4.8 Análise das fibras elásticas
4.8.2 Hematoxina férrica de Weigert com oxidação prévia com oxona a 1%
A análise de fibras elásticas por meio das seções coradas com Weigert oxidação prévia
com oxona 1%, foi utilizada para identificação das fibras elásticas maduras e oxitalânicas
(fibras jovens) (Figura 20A). As fotomicrografias nos 7° e 14º dia pós-queimadura, revelam a
insulina tópica foi capaz de acelerar a síntese dessas fibras elásticas oxitalânicas, nos animais
diabéticos (DI), de maneira semelhante ao padrão de síntese verificado no grupo CP (Figura
20B). 10x e os inserts 40x.
Figura 20. (A) Fotomicrografia das seções da pele intacta dos animais controles e diabéticos
coradas com Weigert com oxidação prévia com oxona 1%. 10x e os inserts 20x. (B)
Fotomicrografia das seções coradas com Weigert com oxidação prévia com oxona 1%,
mostrando que a insulina tópica estimulou a síntese de fibras elásticas oxitalânicas no grupo
DI, semelhante ao grupo CP, nos 7º e 14º dias pós-queimadura. 10x e os inserts 40x.
4.8.3 Weigert sem oxidação prévia com oxona 1%
A análise de fibras elásticas por meio das seções coradas com Weigert sem oxidação
prévia com oxona 1%, foi utilizada para identificação das fibras elásticas maduras e
eulanínicas (parcialmente maduras) (Figura 21A). As fotomicrografias do 7° pós-queimadura
mostram que a insulina tópica foi capaz de estimular a síntese de fibras eulanínicas nos
animais (CI e DI), de maneira semelhante à síntese observada nos animais CP, embora nesta
data de extração essas fibras encontrassem-se delgadas e desorganizadas. No 14º dia pós-
queimadura, as seções demonstram que a insulina tópica manteve o padrão acelerado de
síntese nos animais CI e DI, quando comparado ao retardo observado no grupo DP. Vale
ressaltar a maior organização das fibras elásticas eulanínicas nos grupos que receberam o
tratamento tópico com a insulina (CI e DI) no 14º pós-queimadura (Figura 21B). 10x e os
Figura 21
Figura 21. (A) Fotomicrografia das seções da pele intacta dos animais controles saudáveis e
diabéticos coradas com Weigert sem oxidação prévia com oxona 1%. 10x e os inserts 20x.
(B) Fotomicrografia das seções coradas com Weigert sem oxidação prévia com oxona 1%,
mostrando que a insulina tópica estimulou a síntese e a organização de fibras elásticas
5
5 DISCUSSÃO
A cicatrização de feridas é um processo complexo, dinâmico que envolve eventos
celulares e moleculares (63). As queimaduras apresentam diferenças importantes quanto ao
processo de cicatrização quando comparado ao de outros modelos de feridas, como as
incisionais ou excisionais, visto que as feridas de queimadura podem comprometer
profundamente as camadas da pele, provocando um atraso da fase inflamatória, formação de
extensa crosta e retardo na reepitelização (6).
O processo de cicatrização das queimaduras torna-se mais comprometido quando
associado ao DM, que é caracterizado por um processo de cicatrização deficitário, com
reduzida atividade de fatores de crescimento pró-angiogênicos, atenuada resposta
inflamatória e diminuída produção de quimiocinas e citocinas, fundamentais no processo de
reparo tecidual (70, 71).
Ensaio clínico (48) e estudos experimentais (72, 73) descrevem os benefícios do
tratamento da insulina tópica em pacientes, animais saudáveis e diabéticos. Entretanto os
mecanismos celulares e moleculares pelos quais a insulina melhora e acelera o processo de cicatrização das feridas de queimaduras não está totalmente compreendido.
As análises macroscópicas das feridas de queimaduras revelaram que a insulina
tópica foi capaz de remover rapidamente a crosta presente sobre a lesão, assim como a
redução da área lesionada nos animais (CI e DI), de maneira semelhante aos animais do
grupo CP. A presença da crosta seca pode promover um atraso do processo de cicatrização
das feridas (74), e a manutenção do meio úmido do leito das feridas é responsável por acelerar
a regeneração epidermal (75).
As análises histológicas das seções coradas com H&E confirmaram os achados
macroscópicos, que a insulina tópica foi capaz de acelerar o processo de cicatrização das
sem tratamento com insulina tópica, quando comparado aos animais do grupo DP. Esses
achados corroboram com o estudo de Schäffer, et al (1997) (76), descreve o tratamento com
insulina levando ao aumento da epitelização e proliferação e formação de fibras colágenas
maduras acelerada. Estudo recente demosntrou que insulina encapsulada dentro de uma
esponja de Alginato (PLGA) acelerou o processo de cicatrização de queimaduras e restarou
a integridade cutânea, com resolução da fase inflamatória, aumento da angiogênese e
adequado depósito e maturação do colágeno (77). Reforçando nossos achados e
demonstrando a função que a insulina excerce sobre o processo de cicatrização.
Quanto às análises da morfologia da área da lesão observamos que a insulina tópica
foi capaz de recuperar o recrutamento de células inflamatórias no 7° dia pós-queimadura nos
animais diabéticos (DI), de forma semelhante ao infiltrado de células inflamatórias evidenciado
nos animais saudáveis (CP e CI).
A MCP-1 (proteína quimiotática de monócito 1), também conhecida como CCL2, é produzida dentro de feridas, em concentrações fisiológicas, e é um importante regulador
positivo do recrutamento de monócitos - macrófagos para o sítio da lesão (21, 78). No 7 dia pós queimadura, a imunomarcação para MCP-1 foi maior entre os grupos CP, CI e DI, quando
comparada ao grupo DP. Entretanto, no 14 dia pós queimadura a imunomarcação para MCP- 1, foi reduzida nos grupos (CP, CI e DI), quando comparado ao grupo DP, comprovando o
retardo do recrutamento de monócitos-macrófagos. A literatura aponta que a presença inicial
de macrófagos M1, um fenótipo pró-inflamatório, tem sido associada ao aumento na atividade
de fagócitos, proteção do tecido contra infecção bacteriana e limpeza da área lesionada (79).
As análises realizadas para marcação de macrófagos em atividade, por meio do
anticorpo F4/80 mostraram que a insulina foi capaz de acelerar e recuperar o recrutamento
de macrófagos no 7º dia do processo de cicatrização nos animais diabéticos. Nesta mesma
data de extração (7 dia), os animais do grupo DP apresentaram a imunomarcação para F4/80 quase que inexistente, comprovando um atraso no recrutamento das células imunes nesse
grupo de animais.
Nossos resultados demonstraram aumento na expressão das citocinas pró- inflamatórias, IL-1 β e IL-6 no 7º dia pós-queimadura quando comparado aos grupos controles
na presença ou não da insulina após a queimadura. Em relação ao 14º dia houve aumento na expressão da citocina IL-1β. Sugerindo que a presença do macrófago e sua atividade,
confirmado por meio da imunomarcação com o anticorpo F4/80 é uma via importante para
ação da insulina e o processo de cicatrização, contribuindo com melhor resolução da fase
inflamatória.
A IL-10, citocina anti-inflamatória, contribui na redução da inflamação e na formação
da cicatriz e é secretada pelos macrófagos M2. Outros estudos (77, 80, 81) que investigaram
a cicatrização de queimaduras e insulina observaram que a expressão da IL-10 foi bifásica,
na fase inicial por volta do 3º e 9º dias pós-lesão. Estes achados vão ao encontro dos nossos
resultados onde observamos aumento da IL-10 no 7º dia após a lesão queimadura. Nossos resultados não demonstram expressão da IL-10 de forma bifásica, o que pode estar
relacionado ao tempo entre a realização da queimadura e a coleta tardia do material (14º dia
após a queimadura). Visto que o estudo que observou a expressão bifásica, a extração da
ferida ocorreu entre o 3º e 9º dia após queimadura (77).
As citocinas pró-inflamatórias são responsáveis por encerrar a resposta inflamatória e
contribuem para angiogênese, deposição de matriz, e remodelação (10). Nossos resultados mostraram que a insulina tópica melhora a expressão do TGFβ1, VEGF e α-SM actin no 14º
dia pós-queimadura. O TGF-β, juntamente com o PDGF, induzem a diferenciação dos
fibroblastos em miofibroblastos que expressam α−actina, α−miosina e desmina (15). Neste
estudo, essa imunomarcação foi utilizada com a proposta de identificar a presença de vasos
sanguíneos maduros (82), mas também pode estar relacionada à imunomarcação de pericitos
(células murais de capilares e vênulas), em áreas ricas com células progenitoras (83, 84).
partir de vasos sanguíneos adjacentes à ferida (angiogênese) e o FGF, o VEGF e o TGF-β
são os principais agentes angiogênicos (28). O VEGF e TGF-β1 estão envolvidos na
estimulação, promoção e estabilização de novos vasos sanguíneos (85). O VEGF induz a
angiogênese através da proliferação de células endoteliais e da prevenção da apoptose.
Durante o processo de reparo tecidual, a angiogênese exerce papel na suplementação de
nutrientes e oxigênio e acelera a formação do tecido de granulação (86). De acordo com
estudos, a insulina é capaz de estimular a angiogênese no processo de cicatrização (4, 29,
87). Nossos achados reforçam que o tratamento tópico com insulina modula a fase
proliferativa da lesão, por meio de fatores de crescimento.
As análises realizadas para investigação de células em proliferação por meio do
anticorpo Ki67 demonstraram que os animais que receberam o tratamento tópico com insulina
no 14º dia pós-queimadura apresentaram maior imunomarcação. Vale ressaltar que as células
em proliferação imunomarcadas pelo anticorpo Ki67 apresentaram aspecto mais organizado do epitélio em formação nos animais diabéticos que receberam o tratamento tópico com
insulina, em relação ao grupo diabético placebo.
Os fibroblastos produzem TGF-β, FGF, TIMPs (inibidores de metaloproteinases) e
KGF, sendo este último, com ação efetiva na reepitelização (15, 88) na proliferação e migração de queratinócitos no reparo tecidual. IL-1β, IL-6 e TNF-α foram identificadas como
estimuladores da expressão KGF em fibroblastos (89-91).
Os componentes fibrosos da matriz extracelular são classificados microscopicamente
em três tipos de fibras: colágenas, reticulares e elásticas. A produção de colágeno é um dos
principais fatores na migração e proliferação epidermal e o atraso do processo de cicatrização
das feridas diabéticas também está associada com a redução da síntese das fibras colágenas
(92). Estudo recente de nosso laboratório demonstrou que a insulina tópica melhora e acelera
a síntese, deposição e organização das fibras de colágeno, no 14º dia pós-queimadura, com
I, em malha pantográfica, no processo de cicatrização de queimaduras de segundo grau, em
ratos diabéticos (59).
Os nossos resultados demonstraram que a insulina tópica foi capaz de acelerar a
síntese e a organização de fibras elásticas nos animais diabéticos. Sendo que o diabetes
provoca alterações estruturais das fibras elásticas maduras e elaunínicas, responsáveis pela
elasticidade e redução da densidade de fibras oxitalânicas, responsáveis pela resistência.
Estas alterações promovem perda da complacência tecidual (93).
6
6 CONCLUSÃO
Em síntese, este estudo demonstrou que a insulina tópica modula a fase inflamatória
e proliferativa das lesões por queimadura de segundo grau em animais diabéticos induzidos
por estreptozotocina. Nossos resultados demonstraram fortes evidências que ocorre um
melhor recrutamento de citocinas pró-inflamatórias, melhor migração de macrófagos para
área lesionada, aumento da angiogênese, aumento da proliferação e migração celular, assim
como elastogênese. Sugerimos que a insulina tópica seja uma terapêutica eficaz em lesões
7
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