Faculdade de Medicina
Programa de Pós-Graduação em Medicina –DIP
ESTABELECIMENTO DE UM PROTOCOLO DE GENOTIPAGEM E
VERIFICAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO GENOTÍPICA DO
CITOMEGALOVÍRUS EM RECEPTORES DE TRANSPLANTES DE
MEDULA ÓSSEA E ÓRGÃOS SÓLIDOS EM UM HOSPITAL
UNIVERSITÁRIO DO RIO DE JANEIRO, BRASIL
LEONARDO HOLANDA DE ALMEIDA
Rio de Janeiro 2007
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GENOTÍPICA DO CITOMEGALOVÍRUS EM RECEPTORES
DE TRANSPLANTES DE MEDULA ÓSSEA E DE ÓRGÃOS
SÓLIDOS EM UM HOSPITAL UNIVERSITÁRIO DO RIO DE
JANEIRO, BRASIL
Leonardo Holanda de Almeida
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina (Doenças Infecciosas e Parasitárias), Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências (Doenças Infecciosas e Parasitárias).
Orientadora: Profª. Drª. Maria Angélica Arpon Marandino Guimarães
Rio de Janeiro Abril/2007
Transplantes de Medula Óssea e de Órgãos Sólidos em um Hospital Universitário do Rio de Janeiro, Brasil / Leonardo Holanda de Almeida. – Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2007.
xiv, 61 f. : 11 il. ; 31 cm.
Orientadora: Maria Angélica Arpon Marandino Guimarães
Dissertação (Mestrado) – UFRJ, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Medicina – Doenças Infecciosas e Parasitárias, 2007.
Referências Bibliográficas: f. 50-61
1 Citomegalovírus. 2. PCR. 3.genótipo. 4.glicoproteína B de envelope. 5. gB CMV – Tese. I. Almeida, Leonardo Holanda. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Medicina – Doenças Infecciosas e Parasitárias. III. Título.
ESTABELECIMENTO DE UM PROTOCOLO DE GENOTIPAGEM E
VERIFICAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO GENOTÍPICA DO
CITOMEGALOVÍRUS EM RECEPTORES DE TRANSPLANTES DE
MEDULA ÓSSEA E ÓRGÃOS SÓLIDOS EM UM HOSPITAL
UNIVERSITÁRIO DO RIO DE JANEIRO, BRASIL
Leonardo Holanda de Almeida
Orientadora: Profª. Drª. Maria Angélica Arpon Marandino Guimarães
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Medicina (Doenças Infecciosas e Parasitárias), Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências (Doenças Infecciosas e Parasitárias).
Aprovada por:
__________________________________________ Presidente, Prof. Dr. Mariano Gustavo Zalis
__________________________________________ Prof. Dr. Ricardo Pereira Igreja
__________________________________________ Prof. Dr. Carlos Henrique Ribeiro Boasquevisque
Rio de Janeiro Abril/2007
À minha mãe, Suely, e meus avós, Oswaldo e Dalila, por tornarem o sonho possível e por ainda olharem por mim, mesmo não estando mais aqui.
AGRADECIMENTOS
Ao meu Pai, Wilson, pelo apoio e pela confiança inabalável em mim, mesmo quando parecia que tudo daria errado.
À Profª. Maria Angélica, pela atenção, dedicação e paciência durante esta jornada.
Ao Dr. Antônio Carlos, pelos conselhos e pela ajuda durante estes anos. Às equipes do Laboratório de Imunologia e do LIPAM, e em especial aos professores Augusto Abe e Mariano Zalis, pela inestimável ajuda para a realização de experimentos.
À Carol, minha paulistinha, que, não só me apoiou, mas me aturou todo esse tempo, inclusive nos momentos de estresse (e não foram poucos).
A todos os meus amigos, mesmo não citando nomes para não esquecer algum, pelo apoio, conforto e diversão.
RESUMO
ESTABELECIMENTO DE UM PROTOCOLO DE GENOTIPAGEM E VERIFICAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO GENOTÍPICA DO CITOMEGALOVÍRUS EM RECEPTORES DE TRANSPLANTES DE MEDULA ÓSSEA E ÓRGÃOS SÓLIDOS EM UM HOSPITAL
UNIVERSITÁRIO DO RIO DE JANEIRO, BRASIL
Leonardo Holanda de Almeida
Orientadora: Profª. Drª. Maria Angélica Arpon Marandino Guimarães
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Medicina (Doenças Infecciosas e Parasitárias), Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências (Doenças Infecciosas e Parasitárias).
O citomegalovírus geralmente é causador de infecções assintomáticas e sub-clínicas em hospedeiros normais, mas é um importante problema médico e de saúde pública em se tratando de pacientes imunocomprometidos. O CMV é considerado o mais comum patógeno oportunista dentre estes pacientes.
O CMV humano pode ser classificado em quatro genótipos de acordo com as variações do gene UL55, que codifica a glicoproteína B (gB). Estudos anteriores sugerem a possibilidade de associação entre o genótipo de gB do CMV e a manifestações clínicas em pacientes transplantados.
O objetivo deste estudo foi determinar a distribuição genotípica do CMV em uma coorte de 60 receptores de transplantes sintomáticos e assintomáticos.
O genótipo do CMV foi determinado utilizando a técnica de PCR para amplificar uma região do gene UL55 seguida da análise da restrição desta seqüência baseada na digestão da mesma com HinfI e RsaI .
O ADN viral foi detectado em amostras de leucócitos de sangue periférico de 22 pacientes e a distribuição genotípica de gB do CMV foi a seguinte: gB1, 12/22 (54,6%); gB2, 4/22 (18,2%); gB4, 1/22 (4,5%) e a co-infecção com gB1 e gB2, 5/22 (22,7%).
Neste estudo a detecção do ADN viral pareceu estar associada à infecção viral ativa ou recente em leucócitos de sangue periférico. A distribuição genotípica encontrada foi similar àquelas descritas por outros autores.
A alta prevalência dos genótipos gB1 e gB2 sugere que o uso das cepas
Towne e AD-169 como fontes de antígenos vacinais pode vir a ter um impacto
positivo na população estudada.
Palavras-chave: 1. Citomegalovírus. 2. PCR. 3. Genótipo. 4. Glicoproteína B. 5. CMV gB.
Rio de Janeiro Abril/2007
ABSTRACT
ESTABLISHMENT OF A GENOTYPING PROTOCOL AND VERIFICATION OF THE GENOTYPICAL DISTRIBUTION OF THE CYTOMEGALOVIRUS IN BONE
MARROW AND SOLID ORGANS TRANSPLANT RECIPIENTS IN AN UNIVERSITARY HOSPITAL IN RIO DE JANEIRO, BRAZIL.
Leonardo Holanda de Almeida
Orientadores: Profª. Drª. Maria Angélica Arpon Marandino Guimarães
Abstract da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de
Pós-Graduação em Medicina (Doenças Infecciosas e Parasitárias), Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências (Doenças Infecciosas e Parasitárias).
CMV is usually responsible for asymptomatic or sub-clinical infections in normal Hosts but is an important medical and public health problem when affecting immunocompromised Hosts. It is considered the most common opportunistic pathogen that complicates the care of these patients.
Human CMV can be classified into four genotypes according to the sequence variation of the UL55 gene that encodes glycoprotein B (gB). Previous studies have suggested that there could be an association between CMV gB genotype and clinical outcome in transplant recipients.
The goal of this study was to determine the distribution of CMV gB genotype in a cohort of 60 symptomatic and asymptomatic transplant recipients. The gB genotype was determined by using the polymerase chain reaction to amplify a region of the UL55 gene followed by restriction analysis based on Hinf I and Rsa I digestion.
CMV DNA was detected in the peripheral blood leukocytes of 22 patients and the distribution of CMV gB genotype was: gB1, 12/22 (54,6%); gB2, 4/22 (18,2%); gB4, 1/22 (4,5%) and a mixed infection with gB1 and gB2, 5/22 (22,7%).
In this study viral DNA detection was associated to active or recent detection of CMV replication in peripheral leucocytes. The genotypic distribution found in this study was similar to those of other authors.
The high prevalence of genotypes gB1 and gB2 suggest that the use of
Towne and AD-169 strains as antigenic source for vaccination could have a positive
impact on the studied population.
Key-words: 1. Cytomegalovirus. 2. PCR. 3. Genotype. 4. Glycoprotein B. 5. CMV gB
Rio de Janeiro Abril/2007
SUMÁRIO
Lista de siglas e abreviaturas xi
Lista de ilustrações xiii
Lista de tabelas xiv
1.Introdução 1
2.Objetivos 6
3.Revisão da literatura 7
3.1.Histórico 7
3.2.Família Herpesviridae 8 3.3.Classificação dos Herpesvírus humanos 9 3.4.Características gerais do citomegalovírus 10 3.5.Replicação do citomegalovírus 13 3.6.Epidemiologia da infecção por CMV 15 3.7.Interação do CMV com outros vírus 18 3.8.Aspectos clínicos e patológicos 19 3.9.Diagnóstico laboratorial da citomegalovirose 24 3.10.Drogas utilizadas no tratamento da infecção por CMV 27 3.11.Desenvolvimento de vacina 29
4.Material e métodos 32
4.1.Modelo de estudo 32
4.2.Obtenção de leucócitos do sangue periférico 32 4.3.Extração do ADN viral 33 4.4.Amplificação das seqüências de interesse por reação em cadeia
da polimerase aninhada
34
4.5.Detecção do produto de amplificação 36 4.6.Análise do polimorfismo de restrição do material amplificado 37 4.7.Análise estatística dos dados 38
5.Resultados 39
5.2.Genotipagem do material amplificado 40
6.Discussão 44
7.Conclusões 49
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
°C – graus centígrados ACV – aciclovir
AD169 – cepa laboratorial do citomegalovírus
AIDS – síndrome da imunodeficiência adquirida humana CD8 – proteína marcadora de subtipo de linfócito
CMV – citomegalovírus
DNA ou ADN – ácido desoxirribonucléico EBV – Epstein Barr vírus
EDTA – anticoagulante gB – glicoproteína B GCV – ganciclovir gH – glicoproteína H gL – glicoproteína L gM – glicoproteína M HHV – human herpes vírus
HIV – vírus da imunodeficiência humana HPV – papilomavírus humano
HSV – herpes simplex vírus
HUCFF – Hospital Universitário Clementino Fraga Filho Ie – proteína do citomegalovírus
KDa – quiloDalton, medida de peso molecular protéico
Kpb – quilopares de bases nitrogenadas, medida de peso molecular de ácidos nucleicos
Ml – mililitro
Nested-PCR – reação em cadeia da polimerase aninhada Nm – nanômetros
Pb – pares de bases, medida de peso molecular de a´cidos nucleicos PBS – tampão fosfato-salina
Pp – proteína fosforilada
RFLP – polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição RNA ou ARN – ácido ribonucléico
Rpm – rotações por minuto
SDS – dodecil sulfato de sódio, um detergente SNC – sistema nervoso central
UL – seqüência longa única, denominação dos genes de herpesvírus V – volts
v/v – volume por volume VZV – Varicella Zoster vírus µl – microlitro
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Reprodução computacional do citomegalovírus 11
Figura 2 Perfil eletroforético dos 4 genótipos do CMV 38
Figura 3 Resultados da técnica de PCR para CMV em relação ao número de
amostras coletadas do total de 60 pacientes estudados. 40
Figura 4 Representação gráfica da distribuição cronológica dos resultados da
detecção e genotipagem do ADN do CMV de 12 pacientes que tiveram mais de uma amostra coletada.
41
Figura 5 Perfil eletroforético da genotipagem das amostras P9 (gB1), P26
(gB4) e P50 (gB1/gB2).
43
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Apresentação das seqüências de cada iniciador, posicionamento do
iniciador nos genes, reações em que foram utilizados e tipo de cada iniciador.
36
Tabela 2 Apresentação das endonucleases utilizadas para a restrição do
material amplificado, respectivo tampão reacional utilizado e as seqüências de clivagem de cada enzima.
37
Tabela 3 Resultado da técnica de PCR para CMV realizada em 166 amostras
de leucócitos do sangue total dos 60 pacientes estudados. 39
Tabela 4 Resultado das técnicas de PCR e genotipagem dos 12 pacientes que
1 INTRODUÇÃO
A utilização de técnicas de biologia molecular no estudo dos vírus tem permitido o conhecimento, cada vez maior, da genética viral e de sua interação com o hospedeiro natural. O resultado dos estudos genéticos vem sendo aplicado às pesquisas epidemiológicas, de eficácia terapêutica e de vacinas onde o conhecimento da classificação genotípica e fenotípica dos vírus tem sido fundamental.
Dentre os patógenos virais humanos geneticamente mais estudados estão o vírus da hepatite B (HBV), o vírus da hepatite C (HCV), e o vírus da imunodeficiência humana adquirida (HIV) (Arens, 2002). Também o CMV tem sido estudado, cada vez mais, quanto às características genômicas relacionadas à eficácia vacinal, eficácia medicamentosa, morbidade e mortalidade relacionadas a cepas virais (Arens, 2002; Biron, 2006).
O CMV pertence à família Herpesviridae, sub-família β-Herpesvirinae.
Morfologicamente o CMV caracteriza-se pela presença de envelope lipídico, tegumento e capsídeo com simetria icosaédrica. Seu genoma é constituído por ADN de fita dupla linear, não segmentado, e com capacidade de estabelecer infecção
latente após a infecção primária. Como membro da sub-família β-Herpesvirinae o CMV apresenta período longo de replicação, a progressão infecciosa lenta e forte barreira interespécies (Moscarki Jr, 1993).
Estudos de seqüenciamento do ADN viral têm revelado a presença de regiões geneticamente conservadas e regiões com ampla variabilidade genética (Arens, 2002)
A utilização da genotipagem como ferramenta de avaliação da interação do CMV com seu hospedeiro natural deve considerar a função do gene estudado. Os genes UL54 (ADN polimerase viral) e UL97 (fosfotransferase viral), por exemplo, estão ligados diretamente à resistência a antivirais (Arens, 2002; Biron, 2006), enquanto o gene UL55 relaciona-se à síntese da glicoproteína B, do envelope viral (gB), responsável direta pela adsorção do vírus à célula hospedeira, pela transmissão viral célula a célula e pela imunidade viral específica. Além disso, a virulência das diferentes cepas de CMV tem sido relacionada a diferenças genéticas do gene UL55 que codifica a glicoproteína B (Sarcinella e cols., 2002).
A região de maior variabilidade genética do gene UL55 situa-se entre os códons 448 e 480. Tal característica permitiu que Chou e Denilson (1991) determinassem, através de seqüenciamento genético, a existência de 4 variantes relacionadas ao gene UL55 do CMV. Tais variantes gênicas, ou genótipos, foram denominados gB1, gB2, gB3 e gB4 e segundo os critérios de Chou e Dennison (1991) as cepas virais pertencentes a um mesmo genótipo devem apresentar uma homologia mínima de 99% na seqüência gênica do UL55, enquanto as cepas pertencentes a genótipos diferentes devem possuir uma homologia máxima de 98%.
Com base nos critérios descritos acima, Chou e Dennison (1991) desenvolveram um protocolo de genotipagem baseado na análise do perfil de polimorfismo eletroforético de um segmento do gene UL55 gerado a partir do tratamento do ADN viral (amplificado por PCR aninhada) com enzimas de restrição (Chou e Dennison, 1991).
Embora outros protocolos de genotipagem do gene UL55 do CMV tenham sido propostos, aquele desenvolvido por Chou e Dennison (1991) vem sendo considerado o protocolo padrão para utilização na análise genotípica do gene UL55
(Chou, 1990; Chou e Dennison, 1991; Shepp e cols., 1998; Barbi e cols., 2001; Puchhammer-Stöckl e Görzer, 2006).
Estudos realizados por Navarro e colaboradores (1993) e por Pacsa e colaboradores (2003) acerca do gene UL55 demonstraram que pacientes infectados por CMV genótipo 1 de gB seriam mais propensos à apresentação de sintomatologia clínica (Navarro e cols., 1993; Pacsa e cols., 2003).
Fries e colaboradores (1994), estudando pacientes transplantados de medula óssea em Portland e Seattle, Estados Unidos, observaram que o genótipo gB1 foi detectado na maioria dos pacientes com quadro de pneumonia de boa evolução (cerca de 67%), enquanto os demais genótipos foram mais detectados nos casos de pneumonia que evoluíram para o óbito (Fries e cols., 1994).
Há citações de associação entre o genótipo 2 de gB e o desenvolvimento de retinite em pacientes com AIDS (Sarcinella e cols., 2002).
A co-infecção por mais de um genótipo já foi sugerida como marcador de prognóstico negativo quanto ao desenvolvimento e gravidade da doença por CMV em pacientes imunocomprometidos (Sarcinella e cols., 2002).
Os dados acima apresentados indicam a existência de associação entre o genótipo do CMV e o prognóstico do paciente que apresenta infecção ativa pelo CMV.
No Brasil há poucos dados sobre a distribuição genotípica do CMV em pacientes submetidos a transplantes.
Vale mencionar o estudo realizado por Quintana (1998), que refere o predomínio dos genótipos gB1 e gB3 entre pacientes transplantados renais em São Paulo, além de uma elevada taxa de co-infecção por mais de um genótipo.
Spano (2002) realizou estudo sobre a distribuição genotípica do CMV em neonatos com infecção congênita, encontrando o predomínio do genótipo gB1.
Há, portanto, uma lacuna quanto à real distribuição genotípica do CMV em nosso meio.
Dadas às características de latência e àquelas de transmissão a prevenção da infecção pelo CMV deve ser considerada, em indivíduos pertencentes a grupos de risco, como imunossuprimidos e gestantes. É conhecido o fato de que pacientes transplantados com anticorpos para CMV tendem a desenvolver doença menos severa que aqueles sem anticorpos. Tais evidências vem sugerindo o emprego de vacinas para pacientes de risco além da imunização passiva com imunoglobulina específica em casos de maior morbidade (Marshall e Plotkin, 1993).
O desenvolvimento de vacinas para CMV deve levar em consideração, dentre outros fatores, as características antigênicas da glicoproteína B do envelope viral (Plotkin, 2002). A importância imunogênica da glicoproteína B sugere que a variabilidade genética de UL55 pode ser um importante fator de falha na eficácia vacinal, já que as cepas virais padrão, empregadas até o momento, são do genótipo gB1 no caso da cepa Towne e genótipo gB2 no da cepa AD-169 (Chou e Dennison, 1991; Plotkin, 2002). A utilização de vacinas polivalentes para CMV pode reduzir o risco de infecção acarretado pelo contato destes grupos especiais com o vírus (Marshall e Plotkin, 1993; Plotkin, 2002). Estudos de seqüenciamento da glicoproteína B indicam que existem diferenças na seqüência de aminoácidos codificadas por cepas de genótipos diferentes (Chou e Dennison, 1991). Entretanto, não existem estudos que avaliem a eficácia vacinal em relação a genótipos que infectam indivíduos vacinados.
O conhecimento do perfil genotípico de indivíduos de risco e o desenvolvimento de vacinas com cepas-padrão para os genótipos 3 e 4 parecem fazer-se necessários para que medidas preventivas e de controle possam ser melhor avaliadas.
2 OBJETIVOS
Este estudo tem como objetivos:
1. estabelecer a técnica de genotipagem descrita por Chou e Dennison (1991)
2. verificar a distribuição genotípica do citomegalovírus na população utilizada no estabelecimento da técnica.
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1.Histórico
O citomegalovírus, anteriormente denominado vírus das glândulas salivares, pertence à família Herpesviridae, e está amplamente distribuído na natureza e encontrando-se altamente adaptado ao seu hospedeiro, apresentando, conseqüentemente, grande especificidade para a espécie que infecta.
Os primeiros relatos de achados histopatológicos compatíveis com a infecção por citomegalovírus ocorreram no final do século XIX e início do século XX. Em 1881, Rivert notou células de formato diferenciado, aparentando estarem infectadas por protozoários, em epitélio renal de fetos nascidos mortos, porém seus dados somente foram publicados em 1904 (Craighead, 2000). Nesta mesma época Jesionek e Kiolemenoglou (1904) observaram células similares às descritas por Rivert (Craighead, 2000), em pulmões, rins e fígado de um bebê de oitos meses que faleceu com quadro clínico de infecção congênita.
Embora a descrição dos achados histopatológicos de infecção por CMV tenham sido registrados já no início do século XX, o termo “citomegalia” somente passou a ser utilizado a partir de 1921 quando Goodpasture e Talbot, (1921; Craighead, 2000), descreveram a presença de corpúsculos de inclusão no interior do núcleo de células epiteliais, semelhantes àqueles descritos nos casos de infecção pelo vírus varicella zoster. Tal correlação fez com que a etiologia viral da “doença de inclusão citomegálica” fosse sugerida e esta passou a ser caracterizada, histopatologicamente, pela presença de células gigantes com corpúsculos de
inclusão intranuclear (Spano, 2002).Quanto aos aspectos clínicos, foram descritos a presença de hepatoesplenomegalia, icterícia, microcefalia, coriorretinite, calcificação cerebral e púrpura trombocitopênica (Goodpasture e Talbot, 1921; Craighead, 2000; Spano, 2002).
A partir dos estudos de Farber e colaboradores (Farber, 1932) a denominação “virus das glândulas salivares” passou a ser empregada para o agente viral responsável pela Citomegalia. (Farber, 1932; Craighead, 2000; Spano, 2002).
Entretanto, a denominação “vírus das glândulas salivares” acabou sendo substituída pela de “Citomegalovírus” devido aos efeitos citopáticos causados por este vírus em outros sítios do organismo, além das glândulas salivares (Weller e cols., 1960). A partir de 1981 o Citomegalovirus passou a ser denominado Herpes vírus humano tipo 5, pelo comitê de taxonomia viral (Roizman, 1993) embora a denominação Citomagalovirus seja ainda reconhecida e amplamente empregada (Alford e Britt, 1993; Britt e March, 1996).
Até o momento, apenas um Citomegalovírus humano foi descrito, trata-se do Herpesvirus humano tipo 5 (Alford e Britt, 1993; Roizman, 1993; Britt e March, 1996).
3.2.Família Herpesviridae
Os membros da família Herpesviridae têm ampla distribuição na natureza sendo capazes de infectar a maioria dos eucariotos superiores investigados até o momento. Quanto à infecção da espécie humana, na década de 90, houve uma explosão nas pesquisas sobre os herpesvirus com base em três eventos:
• A importância patogênica desses vírus na etiologia de doenças que podem ser apenas triviais ou ameaçar a vida do hospedeiro imunocomprometido;
• A descoberta de que os herpesvirus possuem mecanismos sofisticados de regulação gênica que permitem sua permanência no organismo do hospedeiro, após a primo-infecção, causando um tipo de infecção denominada “infecção latente”;
• A grande diversidade evolucionária dos membros da família herpesviridae, o que permite a utilização da família viral como base para estudos evolucionários e taxonômicos.
Até o momento foram descritos oito espécies diferentes de herpesvírus (Garrett e Boeckh, 2000) capazes de infectar a espécie humana: o vírus Herpes simplex tipo 1 (HSV-1) ou Herpesvírus humano tipo 1 (HHV-1), o vírus Herpes simplex tipo 2 (HSV-2) ou Herpesvírus humano tipo 2 (HHV-2), o vírus Varicella-zoster (VZV) ou Herpesvírus humano tipo 3 (HHV-3), o vírus Epstein-Barr (EBV) ou Herpesvírus humano tipo 4 (HHV-4), o Citomegalovírus humano (CMV) ou Herpes vírus humano tipo 5 (HHV-5), o Herpesvírus humano tipo 6 (HHV-6), o Herpesvírus humano tipo 7 (HHV-7) e o vírus do Sarcoma de Kaposi ou Herpesvírus humano tipo 8 (HHV-8) (Roizman, 1993; Garrett e Boeckh, 2000; Lautenschlager e cols., 2002).
3.3.Classificação dos Herpesvírus Humanos
Embora os diferentes membros da família Herpesviridae possuam características morfológicas, imunológicas e genéticas comuns entre si, determinados aspectos de suas propriedades biológicas fizeram com que esses vírus fossem classificados em três diferentes subfamílias (Roizman, 1993; Lautenschlager e cols., 2002). De acordo os critérios dessa classificação os herpesvirus humanos estão distribuídos nas seguintes subfamílias (Roizman, 1993):
• Alpha-herpesvirinae – apresentam uma gama de hospedeiros variável, ciclo reprodutivo curto, difusão rápida em cultura, destruição eficiente da célula hospedeira e a capacidade de estabelecer latência primeiramente, embora não exclusivamente, em gânglios sensitivos. São exemplos o HSV-1, o HSV-2 e o VZV.
• Betha-herpesvirinae – apresentam uma gama restrita de hospedeiros, ciclo reprodutivo longo, progressão infecciosa lenta em cultura, causam citomegalia na célula hospedeira e estabelecem latência em glândulas secretórias, células linforeticulares e em epitélios. São exemplos o CMV, o HHV-6 e o HHV-7.
• Gamma-herpesvirinae – são capazes de reconhecer os membros da mesma família ou gênero como seus hospedeiros naturais, todos replicam em células fibroblastóides em cultura, embora alguns também sejam capazes de infectar células fibroblásticas e epiteliais. São capazes de infectar linfócitos, mas tal replicação não gera progenie infecciosa. Fazem parte desta família o EBV e o HHV-8.
3.4.Características gerais do Citomegalovirus
O CMV possui distribuição universal e características de crescimento e
interação com o hospedeiro próprias dos membros da subfamília β-herpesvirinae (Alford e Britt, 1993; Roizman, 1993). Cada vírion de CMV é formado por um core contendo seu ADN incluído em um capsídeo de 100nm de diâmetro, capsídeo este formado por 162 capsômeros dispostos em formato icosaédrico. Em torno do capsídeo encontra-se uma estrutura amórfica, denominada tegumento. Envolvendo
o tegumento existe um envelope lipídico no qual estão inseridas as glicoproteínas virais (Alford e Britt, 1993; Moscarki Jr, 1993; Roizman, 1993)
Figura 1: Reprodução computacional do citomegalovírus. Capa do livro “Citomegalovírus”, editado
por Mathias J. Reddehase.
O ADN viral é de fita dupla, linear, não segmentado, contendo cerca de 229 kpb. Esse ADN, durante a infecção viral, toma a forma circular quando liberado no interior da célula hospedeira (Moscarki Jr, 1993) a qual lhe dá maior estabilidade.
O citomegalovírus é o único β-Herpesvírus que possui genoma de estrutura
classe E, ou seja, possui dois componentes de elementos diretos e repetidos invertidos (Spano, 2002). O genoma viral apresenta uma região curta de seqüência única, chamadas unique short (Us) e outra longa denominada unique long (Ul), que correspondem a cerca de 20% e 80% do genoma viral respectivamente (Spano, 2002).
As regiões Us e Ul podem se apresentar de forma direta ou invertida na composição do genoma, originando quatro formas isoméricas do ADN viral (Griffiths e Emery, 1997). Em estudos realizados com células infectadas todos os isômeros foram detectados em quantidades proporcionais (Griffiths e Emery, 1997).
O virion também possui quatro espécies de ARN mensageiros (ARNm) localizados no tegumento, um dos quais está relacionado ao gene da fase inicial da
Envelope viral recoberto de glicoproteínas
Tegumento viral Capsídeo viral
replicação viral, dois ARNm estão relacionados aos genes da fase intermediária da replicação e o quarto ARNm está relacionado a um gene da fase tardia da replicação viral (Breshnaham e Shenk, 2000).
Quanto à composição protéica, o vírion possui pelo menos 30 polipeptídeos com peso molecular variando entre 20 e 200 KDa, distribuídos pelo envelope, tegumento e capsídeo viral (Moscarki Jr, 1993; Griffiths e Emery, 1997).
No cerne viral, encontramos o ADN envolvido por poliaminas (espermina e espermidina na proporção de 2:1, cuja função é a de neutralizar as cargas negativas do DNA viral (Gibson, 1996).
No capsídio viral encontram-se duas principais proteínas, a proteína UL86, que constitui 90% da massa viral do capsídio, e a proteína UL46, de localização mais interna, responsável pela ancoragem do ADN ao capsídio viral (Moscarki Jr, 1993; Gibson, 1996).
As proteínas UL48, UL47, UL35 (ou pp150), UL82 (ou pp71) e pUL 83 (ou pp65) são as proteínas predominantes do tegumento viral e correspondem a cerca de 40% da massa protéica do vírus. Essas proteínas, além de propriedades imunogênicas, atuam como trans-ativadoras na maturação da partícula viral (Moscarki Jr, 1993; Spano, 2002). A proteína pUL 83 também denominada pp65 é produzida em grande quantidade durante a replicação viral e, por isso, tal característica tem propiciado a utilização dessa proteína como alvo da pesquisa de antígeno viral, em células infectadas, na chamada técnica de antigenemia para CMV.
No envelope viral estão as glicoproteínas gB, gH, gL e gM que tem sido amplamente estudadas e caracterizadas devido ao importante papel que desempenham na imunogenicidade viral. (Britt e March, 1996). Além disso, estudos
da morfogênese viral demonstraram que a glicoproteína B é responsável pela adsorção e penetração do vírus na célula hospedeira, pela transmissão viral célula a célula e pela fusão de células infectadas (Chou e Dennison, 1991; Sarcinella e cols., 2002).
3.5.Replicação do Citomegalovírus
Os aspectos ultra-estruturais da ligação, penetração e maturação do CMV são similares aos descritos para os HSV-1 (Moscarki Jr, 1993).
A replicação tem início com a adsorção do vírus aos receptores de superfície da célula-alvo. O fato de o CMV não competir com outros herpesvírus por sítios de ligação sugere uma diferença entre os receptores utilizados por cada vírus durante a adsorção e a penetração virais (Moscarki Jr, 1993). No que se refere ao CMV foi verificado que a heparina bloqueia a interação do CMV com a célula alvo, o que sugere a participação de heparan-sulfato e de outros proteoglicanos na adsorção viral à célula hospedeira (Moscarki Jr, 1993).
Uma vez adsorvido à célula hospedeira, o CMV passa rapidamente para o interior da célula hospedeira num fenômeno denominado viropexia. A viropexia parece ocorrer em menos de 5 minutos e é feita através da fusão do envelope lipídico viral com a membrana citoplamática celular e conseqüente liberação do capsídio viral no citoplasma celular. (Smith e De Harven, 1974). O capsídio liberado no citoplasma celular, com seu arranjo arquitetônico desfeito, libera o ADN viral que chega ao núcleo da célula e, nesta etapa da replicação viral, a infecção poderá seguir em direção à latência ou à infecção lítica.
O ciclo reprodutivo do CMV é longo, durando entre 48 e 72 horas, e seu progresso infeccioso é lento (Moscarki Jr, 1993; Roizman, 1993). O início da sua replicação ocorre de forma independente da célula, porém a complementação desta depende da maquinaria celular (Moscarki Jr, 1993; Roizman, 1993).
Da mesma forma que os demais vírus da família Herpesviridae, o estudo da replicação do CMV é dividido em 3 etapas ou fases denominadas: alfa (. RXLQLFLDO EHWD RX LQWHUPHGLária e gama (γ) ou tardia (Moscarki Jr, 1993). É importante ressaltar que os primeiros genes transcritos são da classe α e têm papel na
regulação da expressão gênica viral dirigindo o curso da infecção em direção à infecção latente ou a infecção lítica (Moscarki Jr, 1993).
Seguindo o ciclo lítico de infecção, a produção da progênie infecciosa está invariavelmente ligada à destruição da célula hospedeira (Roizman, 1993).
Neste tipo de infecção os transcritos da fase inicial ou . SURPRYHP D transcrição dos genes da classe intermediária ou β. Os genes da fase intermediária
ou β codificam enzimas envolvidas diretamente na replicação do ADN viral tais como
as ADN polimerase e helicase, (Moscarki Jr, 1993). Diante da disponibilidade das enzimas de replicação a síntese do ADN da progênie viral é iniciado. Os genes da
fase intermediária ou β também sintetizam proteínas que levam a expressão dos
genes da fase tardia ou γ levando à síntese das proteínas γ que são, em sua maioria,
do tipo estrutural (Moscarki Jr, 1993).
Na penúltima fase da replicação viral ocorre a montagem do capsídeo viral, no núcleo da célula hospedeira, seguido da inserção do ADN viral. O capsídio formado, circundado por proteínas do tegumento é envolvido pela membrana nuclear e segue em direção ao complexo de Golgi onde após a perda e o ganho do envoltório de membrana poderá ser excretado, por exocitose (fenômeno raro) ou
permanecer, em vesículas, no interior da célula infectada sendo liberado após a lise da mesma (Severi, Landini e Godoni, 1988).
Os mecanismos envolvidos na ativação do vírus que se encontra em infecção latente, não são conhecidos. Sabe-se que a imunodepressão é um fator importante no desencadeamento da infecção lítica a partir da infecção latente viral (Hummel e Abecassis, 2002).
3.6.Epidemiologia da Infecção por CMV
A característica do CMV de ser reativado intermitentemente e liberado na urina, saliva e outros fluidos corporais, mesmo na ausência de sintomatologia, faz dele um agente infeccioso bem sucedido. Levantamentos soro epidemiológicos tem confirmado a verificado uma alta prevalência de infecção por CMV na população mundial. Uma revisão da literatura (Preiser e cols., 2001) verificou que a prevalência de infecção por CMV, determinada pela pesquisa de anticorpos específicos, era de 50% a 90%, na população adulta. Em nosso meio Yoshida e colaboradores (1987), ao estudarem uma população de doadores de sangue, na cidade do Rio de Janeiro, encontraram uma prevalência de anticorpos para CMV, de 97%. Ainda no Rio de Janeiro, em estudo realizado por Suassuna e colaboradores (1995) foi verificada uma prevalência de 81% , na população adulta e de 77% em adolescentes.
Devido à susceptibilidade do CMV aos fatores ambientais, faz-se necessário um contato próximo, quando não íntimo, para que a transmissão pessoa a pessoa possa ocorrer (Alford e Britt, 1993; Moscarki Jr, 1993).
As maiores taxas de infecção por CMV tem sido encontradas no período perinatal até o primeiro ano de vida e no início da maturidade sexual.
No que se refere às infecções intra-uterinas alguns autores determinaram uma taxa de infecção entre 0,4% e 2,5%, entre os nascidos vivos (Alford e Britt, 1993). Na infecção primária da gestante 30% a 40% dos conceptos apresentam infecção congênita, e dentre estes, 25% a 50% apresentam anormalidades após o nascimento. Entretanto, no caso de a gestante sofrer uma reativação viral, a transmissão fetal cai para 1% (Griffiths e Emery, 1997).
No período perinatal, a passagem pelo canal de parto e a amamentação são importantes vias de transmissão viral (Rand, Polland e Merigan, 1978; Stagno e cols., 1980).
No primeiro ano de vida o contato com saliva e urina em creches e com familiares faz com que a criança, já então, entre em contato com diferentes cepas de CMV. Nogueira e colaboradores (1986) demonstraram que crianças com baixo nível sócio-econômico, aos 6 meses de idade, apresentam soroprevalência de 25,5% e aos 9 meses a soroprevalência atinge 47,3% (Nogueira e cols., 1986).
Com a maturidade sexual ocorre uma elevação na taxa de infecção viral devido à transmissão viral através do esperma e da secreção vaginal (Rasmussen e cols., 1995).
Diferentes estudos procuraram investigar a presença do vírus no trato genital masculino e feminino. Em pacientes masculinos com infecção por HIV tem sido possível o isolamento viral a partir do esperma (Lang e Kummer, 1975; Leach e cols., 1994; Rasmussen e cols., 1995). Entretanto, embora o vírus tenha sido isolado do esperma, não foram encontradas evidências de sua presença nas células germinativas. Witz e colaboradores (1999) demonstraram que, na fertilização in vitro, embriões e fetos não apresentaram sinais de infecção viral, mesmo aqueles fertilizados por espermatozóides de doadores positivos para infecção por CMV. No
sexo feminino, Collier e coalboradores (1995) mostram que mais de 20% das mulheres estudadas, que apresentavam sintomas de infecção por via sexual, tiveram o CMV detectado em amostras de secreção cervical cultivadas uma única vez (Collier e cols., 1995).
O clima não parece afetar os níveis de infecção, entretanto, o nível socio-econômico aumenta o risco de contágio, tanto vertical (mãe/feto) quanto horizontal, de forma inversamente proporcional, ou seja, quanto mais alto o nível social, menor a prevalência da infecção por CMV (Alford e Britt, 1993; Moscarki Jr, 1993; Preiser e cols., 2001; Sarcinella e cols., 2002).
O CMV também pode ser transmitido pelo sangue ou seus derivados. Cerca de 10% dos casos clínicos de sídrome mononucleosis-like, síndrome que apresenta alguns sintomas parecidos com os da mononucleose, são atribuídos à infecção por CMV. Os casos deste tipo de manifestação clínica diminuíram consideravelmente com a análise prévia do sangue e seus derivados antes de transfusões, o que indica uma associação entre a “mononucleose por CMV” e transfusão de hemo-derivados (Craighead, 2000).
Com o advento dos transplantes, os órgãos, tecidos e células transplantadas passaram a ser novos veículos de contaminação com o CMV. Levando-se em conta que o CMV é capaz de infectar vários tipos diferentes de células, quase todos os tipos de transplantes heterólogos são potenciais vias de contágio com o CMV (Alford e Britt, 1993; Moscarki Jr, 1993; Preiser e cols., 2001; Sarcinella e cols., 2002).
Vale lembrar que quaisquer pacientes submetidos a transplante são integrantes do grupo de risco quanto ao desenvolvimento de doença por CMV devido ao fato de serem imunossuprimidos, sendo a infecção, nestes casos, de suma importância (Alford e Britt, 1993; Preiser e cols., 2001).
A prevalência entre pacientes submetidos a transplante já foi apontada como sendo de cerca de 96% da população estudada (Spano, 2002).
3.7.Interação do CMV com outros vírus
Estudos recentes tem sugerido a existência de sinergismo de determinados vírus em relação à replicação do CMV.
Ghazal e Nelson (1993) sugerem que algumas proteínas de classe α do
CMV, proteínas que têm papel na regulação da expressão gênica viral, são capazes
de interagir com uma região promotora do genoma do HIV gerando a trans-ativação do HIV em células co-infectadas (Spano, 2002).
O CMV também interage com os outros vírus que pertencem a subfamília
β-herpesvirinae, são eles o HHV-6 e o HHV-7. Estes vírus são capazes de estabelecer
latência após a primeira infecção do hospedeiro (Humar, 2006).
O HHV-6 vem sendo considerado um importante co-fator na infecção por CMV. A soro-conversão do HHV-6 foi associada ao desenvolvimento de doença por CMV em pacientes de transplante hepático (Lautenschlager e cols., 2002; Pacsa e cols., 2003). Estudos de Humar (2006) verificaram que o HHV-6 é capaz de inibir a
expressão de interleucina-2, além de ser um potente indutor de TNF-α (Fator de
Necrose Tumoral α), uma citocina envolvida na re-ativação infecciosa do CMV em latência. Entretanto, estudos de Pacsa e colaboradores (2003) não encontraram qualquer associação entre a presença do HHV-6 e a infecção ativa por CMV, em pacientes de transplante renal. Ainda neste estudo de Pacsa e cols. (2003), a detecção de ADN de HHV-7 foi maior entre pacientes assintomáticos do que entre aqueles com sintomatologia clínica por CMV (Pacsa e cols., 2003).
Lautenschlager e colaboradores (2002), estudando uma coorte de 34 transplantados hepáticos, encontraram sinais de co-infecção entre HHV-6 e CMV em 10 de 12 pacientes que desenvolveram doença por CMV e co-infecção entre HHV-7 e CMV em 9 desses mesmos 12 pacientes. No entanto, o grupo não descartou a possibilidade de a co-infecção estar relacionada apenas ao imuno-comprometimento dos pacientes, atuando na facilitação da replicação de cada vírus, em separado.
Descrições de casos clínicos associam o desenvolvimento de doença por CMV com a existência de infecção ativa por HHV-6 e HHV-7, sendo os casos mais convincentes, os de encefalite e supressão da medula óssea (Griffiths, Clark e Emery, 2000). No estudo realizado por Griffiths, Clark e Emery (2000), o emprego de técnicas de quantificação do genoma viral permitiu verificar que os momentos de maior excreção do CMV, do HHV-6 e do HHV-7 eram diferentes em pacientes transplantados. O pico de excreção do HHV-6 era 20 dias após o transplante, o do HHV-7 era 26 dias pós-transplante e o do CMV, 36 dias após e realização do transplante (Griffiths, Clark e Emery, 2000).
Griffiths, Clark e Emery (2000) defendem a tese de que a profilaxia para o CMV inibe o desenvolvimento de doença devido à inibição da replicação do HHV-6 e do HHV-7. Entretanto estudos de Humar (2006) sugerem que o ganciclovir e o
valganciclovir atuam, predominantemente, sobre o CMV, exercendo pouco efeito
sobre o HHV-6 e HHV-7.
3.8.Aspectos Clínicos e Patológicos
O citomegalovirus apresenta tropismo para células das glândulas salivares, porém, já foi isolado de células linforeticulares, de glândulas secretórias, rins, entre
outras linhagens celulares (Bitsch e cols., 1993; Britt e March, 1996; Chernoff e cols., 1997; Hahn, Jones e Mocarski, 1998). Ele é facilmente transmitido através de fluidos corpóreos e da placenta (Biron, 2006).
A infecção primária geralmente é mais grave (Roizman, 1993; Britt e March, 1996) embora a maioria dos indivíduos que apresentam infecção primária não apresentem sintomatologia. Depois da primeira infecção o vírus permanece no organismo, em forma latente, podendo ser excretado de forma intermitente ou continuamente nos casos de infecção crônica ou prolongada (Moscarki Jr, 1993; Preiser e cols., 2001; Lautenschlager e cols., 2002).
A vasta maioria das infecções ativas, primárias ou recidivantes, são assintomáticas (Moscarki Jr, 1993; Preiser e cols., 2001; Lautenschlager e cols., 2002), entretanto, devido ao maior índice de morbidade e de mortalidade, as infecções por CMV têm extrema importância em alguns grupos específicos de pacientes como mulheres grávidas, neonatos, prematuros, pacientes com infecção avançada por HIV e pacientes transplantados (Britt e March, 1996; Boeckh e Boivin, 1998; Preiser e cols., 2001; Lautenschlager e cols., 2002).
Nos países economicamente desenvolvidos o CMV é o mais freqüente agente etiológico dos casos de infecção congênita viral (Barbi e cols., 2001; Schleiss e cols., 2004). A infecção congênita por CMV é responsável por significativa morbidade, por deficiências auditivas e retardo mental decorrentes de falhas no neurodesenvolvimento fetal (Schleiss e cols., 2004). Entre os neonatos com infecção congênita a encefalite por CMV apresenta quadros de periventriculite levando, principalmente, à calcificação periventricular (Boppana e cols., 1992).
Dependendo da faixa etária e do comprometimento imunológico do paciente o CMV apresenta diferentes formas clínicas. A síndrome de mononucleose
infecciosa, que é caracterizada por febre prolongada, hepatosplenomegalia, anormalidades nas funções hepáticas e linfocitose atípica tem sido descrita em indivíduos adultos imunocompetentes, e mais raramente em crianças. Faringite e linfoadenopatia, comumente presentes na mononucleose por EBV (vírus Epstein-Barr), raramente estão presentes nas infecções causadas por CMV (Craighead, 2000).
Entre os pacientes com infecção avançada por HIV, o CMV tem sido frequentemente associado a quadros de corioretinite e de gastrenterite (Alford e Britt, 1993; Britt e March, 1996). Já em pacientes transplantados, a infecção ativa por CMV tem freqüência e severidade variáveis de acordo com o tipo de transplante e a natureza e duração do regime de supressão imunológica (Erice e cols., 1989; Alford e Britt, 1993; Britt e March, 1996). Neste grupo de pacientes o CMV tem sido considerado o mais freqüente agente etiológico viral, causador de doença pós transplante (Preiser e cols., 2001; Bordils e cols., 2005).
Os receptores de transplantes têm como sintomas mais comuns febre, leucopenia, elevação dos níveis séricos de enzimas hepáticas (como a bilirrubina), mal-estar, anemia e pneumonia intersticial. Também é bastante comum o surgimento de sintomas gastro-intestinais e respiratórios, como a pneumonia, por exemplo (Alford e Britt, 1993; Britt e March, 1996).
O CMV pode exercer uma ação imuno-moduladora, passando a ser considerado um fator de risco para o desenvolvimento de disfunções sistêmicas, rejeições agudas ou crônicas do enxerto ou co-infecções por microorganismos oportunistas (Delgado e cols., 1992; Soderberg-Naucler, Fish e Nelson, 1997; Sarcinella e cols., 2002).
Ginanneschi e colaboradores (2006) reportaram recentemente um caso de encefalite em um indivíduo imunocompetente em que vários sintomas como febre, desorientação e confusão, retenção urinária, constipação e fixação de contraste de ressonância magnética entre o cone medular e a cauda eqüina, assim como na substância branca subcortical e periventricular. Neste caso clínico, tanto os testes de antigenemia para CMV e HHV-7 foram todos negativos e a detecção de anticorpos contra os dois vírus só foi positiva para anticorpos do tipo IgG. Testes de PCR aninhada para ambos os vírus foram realizados em amostras de sangue periférico e líquor, mas apenas os testes realizados no líquor foram positivos. O caso foi diagnosticado como encefalo-radiculo-mielite associada à re-ativação de CMV e HHV-7 no sistema nervoso central (Ginanneschi e cols., 2006).
Com o advento da imunossupressão e dos transplantes, a pneumonia por CMV se tornou uma doença cuja presença passa a ser bastante significativa, principalmente nos primeiros dias de imunossupressão terapêutica (Baughman, 1997). A infecção pulmonar por CMV se tornou o mais comum fator de complicação pós-transplante devido à imunossupressão (Alford e Britt, 1993) podendo atingir uma taxa de mortalidade de até 80% em pacientes imunossuprimidos não tratados (Baughman, 1997). No entanto, o CMV tem sido detectado em até 50% dos lavados bronco-alveolares de pacientes sem evidência clínica de pneumonia (Craighead, 2000)
No trato digestivo, células epiteliais de mucosa, células endoteliais e fibroblastos já foram identificadas como hospedeiros para o vírus através de microscopia e marcação imunológica (Craighead, 2000). Yoshida e colaboradores detectaram a presença de material genético viral em biópsias do trato digestivo pequenas demais para análise microscópica adequada (Yoshida e cols., 1996).
Embora a presença do vírus em células do trato digestivo já tenha sido demonstrada, o papel desempenhado pelo CMV na lesão inicial do trato digestivo, ainda não foi esclarecido.
A incidência de infecção do trato digestivo em pacientes transplantados varia de 2% a 10%, geralmente ocorrendo nos primeiros meses após o transplante e em associação com disseminação de CMV. Lesões hemorrágicas são, particularmente, um problema para estes pacientes, sendo necessária intervenção cirúrgica em alguns casos (Buckner e Pomeroy, 1993).
O CMV é o patógeno viral mais comum no período pós-transplante de fígado e a hepatite é a manifestação clínica mais freqüente (Winston, Emmanouilidis e Busuttil, 1995). A gravidade da doença é, sem dúvida, reflexo da severidade da infecção, mas ainda não está claro o motivo dos transplantados de fígado serem alvos preferenciais da doença (Craighead, 2000). A falha na detecção de células do parênquima hepático com inclusões virais e a dificuldade em ser demonstrado a presença de antígenos virais por imuno-histoquímica tem dificultado a diferenciação do quadro clínico da hepatite por CMV daquela causada pelo vírus Epstein-Barr (EBV) (Snover e Horwitz, 1984).
O envolvimento dos glomérulos renais tem sido descrito em neonatos com infecção congênita por CMV e em transplantados (Ozawa e Stewart, 1979; Beneck, Greco e Feiner, 1986).
No coração tem sido relatado a presença de células endocárdicas e miócárdicas com aspecto citomegálico, associado a infiltrado intersticial linfocítico (Craighead, 2000). Schonian e colaboradores (1995) verificaram que 25% dos casos de cardiomiopatia apresentavam infecção por CMV (Schonian e cols., 1995).
O envolvimento ocular parece ser uma complicação da viremia por CMV e o vírus ou seu DNA, podem ser encontrados na lágrima e no humor aquoso. Áreas de necrose podem ser detectadas por exame oftalmológico, podendo haver evolução para quadros de aneurisma de pequenos vasos na retina, sendo comum, seu deslocamento, em casos avançados da doença. Em alguns casos de infecção ocular pode haver a necrose do nervo ótico (Craighead, 2000).
A coriorretinite é comumente detectada em neonatos com infecção congênita por CMV. Neste grupo a prevalência parece ser em torno de 25% a 29% (Stagno e cols., 1977). Quanto aos receptores de transplante, 5% desenvolvem coriorretinite (Craighead, 2000) enquanto 6 a 15% dos pacientes com AIDS apresentam essa complicação (Hansen e cols., 1994).
3.9.Diagnóstico Laboratorial da Citomegalovirose
O diagnóstico laboratorial da citomegalovirose baseava-se, inicialmente, na pesquisa de anticorpos do tipo IgM específica cuja sensibilidade e especificidade permitiam o esclarecimento apenas de casos de infecção congênita e aqueles de infecção primária por CMV (Spano, 2002).
A forma latente de infecção por CMV em uma população mundial com alta prevalência de anticorpos específicos faz com que indivíduos imunocomprometidos apresentem, com relativa freqüência, reativação viral a partir de uma infecção latente. Nesses casos, a pesquisa de anticorpos da classe IgM apresenta pouca sensibilidade devendo-se dar preferência a métodos laboratoriais diagnósticos que detectem a presença quantitativa do vírus, de proteínas virais ou do genoma viral (Preiser e cols., 2001).
A eficácia dos antivirais voltados ao tratamento da infecção por CMV e a preconização da terapia preemptiva levaram ao surgimento de protocolos que utilizam métodos quantitativos de diagnóstico para a detecção da replicação por CMV (Boeckh e Boivin, 1998; Craighead, 2000; Amorim e cols., 2001; Preiser e cols., 2001; Bernabeu-Wittel e cols., 2005; Bordils e cols., 2005)
O material biológico destinado à detecção do CMV depende do quadro clínico do paciente sendo que nos casos de terapia preemptiva dá-se preferência aos leucócitos do sangue total. (Preiser e cols., 2001; Garrigue e cols., 2006).
Dos métodos que detectam a replicação viral, o isolamento viral em cultura de células, mesmo que baseado na técnica de shell vial, tem baixa sensibilidade quando comparado a métodos quantitativos atuais além de ser laborioso e exigir pessoal técnico especializado. (Boeckh e Boivin, 1998; Greavis e Mocarski, 1998; Bernabeu-Wittel e cols., 2005). Apesar das limitações dessa técnica diagnóstica, há algumas décadas, este procedimento técnico era o único que permitia a detecção da replicação viral ativa (Ehrnst, 1996; Boeckh e Boivin, 1998).
A partir de 1988, a técnica de antigenemia para CMV passou a ser utilizada no rastreamento da replicação viral ativa. Nesta técnica, é feita uma detecção quantitativa de leucócitos do sangue total, que expressam uma determinada proteína viral (Landry e Ferguson, 1993; Boeckh e Boivin, 1998; Pourier-Toulemond e cols., 2000; Piiparinen e cols., 2001). Todavia, as variações entre os protocolos in house e comerciais da técnica de antigenemia para CMV sempre foram um empecilho para a padronização e para a comparação de resultados obtidos por esta metodologia diagnóstica, entre diferentes grupos de pesquisa (Boeckh e Boivin, 1998; Piiparinen e cols., 2004). Além disso, embora a antigenemia seja bastante eficaz, ela é uma
técnica laboriosa e exigindo capacitação técnica para ser realizada. (Bordils e cols., 2005).
Os métodos de captura híbrida e de detecção de RNA mensageiro viral também têm sido utilizados para detecção da replicação viral, mas tais métodos têm se mostrado menos eficazes do que a técnica de antigenemia em termos de sensibilidade e de valor preditivo positivo em relação à doença por CMV (Ehrnst, 1996; Mazzulli e cols., 1996; Boeckh e Boivin, 1998; Mazzulli e cols., 1999).
Com o avanço tecnológico, os métodos de quantificação molecular foram sendo preconizadas no rastreamento da infecção ativa por CMV, em substituição à técnica de antigenemia (Boeckh e Boivin, 1998; Piiparinen e cols., 2004) A quantificação do DNA viral no plasma ou em leucócitos do sangue total serve como indicador de infecção ativa, servindo como um marcador prognóstico de surgimento de doença (Delgado e cols., 1992; Zaia e cols., 1997; Grangeot-Keros e Cointe, 2001; Preiser e cols., 2001).
Atualmente é possível a quantificação do genoma viral pelo método de reação em cadeia de polimerase (PCR) em tempo real (Bordils e cols., 2005; Hernando e cols., 2005). Diversos estudos que compararam as técnicas de PCR quantitativo em tempo real e a técnica de antigenemia encontraram alto grau de sensibilidade e especificidade entre as duas técnicas, embora haja casos em que é necessário a realização de ambas as técnicas, para esclarecimento diagnóstico (Preiser e cols., 2001; Piiparinen e cols., 2004; Bordils e cols., 2005; Hernando e cols., 2005). No entantanto, alguns autores defendem a tese de que embora extremamente sensível e acurada, a técnica de PCR em tempo real não é capaz de detectar a infecção ativa por CMV antes da técnica de antigenemia (Amorim e cols., 2001).
Ficou definido através de um guia de conduta elaborado pelo International
Herpes Management Forum em 2004, que o tratamento e a profilaxia da infecção
por CMV deveria ser feita utilizando drogas testadas e aprovadas, devendo ser realizado, durante o período de tratamento, a monitoração do paciente com uma técnica laboratorial quantitativa para detecção de replicação viral (Biron, 2006).
Diante dos dados citados acima, o diagnóstico de infecção ativa por CMV é feito utilizando-se uma técnica quantitativa, seja ela a antigenemia ou uma PCR quantitativa. Levando-se em conta que todas as técnica testadas e empregadas até o momento possuem alguma margem de erro e limites de sensibilidade e especificidade, a conduta ideal aser seguida para o diagnóstico da infecção ativa por CMV é o emprego de ambas as técnicas de forma complementar (Amorim e cols., 2001; Preiser e cols., 2001; Piiparinen e cols., 2004; Bordils e cols., 2005; Hernando e cols., 2005).
3.10.Drogas Utilizadas no Tratamento da Infecção por CMV
Apesar da atual disponibilidade no mercado de vários agentes antivirais, o tratamento da doença causada pelo CMV ainda apresenta algumas dificuldades (Preiser e cols., 2001).
A quimioprofilaxia da infecção por CMV é válida e eficaz na prevenção de doenças por CMV, mas é problemática se forem considerados os efeitos adversos decorrentes da toxicidade das drogas antivirais e a possibilidade do aparecimento de cepas resistentes (Erice e cols., 1989; Preiser e cols., 2001). A principal alternativa à quimioprofilaxia é o tratamento preemptivo, é o caso de pacientes que estão
assintomáticos, mas que apresentam marcadores laboratoriais que sugerem replicação viral ativa em ausência de sintomas (Preiser e cols., 2001).
As principais drogas antivirais utilizadas no tratamento da infecção por CMV são o ganciclovir (e sua pró-droga, o valganciclovir), o foscarnet e o cidofovir (Britt e March, 1996; Bordils e cols., 2005; Biron, 2006).
O ganciclovir e o valganciclovir atuam sobre a fosfatase viral. Ambas as drogas, análogos de nucleotídeos, são fosforiladas pela proteína viral UL97 e, ligam-se, de forma estável, à cinase viral, inativando-a (Biron, 2006).
O cidofovir e o foscarnet atuam sobre a ADN polimerase viral, porém cada uma dessas drogas tem mecanismo de ação diferente. O cidofovir, após ser fosforilado por cinases celulares, provoca inibição competitiva da ADN polimerase viral impedindo o alongamento da cadeia do ADN viral (Biron, 2006). O foscarnet atua ligando-se à estrutura quaternária da ADN polimerase viral, de forma irreversível, ocasionando assim o impedimento da replicação viral (Biron, 2006).
Nas últimas duas décadas o ganciclovir (GCV) vinha sendo utilizado como droga de escolha no tratamento da infecção por CMV. Porém, por ser uma droga de administração parenteral, foi sendo substituído por seus derivados que possuem maior biodisponibilidade além de poderem ser administrados por via oral. (Britt e March, 1996; Bordils e cols., 2005). O valganciclovir tem sido empregado, como droga de primeira escolha, em protocolos de tratamento da infecção por CMV (Bordils e cols., 2005; Biron, 2006).
O foscarnet e o cidofovir são utilizados como alternativa no tratamento de indivíduos que apresentam infecção com cepas resistentes às drogas de primeira escolha.
3.11.Desenvolvimento de Vacina
A quimioterapia antiviral é capaz de controlar, mas não chega a eliminar as infecções por CMV. Diante deste fato, medidas preventivas são necessárias para que o impacto das infecções por CMV na saúde pública, seja reduzido. No caso de imunocomprometimento, a exposição parenteral é a principal via de transmissão do CMV a qual ocorre através dos órgãos e tecidos transplantados (Davis, 1990; Marshall e Plotkin, 1993). Alguns dados corroboram a importância da profilaxia através da administração de vacina ou imunoglobulina específica anti-CMV na redução da morbidade da infecção viral, em pacientes transplantados (Marshall e Plotkin, 1993).
O desenvolvimento de vacinas anti-CMV depara com desafios importantes relacionados às características do vírus tais como infecção latente e re-infecção com novos genótipos (Kilpatrick, Huang e Pagano, 1976; Chou, 1990; Alford e Britt, 1993). Nos Estados Unidos a definição de um protocolo de vacinação anti-CMV é “prioridade nível 1” para o século XXI (Schleiss e cols., 2004).
A primeira inoculação de voluntários humanos com um “protótipo” de vacina anti-CMV foi reportada em 1974 quando a linhagem laboratorial AD-169 foi utilizada como cepa padrão atenuada. Neste experimento, dos 26 voluntários soronegativos, 25 apresentaram soroconversão, 20 tiveram pequenas reações locais à inoculação e apenas um desenvolveu sintomas realcionados à infecção viral ativa tendo apresentado linfoadenopatia e linfocitose reativa (Elek e Stern, 1974). O acompanhamento desses indivíduos mostrou que no oitavo ano após a vacinação apenas a metade apresentava imunidade específica humoral (Stern, 1984; Marshall e Plotkin, 1993).
Este mesmo tipo de vacina utilizando a cepa AD-169, foi aplicado na imunização prévia de candidatos a transplante renal, soronegativos. A análise da resposta vacinal de cinco pacientes vacinados, demonstrou que três não mostraram sinal de excreção viral, mesmo em regime de imunossupressão e apenas um apresentou sinais de infecção ativa, porém com outra cepa viral (Stern, 1984).
Atualmente, as estratégias para a produção da vacina anti-CMV vão desde a utilização de vírus atenuados, ao emprego de proteínas recombinantes ou de vetores virais que permitem a transfecção de seqüências de DNA do CMV (Adler, 1999; Schleiss e cols., 2004; Zhang e Pass., 2004; Jacobson e cols., 2006; Wang e cols., 2006; Zhang e cols., 2006). Dentre os modelos de vacinas em desenvolvimento, o mais experimentado, e que tem apresentado maior segurança e eficácia em humanos, é aquele que utiliza o vírus atenuado, da linhagem Towne (Jacobson e cols., 2006). A cepa Towne, quando utilizada de forma isolada, embora não tenha prevenido a infecção pelo CMV, atenuou a doença desenvolvida por pacientes transplantados (Pass e cols., 2001).
O uso de vacinas com amostras padrão de citomegalovírus atenuado gerou várias objeções teóricas tais como riscos à saúde de indivíduos imunocomprometidos, possibilidade de oncogenicidade viral, o risco do desenvolvimento de doença crônica (Marshall e Plotkin, 1993). Contudo, estudos que empregaram a cepa Towne demonstraram a relativa segurança e benefício desta cepa vacinal. Tais estudos indicaram que o vírus não é excretado pelas pessoas submetidas à vacinação, não induz latência e acarreta apenas reações locais à inoculação. Além disso, nenhum efeito imunossupressor foi demonstrado e não houve evidência de oncogenicidade. Na avaliação da resposta imune, foi observado uma resposta humoral funcional, assim como resposta linfoproliferativa
prolongada e resposta de linfócitos T citotóxicos. Pacientes que receberam transplante renal apresentaram proteção quanto ao desenvolvimento de doença por CMV equivalente à imunidade natural de soropositivos. Voluntários saudáveis quando expostos a baixas doses de inoculo viral mostraram-se protegidos de forma tão eficiente quanto se tivessem desenvolvido imunidade natural (Marshall e Plotkin, 1993).
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1.Modelo de estudo
Fizeram parte deste estudo 60 pacientes submetidos a transplante de órgãos sólidos e de medula do programa de transplante do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho. Foram escolhidos, para o estudo, pacientes com sintomatologia sugestiva de infecção por CMV (como febre, epigastralgia, leucopenia, anemia e reação do enxerto contra o paciente, por exemplo) e pacientes com resultado anterior positivo (período máximo de 180 dias) pela técnica de antigenemia. Os pacientes que tiveram sangue coletado para investigação diagnóstica, pela técnica de antigenemia, assinaram termo de consentimento livre e esclarecido para que o referido estudo de genotipagem do CMV pudesse ser realizado.
O modelo de Estudo empregado foi o de Coorte prospectivo, com população aberta em grupo especial formado por transplantados de medula óssea e órgãos sólidos, contendo 166 amostras de 60 pacientes.
4.2.Obtenção de leucócitos do sangue periférico
A pesquisa do ADN do CMV foi feita em leucócitos do sangue periférico segundo Chou e Dennison (1991).
O protocolo para obtenção de leucócitos de sangue periférico foi adaptado a partir do protocolo apresentado por Pacsa e colaboradores (2003). Para a obtenção dos leucócitos 4 ml de sangue total eram centrifugados a 2000rpm por 3 minutos. O sobrenadante do material centrifugado foi desprezado e as células presentes no precipitado suspensas em solução de cloreto de amônio 0,8%. As células em solução de cloreto de amônio foram incubadas, à temperatura ambiente, durante 15 minutos, para lise das hemácias. Após a lise das hemácias foi realizada uma nova centrifugação do material (2000 rpm, por 3 minutos), seguida de lavagem, por duas vezes, em PBS pH 7.4. Os leucócitos assim obtidos tiveram seu número ajustado para obtenção de uma suspensão celular de 5x105 células por mL e foram aliquotados e armazenados, em freezer, a –20ºC.
4.3.Extração do ADN viral
Leucócitos obtidos do sangue total, armazenados a -20ºC foram empregados na obtenção do ADN viral. A técnica de extração de ADN total foi desenvolvida como uma adaptação baseada nas diretrizes de protocolo de obtenção de ADN descritas por Sambrook, Fritsch e Maniatis (1989).
Um total de 400µl da suspensão celular eram adicionados a um tubo cônico com capacidade para 1,5ml. Em seguida eram adicionados, à suspensão de
leucócitos, 380µl de uma solução de acetato de sódio 0,2M e 30 µl de SDS a 10%,
com agitação da mistura, durante 30 segundos. À mistura anterior eram adicionados
450µl de fenol com agitação seguida de centrifugação do material a 6000 rpm, por 6 minutos. Após a centrifugação era feito a coleta e a transferência do sobrenadante
fenol:clorofórmio (v/v) , seguido de agitação e, na seqüência, centrifugação do material a 6000 rpm por 4 minutos. O sobrenadante obtido, após a centrifugação, era transferido para um novo tubo e a ele eram adicionados 400µl de clorofórmio. O
material, após a adição do clorofórmio, era agitado e em seguida centrifugado a 6000 rpm por 2 minutos. O sobrenadante obtido era outra vez transferido para outro tubo cônico e a ele era adicionado 1 ml de etanol absoluto gelado (4°C). Após a adição do etanol a amostra era misturada cuidadosamente e incubada por pelo menos 12 horas a -20°C, para precipitação do ADN viral.
Após incubação para precipitação do ADN, a amostra era centrifugada a 6000 rpm por 15 minutos, para obtenção do precipitado ao qual eram adicionados
500µl de etanol 70%, gelado (4°C). Após adição do etanol 70% era feito uma ligeira
e cuidadosa agitação do material seguida de centrifugação a 6000 rpm por 5 minutos. Após centrifugação o sobrenadante era desprezado e o precipitado, era
deixado em repouso, para evaporação do etanol e posterior adição de 70µl de água
destilada.
Uma vez finalizado o processo de extração, as amostras não utilizadas imediatamente eram armazenadas a uma temperatura de –20°C para posterior utilização em técnica de PCR.
4.4.Amplificação das seqüências de interesse por reação em cadeia
da polimerase aninhada
As amostras submetidas à extração de ADN foram submetidas à amplificação pela técnica da reação em cadeia da polimerase aninhada (Nested-PCR) adaptando critérios definidos por Chou e Dennison (1991). Foram realizadas,
portanto, duas reações em cadeia de polimerase (PCR) em seqüência de cada amostra tendo sido empregados iniciadores (primers) para o gene gB do CMV. Tanto para a primeira quanto para a segunda reação de PCR foi empregado um volume de 5 ul do material clínico (material resultante da extração do ADN para o 1º PCR e material resultante do 1º PCR, para o 2º PCR). Os 5ul do material clínico eram adicionados à mistura para PCR contendo 10mM Tris-HCl, 1,5mM MgCl2,
200uM de cada desoxinucleotídeo trifosfato (dNTP), 12,5 pmol de cada iniciador (primer) e 2,5 U de Taq DNA polimerase. Ambas as reações de PCR foram realizadas em termociclador ABI GeneAmp PCR System e tiveram as mesmas características quanto à temperatura e ao número de ciclos de PCR. Elas eram iniciadas com um pré-ciclo no qual era aplicado à amostra uma temperatura de 94°C, com duração de 5 minutos, para desnaturação inicial do ADN, anelamento a 55º C por 1 minuto e extensão a 72º C por 1 minuto. Após este pré-ciclo seguiam-se 40 ciclos iguais que constavam, cada um deles, de 3 diferentes temperaturas: 50 segundos a 94°C, 45 segundos a 55°C e 1 minuto a 72°C. Ao final dos 40 ciclos de reação era aplicada uma temperatura de 72º C, durante 6 minutos, para extensão.
Na primeira amplificação do ADN viral os iniciadores utilizados eram localizados nas posições de nucleotídeos gB1246 e gB1724 do gene da glicoproteína B de envelope (Tabela 1).
Já na segunda amplificação do ADN viral, os iniciadores utilizados eram localizados nas posições de nucleotídeos gB 1319 e gB 1604 do gene da glicoproteína B de envelope viral (Tabela 1).
Em todas as reações de amplificação eram empregados controles positivos e negativos de extração e de amplificação pela utilização de iniciadores para o gene
Tabela 1 - Apresentação das seqüências de cada iniciador, posicionamento do iniciador nos genes,
reações em que foram utilizados e tipo de cada iniciador. Nome do
iniciador
Seqüência do iniciador Posição no gene**
Reação em que foi utilizado Tipo de iniciador CMV-1 5’ GGAAACGTGTCCGTCTT 3’ 1241 1ª PCR Direto CMV-2 5’ GAGTAGCAGCGTCCTGGCGA 3’ 1724 1ª PCR Reverso CMV-3 5’ TGGAACTGGAACGTTTGGC 3’ 1319 2ª PCR Direto CMV-4 5’ GAAACGCGCGGCAATCGG 3’ 1604 2ª PCR Reverso
Bac-1 5’ AAGAGAGGCATCCTCACCCT 3’ 1443* Contraprova Direto Bac-2 5’ TACATGGCTGGGGTGTTGAA 3’ 2101* Contraprova Reverso
* posição do iniciador no ARN mensageiro. **posição de nucleotídeos.
4.5.Detecção do produto de amplificação
Uma vez submetidas à amplificação em duas reações consecutivas de PCR, 8ul de cada amostra e controles positivo e negativo eram submetidas à eletroforese em gel de agarose a 1,5% por 40 minutos a uma tensão de 70V. O gel era corado com brometo de etídio a uma concentração final de 0,02%, na presença do padrão
de peso molecular φx-174 DNA/Hae III Digest e visualizado com o auxílio de um transiluminador ultravioleta, 300nm.
O material não utilizado na visualização foi estocado em freezer a –20°C. Todas as amostras foram submetidas, pelo menos em duplicata, à reação de PCR. Uma amostra era considerada positiva quando apresentava uma única banda de amplificação, com peso molecular equivalente a 293 pares de base ou 296 pares de base, segundo critério de Chou e Dennison (1991) (Perfil eletroforético: figura 5, raia 8).
