 37) de amostras não fortificadas e de amostras fortificadas obtidos por GC-ECD mostra a inexistência de interferentes provenientes da matriz, dado que os picos observados nos cromatogramas de amostras não fortificadas não possuem tempos de retenção coincidentes com os picos dos inseticidas organofosforados.

Figura 37 – Cromatogramas de uma amostra não fortificada de sangue (Sel_neg_10) e uma amostra fortificada (Sel_pos_10) por GC-ECD: Vista completa dos cromatogramas (A) e Aproximação (B) (1) Dimetoato; (2) diazinão; (3) pirimifos-metilo; (4) malatião; (6) clorpirifos; (7) paratião; (8) clorfenvinfos, isómero E; (9) clorfenvinfos, isómero Z; (10) quinalfos; (11) etião; e (12) fosalona.

Na injeção das amostras referidas não se obtiveram falsos positivos ou falsos negativos, numa avaliação que teve por base os seguintes requisitos [152]:

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 o tempo de retenção (t.r.) não diferiu mais que 2 % relativamente a um controlo positivo ou mais do que ± 0,1 minutos (o menor dos dois);

 o tempo de retenção relativo (t.r.r.) não diferiu mais do que 1 % relativamente a um controlo positivo;

 o valor da razão sinal/ruído para o composto foi superior a 3.

Na Figura 38 são apresentados os resultados obtidos para uma das amostras usadas neste estudo, de acordo com a folha de avaliação da confirmação da identidade com base no tempo de retenção e no tempo de retenção relativo [153].

Figura 38 – Excerto da folha de confirmação da identidade dos diferentes inseticidas em amostras de sangue por GC-ECD

Em GC-MS, o conjunto de critérios diferiu relativamente ao apresentado acima devido ao método de deteção:

 o tempo de retenção (t.r.) não diferiu mais que 2 % relativamente a um controlo positivo ou mais do que ± 0,1 minutos (o menor dos dois);

 o tempo de retenção relativo (t.r.r.) não diferiu mais do que 1 % relativamente a um controlo positivo;

 estavam presentes os iões escolhidos no espetro de fragmentação;

 o valor da razão sinal/ruído para o ião menos intenso foi superior a 3;

 as intensidades relativas estavam de acordo com os parâmetros apresentados na Tabela 11.

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Tabela 11 – Intervalos de tolerância das variações para as intensidades relativas dos iões em GC-MS Abundâncias Relativas

(% do pico mais intenso) Tolerâncias > 50 ± 10% (absoluto) 25 a 50 ± 20% (relativo) 5 a < 25 ± 5% (absoluto) < 5 ± 50% (relativo)

Atendendo a estes critérios, entre as 10 amostras estudadas com os 10 inseticidas, apenas houve um falso negativo por incumprimento do primeiro critério apresentado: a diferença entre os valores de t.r. do pico de quinalfos numa das amostras e do pico de quinalfos usado como controlo foi superior a 0,1 minutos. No entanto, dado que o procedimento técnico de validação em vigor no STF-N [138] prevê a aceitação de até 10% de falsos negativos considera-se que este parâmetro preenche esse requisito. Na Figura 39 são apresentados os resultados da confirmação da identidade da fosalona uma amostra, de acordo com a folha de confirmação qualitativa [154].

Figura 39 – Excerto da folha de confirmação da identidade da fosalona numa amostra de sangue por GC-MS-SIM

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Por fim, é ainda estabelecido no procedimento de validação [138] a necessidade de determinar o Coeficiente de Variação (CV) das razões entre a Área do Analito e Área do Padrão Interno (AA/API) quando se pretende validar o procedimento tendo em vista a

análise quantitativa. É ainda estabelecido que o CV deve ser inferior a 20%. Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 12. Dada a obtenção de valores superiores a 20%, foram identificados possíveis valores anómalos de AA/API, os quais foram confirmados e

rejeitados por realização do teste de Grubbs. Em todos esses casos, após a rejeição dos valores anómalos, os valores de CV encontravam-se dentro do critério de aceitação e, por isso, considera-se este parâmetro validado.

Tabela 12 – Valores de coeficiente de variação de AA/API obtido em amostras para sangue

Inseticidas CV (%) GC-ECD GC-MS Clorfenvinfos 8,51 9,91 Clorpirifos 6,76 10,45 Diazinão 8,37 9,67 Dimetoato 19,68* 12,29 Fentião n/a 8,48 Fosalona 10,28 10,90 Malatião 9,89* 10,69 Paratião 9,84 9,58 Pirimifos-metilo 18,12 9,38 Quinalfos 18,53 16,63*

Nota: os casos em que foram rejeitados valores anómalos estão assinalados com um asterisco (*) n/a – não aplicável porque o detetor não é sensível para a gama em estudo

Amostras de Conteúdo Gástrico

No estudo em conteúdo gástrico, foram preparadas dez alíquotas brancas não fortificadas e dez alíquotas fortificadas a 10 ppm de cada inseticida, incluindo o padrão interno. Tal como para sangue, as amostras obtidas post-mortem, provieram de casos já analisados no STF-N que respeitavam os prazos legais para a sua eliminação, e cujos resultados, analisados por outros procedimentos analíticos, foram negativos para o grupo de compostos selecionado. Foram também preparadas duas amostras fortificadas e duas não fortificadas em que o conteúdo gástrico foi substituído pelo mesmo volume de água acidificada com ácido clorídrico e com um pH final de 4, para usar como controlo de qualidade interno.

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Na análise dos resultados com recurso às folhas de avaliação da conformidade com base no tempo de retenção e no tempo de retenção relativo [153] e folha de confirmação qualitativa [154], com exceção de um caso, não se obteve nenhum resultado falso positivo ou falso negativo, quer em GC-ECD, quer em GC-MS-SIM. A exceção foi um falso negativo para o dimetoato em GC-MS-SIM, devido à intensidade relativa dos iões.

Por se tratar de metodologias de rastreio e confirmação, não foi necessário estudar o Coeficiente de Variação neste contexto.

4.4.2 Gama de Trabalho e Linearidade