4 MATERIAL E MÉTODOS
5.2. Genotipagem do material amplificado
Os 22 pacientes com PCR positivo para CMV foram analisados quanto ao genótipo viral pela técnica de RFLP. Dos 22 pacientes estudados, 12 tinham apenas o genótipo gB1, 4 tinham apenas o genótipo gB2 e 1 tinha apenas o genótipo gB4. O genótipo gB3 não foi detectado no presente estudo (Tabela 4; perfil eletroforético: figuras 5 e 6). A co-infecção pelos genótipos gB1 e gB2 foi verificada em 5 pacientes
Ín d ic e d e d e t e c ç ã o d o A D N v i r a l 0 1 ( 2 5 % ) 2 ( 5 0 % ) 4 ( 6 6 ,7 % ) 3 ( 3 3 ,3 % ) 2 ( 8 % ) 1 0 ( 9 0 ,9 % ) 3 ( 7 5 % ) 1 ( 1 0 0 % ) 2 ( 5 0 % ) 2 ( 3 3 ,3 % ) 6 ( 6 6 ,7 % ) 2 3 ( 9 2 % ) 1 ( 9 , 1 % ) 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 1 2 3 4 5 6 7 n º d e a m o s t r a s c o l e t a d a s p o r p a c i e n t e
Nº de pacientes com resultado positivo e negativo pela técnica
de PCR
p a c i e n t e s P C R + p a c i e n t e s P C R -
(Tabela 4; perfil eletroforético: figura 5), sendo que um deles apresentou infecção apenas pelo genótipo gB1 nas 3 primeiras amostras coletadas e co-infecção gB1 e gB2 na quarta amostra (Figura 4 e Tabela 5, paciente 7).
Tabela 4: Distribuição genotípica do CMV em pacientes que apresentavam sintomatologia sugestiva
de infecção por CMV e pacientes assintomáticos.
Genótipo viral Sintomatologia sugestiva Ausência de sintomatologia * Total
gB1 7 5 12 gB2 3 1 4 gB3 0 0 0 gB4 0 1 1 gB1/gB2 0 5 5 Total 10 12 22
*CMV Ag+ até 180 dias antes da coleta da amostra clínica.
Dos 10 pacientes sintomáticos no momento da coleta, 7 possuíam o genótipo gB1 e 3 tinham o genótipo gB2 (Tabela 5). Dentre os pacientes assintomáticos, 5 apresentaram o genótipo gB1, um o genótipo gB2, um o genótipo gB4 e 5 apresentaram co-infecção pelos genótipos gB1 e gB2 (Tabela 5).
Figura 4: Representação gráfica da distribuição cronológica dos resultados da detecção e
genotipagem do ADN do CMV de 12 pacientes que tiveram mais de uma amostra coletada. *genótipo “5” – co-infecção gB1/gB2.
Dois pacientes apresentaram resultado positivo na PCR para CMV da 1ª
PCR negativo 0 1 2 3 4 5 Genótipos detectados 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 A m o s tra s c lín ic a c o le ta d a s a g ru p a d a s p o r p a c ie n te s (p a c ie n te s d e 1 a 1 2 ) 1 ª a m o stra 2 ª a m o stra 3 ª a m o stra 4 ª a m o stra 5 ª a m o stra 6 ª a m o stra 7 ª a m o stra
amostra coletada e negativo nas amostras subseqüentes (Figura 5, pacientes 2 e 3). Esses pacientes apresentaram genótipos gB4 e gB2, respectivamente.
Cinco pacientes apresentaram resultado negativo nas amostras iniciais e positivo nas amostras subseqüentes (Figura 5, pacientes 1, 4, 5, 8 e 9). Dentre estes pacientes, 3 apresentaram co-infecção pelos genótipos gB1 e gB2, 1 apresentou o genótipo gB1 e o outro o genótipo gB2.
Dois pacientes tiveram resultados negativos nas primeiras e últimas amostras analisadas (Figura 5, pacientes 6 e 10). Esses pacientes apresentaram co- infecção pelos genótipos gB1 e gB2 na 3ª amostra coletada e infecção pelo genótipo gB1 na 2ª amostra coletada, respectivamente.
Dois pacientes tiveram apenas duas amostras coletadas, cada um, tendo ambos o genótipo gB1 detectado. Um desses pacientes teve a PCR negativa na 1ª amostra e positivo na 2ª, enquanto o outro paciente teve as duas amostras positivas (Figura 5 e tabela 5, pacientes 11 e 12).
Tabela 5: Resultado das técnicas de PCR e genotipagem dos 12 pacientes que tiveram mais de uma
amostra coletada.
Paciente genótipo PCR+ PCR- Total de amostras
1 gB1/gB2 1 (25%) 3 (75%) 4 2 gB4 1 (33%) 2 (67%) 3 3 gB2 2 (40%) 3 (60%) 5 4 gB1/gB2 1 (33%) 2 (67%) 3 5 gB1 1 (33%) 2 (67%) 3 6 gB1/gB2 1 (14%) 6 (86%) 7 7* gB1 – gB1/gB2 4 (100%) 0% 4 8 gB2 3 (75%) 1 (25%) 4 9 gB1 1 (25%) 3 (75%) 4 10 gB1 1 (20%) 4 (80%) 5 11 gB1 1 (50%) 1 (50%) 2 12 gB1 2 (100%) 0 2 Total*/Média** *gB1-3; gB2-2; gB4-1; gB1/gB2-4 **41,3% **58,7% *46
Considerando-se apenas as amostras de pacientes submetidos a acompanhamento, em 41,3% dessas amostras foi detectado o ADN viral (Tabela 6). A distribuição genotípica foi a seguinte: em 5 pacientes foi identificado o genótipo gB1, em 2 o genótipo gB2, em 1 o genótipo gB4 e em 4 pacientes foi detectada a co- infecção pelos genótipos gb1 e gB2 (Tabela 5 e Figura 5).
1 2 3 4 5 6 7 C+
202 239 202 195 202 239 293/296
67 66 67 66 100 66/63 36 36 44 67
36
Figura 5: Perfil eletroforético de genotipagem das amostras P9 (gB1), P26 (gB4) e P50
(gB1/gB2): Raia 1 – amostra P9 HinfI; raia 2 – amostra P9 RsaI; raia3 – amostra P26
HinfI; raia 4 – amostra P26 RsaI; raia 5 – amostra P50 HinfI; raia 6 – amostra P50 RsaI;
raia 7 – padrão de peso molecular 50pb; raia 8 – amostra (P50) positiva na amplificação do ADN viral sem tratamento com endonucleases.
1 2 3 4
Figura 6: Perfil eletroforético da genotipagem da amostra P19
(gB2): Raia 1 – amostra P19 HinfI; raia 2 – amostra P19 RsaI; PM – padrão de peso molecular 50pb.
100pb 50pb 200pb 50pb 100pb 200pb 202 100 239 63
6 DISCUSSÃO
Das 170 amostras estudadas, provenientes de 60 pacientes, 29 amostras de 22 pacientes tiveram o ADN viral detectado. Conseqüentemente, 36,7% dos pacientes estudados tiveram o ADN viral detectado em alguma amostra (Tabela 3).
As 110 amostras com resultado negativo para o ADN viral tiveram detectado
o produto de amplificação de uma seqüência do gene de β-actina. A amplificação da
seqüência de interesse do gene da β-actina demonstrou que tanto a técnica de
extração de ADN quanto a reação de amplificação por PCR foram funcionalmente adequadas.
Segundo Suassuna e cols. (1995), a prevalência de anticorpos para CMV em pacientes transplantados no Rio de Janeiro seria de 96%, aproximadamente. Considerando-se os dados de Suassuna, a sensibilidade da técnica de PCR utilizada neste estudo seria considerada baixa. Entretanto a sensibilidade da técnica de PCR aqui empregada (36,7%) foi semelhante à de Sarcinella e cols. (2002), que tiveram uma sensibilidade de 36,25%, e maior que a de Fries e cols. (1994), que detectaram a presença de ADN viral em apenas 25,2% dos pacientes estudados, embora esta diferença não tenha sido estatisticamente significativa (Pvalor=0,18).
Nossos resultados foram inferiores àqueles obtidos por Quintana (1998)
(Pvalor=0,006), que detectou a presença de ADN viral em 24 pacientes dos 35
analisados (68,6%), porém no protocolo utilizado pelo autor 33 dos 35 pacientes estudados apresentaram viruria ou viremia na época de coleta da amostra clínica.
Preiser e cols (2001) detectaram a presença de ADN viral em 18 (17,3%) das 104 amostras testadas, resultado este semelhante ao obtido neste estudo,
quando em 29 amostras das 166 testadas (17,4%) foi detectado o ADN viral (vide tabela 3).
Comparando-se os dados de sensibilidade da técnica de PCR utilizada neste estudo com aqueles dos autores anteriormente citados podemos considerar que a sensibilidade da técnica empregada está próxima da descrita na literatura.
No estudo do perfil genotípico do CMV, nos 22 pacientes submetidos à genotipagem, verificamos que nenhum apresentou o genótipo gB3, 12 (54,6%) apresentaram o genótipo gB1, 4 (18,2%) o genótipo gB2, 1 (4,5%) o genótipo gB4 e 5 (22,7%) apresentaram co-infecção pelos genótipos gB1 e gB2 (Pvalor=0,000043). A
maior prevalência do genótipo gB1 (54,6%) coincide com os achados de outros autores como Chou e Dennison (EUA-1991), Fries e colaboradores (EUA-1994) e Choi e colaboradores (Coréia do Sul-2006). Entretanto Quintana (São Paulo, Brasil- 1998) encontrou igual prevalência entre os genótipos gB1 (45,8%) e gB3 (45,8%), Sarcinella e colaboradores (Canadá-2002) encontraram uma maior prevalência do genótipo gB3, e Pacsa e colaboradores (Kuwait-2003) encontraram prevalência semelhante dos genótipos gB1 e gB2.
A prevalência de pacientes co-infectados também foi significativa em nosso estudo (22,7%). Apenas nos estudos de Quintana (1998) e de Pacsa e colaboradores (2003) a co-infecção foi também elevada, 54,2% e 26,7% respectivamente. Nos estudos de Fries e cols. (2001), Sarcinella e cols. (2002) e Choi e cols. (2006) a co-infecção foi detectada em 5%, 6,9% e 9,6% dos pacientes respectivamente (Pvalor<0,000001).
A baixa prevalência do genótipo gB4 (4,5%) demonstrada no presente estudo está em concordância com os achados de diferentes autores. Nos estudos de Chou e Dennison (1991), Fries e cols. (1994), Sarcinella e cols. (2002) e Pacsa e
cols. (2003) a prevalência do genótipo gB4 variou entre 3,3% e 5%. Entretanto, nos estudos de Quintana (1998) e de Choi e cols. (2006), o genótipo gB4 não foi detectado.
O genótipo gB1, o mais prevalente neste estudo, vem sendo associado a um maior número de casos com presença de sintomatologia clínica (Navarro, 1993; Pacsa, 2003). Também já foi demonstrado que este genótipo está menos associado à evolução para o óbito (Fries, 1994). Analisando-se a presença de sintomas nos 22 pacientes com PCR positivas, apenas 10 apresentaram sintomatologia, sendo que 7 destes eram portadores do genótipo gB1 (Tabela 4).
Em um total de 12 pacientes foi possível a realização de PCR aninhadas em seqüência de amostras, permitindo assim um acompanhamento destes pacientes. Em dois destes pacientes, após algum resultado positivo de PCR aninhada a detecção de ADN viral não voltou a ocorrer em amostras subseqüentes, em outros dois pacientes as amostras iniciais foram negativas, na seqüência o ADN viral foi detectado em outra amostra e as amostras finais também foram negativas. Em 6 pacientes o ADN viral veio a ser detectado após o resultado negativo em alguma amostra anterior (Figura 5).
Analisando-se o resultado da técnica de PCR em relação ao número de amostras coletadas por pacientes, verifica-se que aqueles que tiveram 1, 4 e 5 amostras coletadas foram os que apresentaram os maiores índices de detecção do ADN viral (Figura 3).
Os índices de detecção dos grupos de pacientes com 4 e com 5 amostras coletadas (66,7% e 50%, respectivamente) também foram maiores que aquele do total de pacientes estudados (36,7%). Os demais grupos (2, 3, 6 e 7 amostras
coletadas por pacientes) apresentaram índices inferiores à sensibilidade de detecção do ADN viral em relação ao total de pacientes estudados (Figura 3).
Embora o maior índice de detecção tenha sido o do grupo de pacientes com 1 amostra coletada, entre estes pacientes, 9 dos 10 que tiveram o ADN viral detectado apresentavam replicação viral no momento da coleta da amostra
Estes dados parecem sugerir que a detecção do ADN viral está ligada à ocorrência de replicação viral recente ou no momento da coleta da amostra, porém o número de pacientes estudados foi limitado, o que inviabiliza um estudo estatístico dos dados para que se possa chegar a alguma conclusão sobre o número de amostras necessárias durante um acompanhamento para aumentar as chances de detecção do ADN viral mesmo em pacientes assintomáticos e sem sinais de replicação viral ativa.
Um paciente estudado em acompanhamento teve 4 amostras diferentes analisadas por PCR aninhada e genotipagem. Nas 3 primeiras amostras foi detectado o genótipo gB1, enquanto na quarta amostra tanto o genótipo gB1 quanto o gB2 foram detectados (Figura 5). Pode-se dizer que neste caso foi detectada uma co-infecção durante o acompanhamento do paciente. Já foi relatado que pacientes que co-infectados vêm a apresentar uma maior morbidade quando da reativação da infecção por CMV (Sarcinella e cols., 2002)
Analisando-se o perfil genotípico da população estudada em relação à necessidade de vacinação, verificamos que os genótipos gB1 e gB2 foram os mais prevalentes (95,5%; Figura 6). Baseado nestes resultados podemos sugerir que um protocolo utilizando as cepas vacinais Towne e AD-169 em pacientes soronegativos poderia dar uma alta cobertura vacinal. Entretanto, é preciso considerar que o presente estudo teve uma população reduzida, sendo necessária um estudo mais
amplo para que tenhamos mais informações sobre a distribuição genotípica viral em nosso meio. Da mesma forma, é preciso lembrar que se faz necessária a realização de estudos sobre o impacto da vacinação em relação a cada genótipo.
7 CONCLUSÕES
O protocolo de genotipagem utilizado mostrou-se eficiente, podendo vir a ser utilizado em estudos futuros.
A sensibilidade da técnica de PCR empregada neste estudo foi semelhante àquelas da maioria dos achados descritos na literatura.
A detecção do ADN viral nas amostras estudadas pareceu estar ligada, principalmente, à replicação viral ativa ou recente.
A distribuição genotípica encontrada foi a seguinte: 12 pacientes (54,6%) tinham apenas o genótipo gB1, 4 (18,2%) tinham apenas o genótipo gB2 e 1 (4,5%) tinha apenas o genótipo gB4. O genótipo gB3 não foi detectado no presente estudo. Em 5 pacientes (22,7%) foi detectada a co-infecção pelos genótipos gB1 e gB2. Esta distribuição genotípica foi compatível com dados da literatura.
A maior prevalência dos genótipos gB1 e gB2 sugere que a utilização das cepas laboratoriais Towne e AD169 como fontes de antígeno vacinal poderá vir a ter um impacto positivo sobre a população-alvo.