Genotipagem

Etapas do teste de genotipagem

Etapa 1: Coleta de amostras sanguíneas

Foi coletado 5 ml de sangue do paciente-fonte HIV em tubos estéreis de coleta com EDTA e enviados ao Laboratório de Retrovirologia. As amostras ficaram armazenadas à temperatura de -20ºC até o momento da realização do teste de genotipagem.

Etapa 2: Extração do ácido nucléico do HIV-1

O DNA proviral do HIV-1 foi extraído das amostras coletadas de pacientes-fonte HIV positivo utilizando-se o kit da QIAGEN Inc. (Santa Clarita, CA, EUA) – QIAamp DNA Blood Mini Kit, conforme o protocolo a seguir:

1. Em um tubo de 1,5 mL previamente identificado com o número da amostra, pipetou-se 20 µL da protease (ou proteinase K). Para este tubo, foram transferidos 200 µL da amostra e homogenizado rapidamente com a pipeta. Posteriormente adicionou-se 200 µL do tampão AL.

2. Homogeneizou-se bem o tubo no agitador e foi encubado em termobloco a 56º C por 10 minutos.

3. Ao mesmo tubo adicionou-se 200 µL de etanol absoluto.

4. Todo o conteúdo foi transferido para uma coluna, identificada com o número da amostra.

5. Centrifugou-se por 1 minuto na rotação máxima (12.000 – 16.000 rpm).

6. Transferiu-se a coluna para um novo tubo coletor, descartando o anterior.

7. Foi adicionado à coluna 500 µL da solução AW1, e centrifugado por 1 minuto na rotação máxima.

8. Repetiu-se o passo 6.

9. Foi adicionado à coluna 500 µL da solução AW2, e centrifugado por 3 minutos na rotação máxima.

10. A coluna foi transferida para um novo tubo de 1,5 mL previamente identificado,e adicionado 100 µL do tampão TE na temperatura ambiente, e então incubado por 5 minutos a temperatura ambiente. 11. Centrifugou-se por 1 minuto na rotação máxima e descartada a

coluna utilizada. O tubo contendo o DNA extraído foi acondicionado a –20º C.

Etapa 3: Reação em cadeia pela polimerase (PCR)

Nesta etapa, a região pol do genoma do vírus, que codifica as enzimas

virais transcriptase reversa e protease, foi amplificada pela técnica de PCR (reação da polimerase em cadeia).

• Região de gene pol

A PCR foi realizada em duas etapas (nested). A primeira etapa amplificou

um fragmento do gene pol do HIV-1 de 1,2Kb (localizado na posição 2146-3337

do HXB2r) utilizando iniciadores (primers) descritos por Kozal et al. (1996) K1 –

3’ CAG AGC CAA CAG CCC CAC CA 5’ – e K2 - 3’ TTT CCC CAC TAA CTT CTG TAT GTC ATT GAC A 5’.

As concentrações dos reagentes foram:

Tampão MgCL2 dNTP Primer K1 Primer K2 Taq DNA polimerase

1X 3,5 mM 0,4 mM 0,2 µM 0,2 µM 0,25 unidades

As condições de ciclagem foram:

1 ciclo 35 ciclos 1 ciclo

Tempo 10 minutos 1 minuto 1 minuto 2 minutos 10minutos

• Região de Protease

Após o término da fase anterior, 5µL desta solução foram transferidos para um outro tubo onde se amplificou o fragmento da região da protease, contendo aproximadamente 350 pb (localizado na posição 2198-2598 do HXB2r), utilizando os iniciadores descritos por Pianiazek et al. (1991) DP10 – 3’ TAA CTC CCT CTC AGA AGC AGG AGC CG 5’ e DP11 - 3’ CCA TTC CTG GCT TTA ATT TTA CTG GTA 5’.

As concentrações dos reagentes foram:

Tampão MgCL2 dNTP Primer DP10 Primer DP11 Taq DNA polimerase

1X 2,0 mM 0,4 mM 0,2 µM 0,2 µM 0,25 unidades

As condições de ciclagem foram:

1 ciclo 35 ciclos 1 ciclo

Tempo 10 minutos 45 segundos 45 segundos 1 minuto 7 minutos

Temperatura 94 º C 94 º C 55 º C 72 º C 72 º C

• Região de Transcriptase Reversa

Para amplificar a região da transcriptase reversa, 5µl da mesma solução da primeira etapa foram transferidos para um outro tubo, onde se amplificou um fragmento de aproximadamente 700 pb (localizado na posição 2518-3320 do HXB2r), Os iniciadores utilizados nesta PCR foram aqueles descritos por Frenkel et al. (1995) F1 - 3’ GTT GAC TCA GAT TGG TTG CAC 5’ e F2 – 3’ GTA TGT CAT TGA CAG TCC AGC 5’.

As concentrações dos reagentes foram:

Tampão MgCL2 dNTP Primer F1 Primer F2 Taq DNA polimerase

As condições de ciclagem foram:

1 ciclo 35 ciclos 1 ciclo

Tempo 10 minutos 45

segundos

45 segundos 1 minuto 7 minutos

Temperatura 94 º C 94 º C 55 º C 72 º C 72 º C

Etapa 4: Detecção dos produtos amplificados

Após a PCR, as amostras de DNA amplificados foram separadas em gel de agarose 1,5 % peso/volume em Tris-borato/ EDTA (TBE) 0,5 X (0,89M Tris; 0,89 M ácido bórico e 0,02 M EDTA pH 8,0), contendo brometo de etídeo (0,5 g/ml). As corridas eletroforéticas foram efetuadas a 100 Volts (V), no tempo médio de 40 minutos, em tampão de TBE 0,5 X. O marcador padrão utilizado para a comparação de peso molecular dos fragmentos amplificados foi o de 100 pares de base (pb) (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MB, EUA). O gel de agarose foi visualizado e fotografado sob iluminação ultra-violeta (U.V.) (320nm), utilizando câmera digital DC 40 (Kodak, Rochester, NY, EUA).

Etapa 5: Purificação dos produtos das PCRs

Os produtos de PCR das amostras foram purificados pelo QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA, USA) conforme o protocolo abaixo:

1. Inicialmente, uma alíquota de TE foi pré-aquecida a 65-70º C. Foram pipetados 400 µL da solução H1 em um tubo 1,5 mL, previamente identificado com o número da amostra, e também todo o volume do produto de PCR.

2. A coluna de purificação foi colocada em um tubo de lavagem de 2,0 ml, e para esta coluna foi transferido o volume obtido no primeiro passo. 3. A coluna foi centrifugada por 1 minuto a 12000 rpm.

4. O fluído restante do tubo de lavagem foi descartado e posteriormente foi adicionado à coluna 700 µL da solução H2.

5. Foi repetido o passo três.

6. O fluído restante foi descartado.

7. Foi novamente repetido o passo 3, a fim de eliminar totalmente os resíduos de lavagem.

8. Somente a coluna foi transferida para um tubo de 1,5 mL devidamente identificado e então foram adicionados 50 µL de TE, já na temperatura de 65-70º C.

9. Foi incubado durante 1 minuto em temperatura ambiente. 10. Posteriormente foi centrifugado por 2 minutos a 12000 rpm.

11. Foram descartados a coluna e o tubo; o produto purificado acondicionado a –20º C.

Etapa 6: Reação de sequenciamento

As amostras purificadas foram sequenciadas segundo o protocolo de sequênciamento automatizado baseado no método de Sanger et al. (1977). O produto de PCR purificado e quantificado foi adicionado nas concentrações de 100 -150 ng/µL à reação de sequenciamento contendo 4 µL do mix Big Dye Terminator (Applied Biosystems Inc), 2µL tampão 5X (400mM Tris HCl pH 9,0,10 mM de MgCl2,) 3,6 pmols do iniciador, água MiliQ em quantidade

suficiente para 20 µL finais da reação. Esta reação foi submetida à ciclagem de temperaturas: 94º por 2 minutos; 25 ciclos de 94ºC por 15 segundos, 55º C por 30 segundos e 60 º C por 4 minutos.

As fitas positivas e negativas do DNA da região pol do HIV-1 foram

sequenciadas separadamente através de utilização de iniciadores no sentido sense e reverso. O volume final da reação de sequenciamento foi submetido a precipitação dos fragmentos de DNA por adição de etanol à 80 %, e centrifugação à 12000 por 30 minutos; esta etapa é necessária para a retirada dos dideoxinucleotídeos (ddNTPs) fluorescentes não incorporados que podem interferir na detecção dos fragmentos sequenciados. O precipitado foi submetido a lavagens com etanol a 70 % e ressuspenso em 20 µL de formamida. Procedeu-se então a desnaturação das fitas a 94º C por 2 minutos e a reação foi armazenada a -20º C até o momento de sua utilização.

As amostras foram submetidas à corrida eletroforética em sequenciador automático ABI –modelo 3100 (Applied Biosystems Inc).

As seqüências nucleotídicas foram editadas utilizando o programa SEquencher.

Etapa 7: Análise e interpretação da resistência genotípica aos anti- retrovirais

As seqüências de nucleotídeos geradas da protease e da transcriptase reversa do gene pol do HIV-1 foram transferidas para o banco de dados

eletrônico Beta Test, disponível no site da Universidade de Stanford (http://hivdb.stanford.edu), para serem analisadas e interpretadas.

No programa existente neste banco de dados (Beta Test), as seqüências identificadas foram comparadas com as seqüências do vírus selvagem padrão, através de listas pré-estabelecidas. Desta forma, são identificadas as mutações e se elas têm relação com a resistência.

Para tanto, o programa utiliza a somatória de valores associados a cada mutação de resistência e o total desta somatória está relacionado com o nível de resistência apresentado pelo vírus, conforme abaixo. Ressaltamos que na elaboração dos resultados, qualquer nível de resistência foi descrito como resistente.

VALOR DA

SOMATÓRIA RESISTÊNCIA NÍVEL DE IMPLICAÇÕES

0-9 Susceptível Isolados virais deste tipo não mostram redução de susceptibilidade a droga

10-14 Potencial De

Resistência Baixa

Isolados virais deste tipo podem não causar resistência, porém indicam a possibilidade de prévia drug selection

15-29 Resistência Baixa Isolados virais deste tipo reduzem

in vitro a susceptibilidade da droga

30-59 Resistência

Intermediária

O genótipo sugere grau de resistência maior que o nível baixo e menor que o nível alto

>60 Alta Resistência Isolados virais deste tipo possuem

alto níveis re resistência em vitro

As mutações primárias são as primeiras a serem selecionadas quando o vírus está sobre influência dos anti-retrovirais e diminuem a ligação do medicamento ao seu sitio de ação. As mutações secundárias são aquelas que contribuem para resistência da droga embora o façam de maneira mais indireta; precisam estar associadas a outras para causarem resistência.