UNIVERSIDADE ESTADUAL DE
CAMPINAS
Faculdade de Enfermagem
FLÁVIA FIGUEIREDO AZEVEDO
INSULINA TÓPICA MODULA A FASE INFLAMATÓRIA E
PROLIFERATIVA DO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO DE
QUEIMADURAS EM RATOS DIABÉTICOS
CAMPINAS
2016
FLÁVIA FIGUEIREDO AZEVEDO
INSULINA TÓPICA MODULA A FASE INFLAMATÓRIA E
PROLIFERATIVA DO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO DE
QUEIMADURAS EM RATOS DIABÉTICOS
Tese apresentada à
Faculdade de Enfermagem da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do título
de Doutora em Ciências da Saúde na Área
de Concentração: Enfermagem e Trabalho.
SupervisorOrientador: Profa. Dra. Maria Helena Melo Lima
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL
TESE DEFENDIDA PELO ALUNO FLÁVIA FIGUEIREDO
AZEVEDO, E ORIENTADA PELO PROFA. DRA. MARIA
HELENA MELO LIMA
CAMPINAS
2016
Orientador (a) PROF(A). DR(A) MARIA HELENA DE MELO LIMA
MEMBROS:
1. PROF(A). DR(A) MARIA HELENA DE MELO LIMA
2. PROF(A). DR(A) MÔNICA ANTAR GAMBA
3. PROF(A). DR(A) MARIA ESMÉRIA COREZOLA DO AMARAL
4. PROF(A). DR(A) PATRÍCIA JACQUELINE THYSSEN
5. PROF(A). DR(A) ELIANA PEREIRA DE ARAÚJO
Ata de Defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontram-se no Processo de
Vida Acadêmica do Aluno.
Programa de Pós-Graduação em Enfermagem da Faculdade de Enfermagem da
Universidade Estadual de Campinas
Às minhas filhas,
Preliminarmente, agradeço a Deus.
AOS FAMILIARES...
Ao meu querido marido Pablo Prieto de Azevedo pelo apoio e paciência nos
momentos de ausência e cansaço. E por dividir comigo todas as angústias e conquistas
desta etapa como estudante.
...aos meus pais, Antônio Fontes Figueiredo e Maria José Bacurau
Figueiredo, por me ensinarem as virtudes do ser humano: HONESTIDADE, RESPEITO
e DEDICAÇÃO. Aqui meu ETERNO AGRADECIMENTO pelo incentivo e amor
incondicional.
À minha querida irmã Fernanda Figueiredo Gannam pela motivação e incentivo
constante.
AOS MENTORES E AMIGOS...
À Profa. Dra. Maria Helena Melo Lima, minha orientadora, pela competência
científica, acompanhamento do trabalho, pela disponibilidade, pelo carinho e
generosidade, assim como pelas críticas, correções e sugestões relevantes feitas
durante a orientação. Exemplo de mestre e profissional. Meu sincero agradecimento.
À Professora Dra. Carla Roberta Oliveira Carvalho por ter me recebido de
braços abertos em seu laboratório, pelo apoio e todos os ensinamentos fundamentais
nessa jornada.
Ao Professor Dr. Edson Aparecido Liberti por todo aprendizado, atenção e ter
contribuído grandemente com a realização de todas as análises histológicas das fibras
colágenas e elásticas. Pelo exemplo de professor e de dedicação ao ensino.
À Pós-doutoranda Ana Flávia Marçal Pessoa a quem agradeço em especial,
trabalho e muito aprendizado.
Aos meus colegas do Laboratório de Sinalização Celular: Layanne, Vitor Felitti
e Caio Jordão.
Ao querido Cruz Alberto Mendoza Rigonati (Júnior) pela paciência,
disponibilidade e por todos os ensinamentos na realização das técnicas histológicas.
À Dioze Guadagnini (UNICAMP) pela disponibilidade, pelo carinho e auxilio
técnico nas dosagens das citocinas pela técnica de Elisa.
À Marta Maria da Silva Righetti (Laboratório Multiusuário do Departamento de
Anatomia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo), meu
muito obrigada pelo carinho, dedicação e aprendizado durante as diferentes colorações
Não sei se a vida é curta
ou longa demais para nós.
Mas sei que nada do que fazemos tem sentido
se não tocarmos o coração das pessoas.
Para isto basta ser.
Colo que acolhe!
Braço que envolve!
Palavra que consola!
Silêncio que respeita!
Lágrima que corre!
Olhar que acaricia!
Amor que promove!
E isso não é coisa do outro mundo.
Mas é o que dá sentido à vida.
É o que faz com que ela
Não seja nem curta, nem longa demais.
Mas, que seja intensa, verdadeira,
pura, enquanto durar.
Introdução: As queimaduras são feridas causadas pela exposição a um agente de origem
elétrica, radioativa, química ou térmica, caracterizadas por atraso da resposta inflamatória.
Evidências experimentais demonstraram que a insulina tópica acelera a reconstrução tecidual
de feridas incisionais em ratos diabéticos. Todavia, não está totalmente esclarecido os
mecanismos celulares e moleculares do processo de cicatrização e o uso da insulina em
feridas por queimaduras. Objetivo: Analisar o efeito da insulina tópica no processo de
cicatrização de queimaduras de segundo grau usando animais diabéticos induzidos com
estreptozotocina. Material e métodos: Ratos machos foram divididos em quatro grupos:
controles tratados com creme placebo (CP), controles tratados com insulina tópica (CI),
diabéticos tratados com creme placebo (DP) e diabéticos tratados com insulina tópica (DI). A
queimadura foi realizada por meio de um molde (1 cm2) aquecido à 120 °C, exposto na pele
do dorso de cada animal, durante 20 segundos. Ratos queimados receberam tratamento
tópico com creme placebo ou insulina, uma vez ao dia. Nos 7º e 14º dias após a indução da
queimadura foi realizada a extração da área da ferida para seguintes análises: Elisa,
imuno-histoquímica, imunoblotting e histológica. Resultados: No 7° dia pós-queimadura, os animais
do grupo DI apresentaram maior expressão das citocinas pró-inflamatórias (IL-1 e IL-6), quando comparado ao grupo DP (p<0,05) e maior imunomarcação para MCP-1 (proteína
quimioatraente de monócito- 1, p<0,05), anti-F4/80 (marcador de macrófago em atividade,
p<0,05) e TGF-1(p<0,05). No 14° dia pós-queimadura, nos animais do grupo DI foi observado maior imunomarcação ocre positiva dos fatores pró-angiogênicos (TGF-β1 e
VEGF), p<0,05 e da α-actina de músculo liso (α-SMA), presente em vasos sanguíneos
maduros (p<0,05), quando comparado ao grupo DP. Os animais diabéticos que receberam o
tratamento tópico com insulina mostraram (DI) elevada proliferação celular (anti-Ki67, p<0,05),
quando comparado ao grupo DP. As colorações de Verhöeff e Weigert mostraram que a
insulina tópica acelerou a síntese e a organização de fibras elásticas. Conclusão: O
Palavras-chave: insulina – queimaduras – inflamação – fibras elásticas – enfermagem. Linha de pesquisa: Processo de Cuidar em Saúde e Enfermagem.
Introduction: Burns are wounds caused by exposure to an electrical source agent, radioactive,
chemical or thermal, characterized by delayed inflammatory response. Experimental evidence
has shown that the topical insulin accelerates tissue reconstruction incisional wounds in
diabetic mice. Though it is not fully clarified the molecular and cellular mechanisms of the
healing process and the use of insulin injured by burns. Objective: To analyze the effect of
topical insulin on the healing of second-degree burns process using diabetic rats induced with
streptozotocin. Methods: Male rats were divided into four groups: controls treated with placebo cream (CP), controls treated with topical insulin (CI), diabetics treated with placebo cream (DP)
and diabetics treated with topical insulin (DI). The burn was conducted by means of a mold (1
cm2) heated to 120° C above the skin of the dorsum of each animal during 20 seconds. Burned
rats received topical treatment with placebo cream or insulin (PI 0705370-3) once daily. In 7
and 14 days post burn was performed wound area extraction to following analyzes: ELISA,
immunohistochemistry, immunoblotting and histological staining with Verhöeff and Weigert, for
evaluation of elastic fibers. Results: On 7th day post burn, animals in the DI group had a greater
expression of pro-inflammatory cytokines (IL-1 and IL-6), compared to the DP group (DI vs. DP, p <0.05) and greater ocher immunohistochemistry positive for MCP-1 (monócito- chemoattractant protein 1, p <0.05), F4/80 (macrophage marker activity, p <0.05) and
TGF-1, p <0.05. On the 14th day after burn, the animals in the DI group observed a higher positive
immunostaining ocher of pro-angiogenic factors (TGF-β1 and VEGF), p <0.05 and α-smooth
muscle actin (α-SMA) present on mature blood vessels, p <0.05, compared to the DP group.
Topical Insulin also showed increased cell proliferation (anti-Ki67, p <0.05) in the diabetic
animals (DI), when compared to the DP group. For Verhöeff and Weigert staining observed
that the topical insulin accelerated synthesis and organization of elastic fibers. Conclusion:
Treatment with topical insulin accelerated the wound healing in diabetic animals by the
recovery of the inflammatory response, angiogenesis, cell proliferation and migration as well
Figura 1. Representação esquemática da composição da pele...23 Figura 2. Fotomicrografia realizada em microscopia eletrônica demonstrando a característica
das fibras colágenas, elásticas e oxitalânicas...28
Figura 3. Representação esquemática do sistema fibrilar de colágeno e microfibrila
elastina...29
Figura 4. Composição dos grupos experimentais...37 Figura 5. Imagem do molde para realização da queimadura de segundo-grau
experimental...39
Figura 6. Desenho experimental...41 Figura 7. Representação esquemática da extração do tecido (pele - ferida) ...42 Figura 8. Esquema de seleção de campos para as análises das marcações por
imuno-histoquímica...47
Figura 9A. Imagens da cicatrização das feridas dos animais controles e diabéticos, de acordo
com os tratamentos tópicos recebidos (creme placebo e insulina tópica), nos 7° e 14° dia
pós-queimadura...54
Figura 9B. Área das feridas de queimaduras (porcentagem), no 7° dia pós-queimadura e no
14° dia pós-queimadura...54
Figura 10A. Fotomicrografia da morfologia das feridas dos animais controles e diabéticos, de
acordo com os tratamentos tópicos recebidos (creme placebo e insulina tópica), nos 7º e 14º
dias pós-queimadura, com a coloração de hematoxilina e eosina (H&E)...56
Figura 10B. Reepitelização das feridas de queimaduras (porcentagem), no 7º dia
pós-queimadura e no 14° dia pós-pós-queimadura...57
Figura 11. Fotomicrografia das seções coradas com H&E nos 7º e 14º dias
pós-queimadura...59
Figura 11A. Análise quantitativa do número de células inflamatórias nos grupos nos 7º e 14º
Figura 12(A-D). Concentração das citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6) e
anti-inflamatória (IL-10) do homogenato das feridas de queimadura, nos 7º e 14º dias
pós-lesão...62
Figura 13. Fotomicrografia de marcação imuno-histoquímica para MCP-1 das áreas das
feridas de queimaduras tratada com creme placebo e insulina tópica em animais controles
(CP e CI) e diabéticos induzidos (DP e DI), nos 7º e 14º dias pós-queimadura...64
Figura 13A. Análise quantitativa da área com imunomarcação de anti-MCP-1...65 Figura 14. Fotomicrografia de marcação imuno-histoquímica para F4/80 das áreas das feridas
de queimaduras tratadas com creme placebo e insulina tópica em animais controles (CP e CI)
e diabéticos induzidos (DP e DI), nos 7º e 14º dias pós-queimadura...67
Figura 14A. Análise quantitativa da área com imunomarcação de anti-F4/80...68 Figura 15. Fotomicrografia de marcação imuno-histoquímica para TGF-β1 das áreas das
feridas de queimaduras tratadas com creme placebo e insulina tópica em animais controles
(CP e CI) e diabéticos induzidos (DP e DI), nos 7º e 14º dias pós-queimadura...70
Figura 15A. Análise quantitativa da área com imunomarcação de anti-TGF-β1...71 Figura 16. Fotomicrografia de marcação imuno-histoquímica para VEGF das áreas das
feridas de queimaduras tratadas com creme placebo e insulina tópica em animais controles
(CP e CI) e diabéticos induzidos (DP e DI), nos 7º e 14º dias pós-queimadura...73
Figura 16A. Análise quantitativa da área com imunomarcação de anti-VEGF...74 Figura 17. Fotomicrografia de marcação imuno-histoquímica para α-SMA das áreas das
feridas de queimaduras tratadas com creme placebo e insulina tópica em animais controles
(CP e CI) e diabéticos induzidos (DP e DI), nos 7º e 14º dias pós-queimadura...76
Figura 17A. Análise quantitativa da área com imunomarcação de anti-α-SMA...77 Figura 18. Fotomicrografia de marcação imuno-histoquímica para Ki67 das áreas das feridas
de queimaduras tratadas com creme placebo e insulina tópica em animais controles (CP e CI)
coradas com Verhoeff...81
Figura 19B. Fotomicrografia das seções coradas com Verhoeff nos 7º e 14º dias
pós-queimadura sem evidencia de presença de fibras elásticas maduras...82
Figura 20A. Fotomicrografia das seções da pele intacta dos animais controles e diabéticos
coradas com Weigert com oxidação prévia com oxona 1%...83
Figura 20B. Fotomicrografia das seções coradas com Weigert com oxidação prévia com
oxona 1%, mostrando que a insulina tópica estimulou a síntese de fibras elásticas oxitalânicas
no grupo DI, semelhante ao grupo CP, nos 7º e 14º dias pós-queimadura...84
Figura 21A. Fotomicrografia das seções da pele intacta dos animais controles saudáveis e
diabéticos coradas com Weigert sem oxidação prévia com oxona 1%...86
Figura 21B. Fotomicrografia das seções coradas com Weigert sem oxidação prévia com
oxona 1%, mostrando que a insulina tópica estimulou a síntese e a organização de fibras
Tabela 1. Padronização da imuno-histoquímica...46 Tabela 2. Glicemia capilar em jejum, peso e consumo de ração e água/dia antes e após a
α-SMA – α-actina de músculo liso AKT – proteína treonina quinase DM – Diabetes mellitus
DNA – ácido desoxirribonucleico DTT – ditiotreitol
ECL – sistema de detecção de quimiluminescência ECM – matriz extracelular
EDTA – ácido etilenodiamino tetra-acético EGF – fator de crescimento epidermal eNOS – óxido nítrico sintetase
ERK1/2 – quinase 1/2 regulada por sinal extracelular FGF – fator de crescimento de fibroblastos
Grb – proteína adaptadora
GSK3 – glicogênio sintase quinase-3 H2O2 – peróxido de hidrogênio
IGF – fator de crescimento semelhante a insulina IL-10 – interleucina-10 IL-1α – interleucina-1α IL-1β – interleucina-1β IL-6 – interleucina-6 IM – intra-muscular IP – intra-peritoneal IR – receptor de insulina
IRS-1/2/3/4 – substrato do receptor de insulina IV – intra-venoso
KGF-1 – fator de crescimento de queratinócitos- 1 M1 – macrófago tipo 1
M2 – macrófago tipo 2
MAPK – proteína quinase ativadora da mitogênese MCP-1 – proteína quimiotática de monócitos- 1 MMP-9 – metaloproteinase- 9
mSOS – fator permutador de guanina P21 Ras – proteína intracelular
PDGF – fator de crescimento derivado de plaqueta PI 3-quinase – enzima fosfatidilinositol 3-quinase PMNs – leucócitos polimorfonucleares
PMSF – fluoreto de fenilmetanossulfonil
RANTES – regulada sob ativação, expressa e secretada por células T normais RNA – ácido ribonucleico
SCQ – superfície corpórea queimada
TSCQ – total da superfície corpórea queimada SD – desvio
SDF-1α – fator derivado do estroma 1-α SH2 – proteína com domínio SH2 Shc – intermediário Shc
STZ – estreptozotocina
SUS – Sistema Único de Saúde
TGF-β – fator de crescimento transformante TNF-α – fator de necrose tumoral-α
1 INTRODUÇÃO ... 21
1.1 Queimaduras ... 21
1.2 Composição da pele... 22
1.3 O processo de cicatrização ... 24
1.4 Papel da colagênese e elastogênese no processo de cicatrização ... 27
1.5 Diabetes mellitus ... 29
1.6 Insulina tópica ... 30
2 OBJETIVO ... 35
3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 37
3.1 Animais de experimentação ... 37
3.2 Indução do diabetes ... 37
3.3 Modelo de ferida de queimadura de segundo grau ... 38
3.4 Caracterização dos grupos experimentais ... 39
3.5 Tratamento das queimaduras com insulina tópica ... 40
3.6 Determinação da área da ferida de queimadura ... 40
3.7 Acesso e retirada dos tecidos ... 41
3.8 Preparo das amostras para estudo histológico ... 42
3.8.1 Estudo histológico da reepitelização, infiltrado inflamatório e vasos
sanguíneos ... 42
3.8.2 Estudo histológico das fibras elásticas ... 43
3.9 Reação de imuno-histoquímica (IHQ) ... 44
3.10 Determinação das citocinas pela técnica de ELISA ... 48
3.11 Análise estatística ... 49
3.12 Aspectos éticos ... 50
4.2 Análise morfométrica e histológica (H&E) ... 53
4.3 Análise do infiltrado inflamatório e vasos sanguíneos ... 57
4.4 Análise das citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6) e
anti-inflamatória (IL-10) no homogenato das feridas de queimaduras nos 7º e 14º dias
pós-lesão... 60
4.5 Análise da infiltração de macrófagos ... 63
4.5.1 Análise imunohistoquímica do MCP-1 ... 63
4.5.2 Análise imunohistoquímica do F4/80 ... 65
4.6 Análise da angiogênese... 68
4.6.1 Análise imunohistoquímica do TGF-β1 ... 68
4.6.2 Análise imuno-histoquímica do VEGF ... 71
4.6.3 Análise imunohistoquímica da α- actina de músculo liso (α-SMA) .. 74
4.7 Análise da proliferação celular ... 77
4.7.1 Análise imunohistoquímica do Ki67 ... 77
4.8 Análise das fibras elásticas ... 80
4.8.1 Verhoeff ... 80
4.8.2 Hematoxina férrica de Weigert com oxidação prévia com oxona a 1%83
4.8.3 Weigert sem oxidação prévia com oxona 1% ... 85
5 DISCUSSÃO ... 90
6 CONCLUSÃO ... 96
7 REFERÊNCIAS ... 105
8 APÊNDICE ... 111
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Queimaduras
Queimaduras são apontadas entre as causas acidentais mais frequentes em todo o
mundo, sendo responsáveis por aproximadamente 300.000 mortes a cada ano, que as torna
um grave problema aos serviços de saúde (1, 2).
A Organização Mundial de Saúde estima que 95% dos acidentes acontecem em
países de baixa e média renda. No Brasil, as queimaduras aumentam as taxas de
morbimortalidade por causas externas e cerca de 63 milhões são gastos pelo Sistema Único
de Saúde (SUS) (3, 4). Nos Estados Unidos aproximadamente dois milhões de pessoas são
vítimas de queimadura, 80.000 são hospitalizadas e 6.500 morrem a cada ano (1, 2).
Dados do Ministério da Saúde apontam que 27% dos acidentes com queimaduras tem
como vítimas crianças menores de nove anos e 91,6% dos acidentes apresentam como
cenário o domicílio, que evidencia e reforça a magnitude epidemiológica do problema (3).
Trata-se de ferimentos extremos causados por curta ou longa exposição a um agente de
origem térmica, elétrica, radioativa ou química (5).
As queimaduras são classificadas quanto a profundidade e extensão ou superfície corpórea queimada (SCQ). Quanto ao comprometimento tecidual (profundidade), as
queimaduras são classificadas em primeiro, segundo e terceiro grau (5, 6).
As queimaduras de primeiro grau atingem apenas a epiderme, tendo como aspectos
principais eritema e ardor da pele, como as queimaduras solares. Já as queimaduras de
segundo grau há dano da epiderme e parte da derme, caracterizada por eritema, presença de
flictemas e são extremamente dolorosas. Histologicamente apresentam vasodilatação
acentuada na derme e necrose coagulativa. As queimaduras de terceiro grau promovem a
acometer além do tegumento, músculo, tendão e osso. Nesse tipo de queimadura a pele se
apresenta com aspecto esbranquiçado ou marmóreo, com redução da elasticidade tecidual,
tornando-se rígida (5-8).
Pacientes que apresentam o total da superfície corpórea queimada maior que 20 –
25% podem desenvolver alterações sistêmicas que tem influência direta na sobrevida, pois
as feridas de queimaduras são uma importante fonte de mediadores inflamatórios que causam
o hipermetabolismo, perda de massa muscular, podendo levar o paciente à falência de
múltiplos órgãos (5).
Apesar dos avanços no cuidado às queimaduras, são evidentes as complicações como
imunossupressão, aumento da susceptibilidade para sepse, complicações na cura da ferida e
falência múltipla dos órgãos. Entretanto a infecção é a principal causa de mortalidade em
pacientes queimados, em virtude do comprometimento do sistema tegumentar, principal
barreira de defesa contra infecções e acentuada liberação de mediadores inflamatórios (1, 9, 10).
1.2 Composição da pele
A pele é o maior órgão do corpo, representando em média 16% do peso corporal,
responsável por múltiplas funções orgânicas e fisiológicas, como barreira mecânica e
termorregulação (11, 12) e constituída por dois principais componentes (ou camadas), a
epiderme e a derme.
A epiderme é a camada mais externa, em contato com o meio externo, formada por
um epitélio estratificado pavimentoso queratinizado e diversas camadas: basal ou
germinativa, espinhosa, granulosa, lúcida e córnea. A base da epiderme é formada somente
por queratinócitos, ligados à membrana basal e que separa a epiderme da derme. Esse tipo
as camadas mais superficiais do epitélio (5, 12).
A derme é constituída por um compartimento celular (que é tipicamente composta por
fibroblastos) e outro acelular (componentes da matriz extracelular) (13). Entretanto sua
composição pode ser detalhada pela presença de duas camadas. Camada papilar, delgada,
formada por tecido conjuntivo frouxo que dá origem às papilas dérmicas. Estão presentes
nesta camada, fibrilas especiais de colágeno, inserindo-se na membrana basal de um lado, e
de outro, penetram profundamente na derme (junção dermo-epidérmica). Estas ajudam na
fixação da derme à epiderme, além de facilitar a nutrição das células da epiderme, pelos vasos
sanguíneos presentes na camada reticular da derme. Camada reticular, mais espessa,
formada por tecido conjuntivo denso. Tanto a camada papilar, quanto esta camada em
questão possui muitas fibras do sistema elástico. Encontram-se também nessa camada,
vasos sanguíneos, nervos, folículos pilosos, glândulas sebáceas e glândulas sudoríparas (5,
11, 12).
1.3 O processo de cicatrização
O processo de cicatrização é extremamente complexo e dinâmico. Consiste em fases
como a inflamação, formação do tecido de granulação (proliferação), reepitelização e
remodelamento (12, 14, 15). Essas fases não ocorrem isoladamente e são reguladas por
mecanismos celulares e bioquímicos que interagem entre si, como: componentes da matriz
extracelular, células residentes (queratinócitos, fibroblastos, células endoteliais, células
nervosas), leucócitos (neutrófilos, monócitos/macrófagos, linfócitos), mediadores de natureza
lipídica (prostaglandinas, leucotrienos, fator de agregação plaquetária) e proteínas (citocinas,
quimiocinas, fatores de crescimento, receptores, proteases e seus inibidores) (16-19).
Os fatores de crescimento são os mediadores do processo de cicatrização que
controlam a interação célula-célula e matriz celular e ocupam papel de destaque na reparação
tecidual (16, 18). Diante da presença da lesão inicia-se imediatamente o processo de reparo
tecidual com o objetivo de restaurar o tecido lesionado, assim como sua funcionalidade (14).
A hemostasia e a quimiotaxia de células imunes são aspectos fundamentais e que
caracterizam o início da fase inflamatória(20).
A lesão do tecido causa danos celulares, destruição de vasos sanguíneos e
consequentemente o extravasamento de sangue e seus constituintes, provocando
degranulação de plaquetas e ativação das cascatas de coagulação e do complemento (16).
A formação do coágulo é capaz de restabelecer a coagulação e dar início a formação
da matriz extracelular provisória para que seja possível a migração celular. As plaquetas por
sua vez, liberam grânulos que funcionam como um reservatório para proteínas biologicamente ativas, tais como RANTES (CCL5), trombina, fator de crescimento transformante-β (TGF-β),
fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) (15) e fator de crescimento vascular
endotelial (VEGF) (16). Essas proteínas atuam como quimioatraentes para várias células
inflamatórias, incluindo monócitos. Outra importante quimiocina que atrai monócitos ao leito
importante regulador positivo do recrutamento de macrófagos para sítios de lesão (21). A
MCP-1 é produzida por uma variedade de células, incluindo células musculares lisas (22),
leucócitos, células endoteliais e fibroblastos (21).
A fase inflamatória é de extrema importância para o reparo tecidual. Células
polimorfonucleares (PMNs) ou neutrófilos são as primeiras células inflamatórias a chegarem
ao leito da lesão e são responsáveis por realizarem a limpeza da área da ferida, removendo
debris celulares, partículas estranhas e bactérias. Essas células são essenciais para o
sucesso do processo de cicatrização e secretam citocinas pró-inflamatórias como interleucina -1α (IL-1α), interleucina -1β (IL-1β), interleucina -6 (IL-6), fator de necrose tumoral (TNF-α) e
o fator de crescimento transformante (TGF-β) (18, 23, 24), que são responsáveis pelo
movimento e infiltração celular, necessários para a reparação do tecido e regulam aspectos
importantes da inflamação da ferida (18). Depois de exercerem sua função, os neutrófilos são
depletados da área da ferida juntamente com os produtos de degradação da ferida e fagocitados pelos macrófagos. Entre 48-72 horas após o ferimento há a quimiotaxia de
monócitos, que são ativados e se diferenciam em macrófagos. Dentro de três a cinco dias
após a lesão, os macrófagos são as células mais importantes nessa etapa do processo de
cicatrização e revela que esse tipo celular tem um grande papel na resolução da fase
inflamatória e, consequentemente, na transição desta etapa para a fase proliferativa (20).
Os macrófagos envolvidos no processo de reparo tecidual podem exibir dois diferentes
fenótipos (denominados pelas siglas M1 e M2), ambos com origem na medula óssea (20, 25).
Os macrófagos M1 são os classicamente ativados, também denominados macrófagos
residentes. Os macrófagos M2 são células ativadas alternativamente, ou seja, células
precursoras (monócitos) que migram através da parede dos vasos sanguíneos e de acordo
com o microambiente diferenciam-se em macrófagos M2. Há evidências científicas do
importante papel dos macrófagos M2 na cicatrização de feridas, angiogênese e na defesa
contra infecções parasitárias (13, 20).
com o microambiente no qual eles exercem a sua função. Como ambos são cruciais para
transcorrer o processo de reparo tecidual, o equilíbrio entre os dois fenótipos é de extrema
importância nas diferentes fases do processo de cicatrização e o desequilíbrio é responsável
pelo retardo desse processo (20).
Na fase pró-inflamatória do processo de cicatrização, um maior número de
macrófagos M1 são necessários para eliminar os detritos e possíveis agentes patógenos.
Entretanto, na fase de formação de um novo tecido são os macrófagos M2 que prevalecem, pois são uma importante fonte de TGF-β, que participam da contração da ferida, angiogênese e deposição da matriz extracelular (ECM) (20, 21, 25). Sendo a coloração com anti-F4∕80 um
indicador importante para quantificação do total de macrófagos em atividade (26).
A fase proliferativa é caracterizada pela neoangiogênese, intensa migração celular
(reepitelização) e reparação da integridade tecidual (granulação), sendo os fibroblastos e
queratinócitos as células-chave para esta fase (16, 27).
Alterações locais, como o aumento de lactato, diminuição do pH, e baixa tensão de
oxigênio, estimulam a angiogênese (15). Além disso, vários fatores de crescimento e
citocinas, produzidos durante a fase inflamatória, estimulam e regulam a formação de novos vasos sanguíneos como VEGF, fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e TGF-β (16, 28).
VEGF é expresso por células endoteliais vasculares, monócitos, macrófagos e células
precursoras hematopoiéticas (28). Todavia, para a reepitelização, outros estímulos conduzem
a migração dos queratinócitos, entre eles o contato célula-célula e mediadores químicos, tais como, o fator de crescimento epidermal (EGF), fator de crescimento transformante-α (TGF-α)
e fator de crescimento de queratinócito 1 e 2 (KGF-1 e KGF-2), TGF-β e a IL-1 (5). Na fase
proliferativa observa-se o desenvolvimento de tecido de granulação, predomínio de
fibroblastos, a substituição dos coágulos de fibrina por novo tecido rico em ácido hialurônico,
fibronectina, e outros compostos da matriz extracelular. Os fibroblastos são responsáveis por
sintetizar o colágeno e várias outras substâncias que compõem a ECM e participam do
A conclusão do processo de reparo tecidual dá-se na fase reparadora, responsável
pelo remodelamento e contração da ferida, onde há substituição do tecido de granulação por
tecido conjuntivo denso e a recomposição celular da epiderme (5, 16).
Estudo em roedores comparou o processo de cicatrização de feridas de queimaduras
térmicas e feridas incisionais demonstrando que há diferença na resposta celular e no
recrutamento de células imunes entre ambas, apontando uma resposta inflamatória mais
atenuada nas queimaduras (29). Outro estudo observou a desregulação da atividade dos
macrófagos na resposta inflamatória, redução dos mediadores inflamatórios como a IL-6 e a
(interleucina-10) IL-10, da infiltração celular, por meio de cultura de célula, reforçando que a
resposta inflamatória é deficitária nas feridas causadas por queimaduras (23).
1.4 Papel da colagênese e elastogênese no processo de cicatrização
Os componentes fibrosos da matriz extracelular são classificados microscopicamente
em três tipos de fibras: colágenas, reticulares e elásticas.
O colágeno é o maior componente da derme, com a função de fornecer resistência
contra traumas mecânicos, manutenção da integridade estrutural (30) e orientação no
desenvolvimento tecidual (31). O sistema de fibras colágenas tem a capacidade de fornecer
estrutura para os tecidos e células, onde as fibras reticulares são responsáveis por conectar
as fibras colágenas à lâmina basal das células epiteliais, musculares e adiposas.
As fibras elásticas representam cerca de 5% do tecido conjuntivo, sendo constituídas
essencialmente por elastina e microfibrilas (32). São responsáveis pela flexibilidade e retração
elástica, conferindo assim aos tecidos a capacidade de se distenderem facilmente e de
voltarem ao seu comprimento normal após término da tensão e consequente relaxamento
(33).
1,5 µm ou algumas vezes formando um ramo, uma rede no tecido conjuntivo frouxo (34). O
processo da elastogênese é compreendido pela síntese de fibras oxitalânicas, eulanínicas e
elásticas (maduras). As fibras oxitalânicas são fibras elásticas jovens encontradas perto da
pele fina da epiderme, próximo ao epitélio folicular e na adesão da epiderme com a derme. Já
as fibras eulanínicas são fibras elásticas quase maduras e dispõem-se distantes da epiderme
e apresentam-se em manchas, como um material amorfo. As fibras elásticas são fibras
totalmente maduras, com aspecto à microscopia de luz de uma substância homogênea,
distante das estruturas epiteliais (35).
Figura 2. Fotomicrografia realizada em microscopia eletrônica demonstrando a característica
das fibras colágenas, elásticas e oxitalânicas. (E) fibras elásticas; (O) fibras oxitalânicas e (C)
Figura 3. Representação esquemática do sistema fibrilar de colágeno e sistema
microfibrila-elastina. Ep = epitélio; V = capilar sanguineo; L = linfático; F = fibroblasto. Fonte: (Ushiki,
2002).
1.5 Diabetes mellitus
O Diabetes mellitus (DM) é caracterizado por uma menor produção de insulina ou uma
sinalização insulínica deficiente, glicose plasmática elevada e predisposição a complicações
crônicas envolvendo vários tecidos (36). A ausência absoluta ou relativa da insulina/ação da
insulina é descrito como um mecanismo que contribui para uma limitada cicatrização das
feridas (37), inflamação prolongada, angiogênese pobre e uma menor deposição da matriz
extracelular, quando comparado com a cicatrização de feridas comuns (38). Em análise
histológica, a taxa de contração da ferida e o tempo de completa epitelização foi menor nos
ratos não diabéticos quando comparado aos ratos diabéticos (39).
As lesões de pacientes diabéticos apresentam na fase inflamatória, atraso na ativação
dos monócitos/macrófagos, acúmulo prolongado desses tipos celulares (40) e consequentemente menor taxa de citocinas anti-inflamatórias como IL-10 e fatores de
crescimento como TGF-β, VEGF e IGF (fator de crescimento semelhante a insulina) (38), e
um elevado nível de citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-6 (40, 41).
Durante a reepitelização ocorre menor proliferação e migração dos queratinócitos, que
acarreta em altas taxas de citocinas inflamatórias que estimulam o aumento dos níveis de proteases como metaloproteinase-9 (MMP-9), que são capazes de destruir TGF-β e ECM nas
feridas de animais diabéticos induzidos (42).
Já a fase de remodelamento é marcada por uma reduzida deposição de colágeno, em
virtude da menor proliferação dos fibroblastos (39).
1.6 Insulina tópica
Diferentes coberturas estão descritas na literatura com a proposta de acelerar o
processo de cicatrização das queimaduras como, enxertos de pele, curativos e vários agentes
tópicos ou sistêmicos. Entretanto a cobertura utilizada para uma ferida de queimadura deve
ser capaz de restaurar a função da epiderme e integrar-se no processo de cicatrização (43,
44). Desta forma, tecnologias em desenvolvimento de curativos têm sido exploradas para
melhorar a recuperação desse tipo de paciente.
Os fatores de crescimento incluindo o EGF, TGF-β, e o PDGF têm sido utilizados no
tratamento de feridas para promover a recuperação mais rápida, estimulando as células da pele a migrar e proliferar rapidamente (45, 46). Infelizmente, o custo elevado dos fatores de
crescimento e a dificuldade em armazená-los durante períodos prolongados têm limitado a
utilização clínica e o sucesso comercial.
Ao contrário de outros fatores de crescimento, a insulina tem sido utilizada no reparo
tecidual de feridas cutâneas desde o início do século 20 e os mecanismos celulares e
moleculares do reparo tecidual, tanto de feridas em seres humanos quanto em animais tem
A insulina é um hormônio anabólico com ações metabólicas e de regulação do
crescimento. Exerce um importante efeito metabólico e mitogênico celular, mediado através
do receptor de insulina (IR), que está presente em tecidos de vertebrados em diferentes
concentrações, de acordo com o tecido. Os efeitos metabólicos são observados na regulação
da homeostase da glicose enquanto os efeitos de crescimento e diferenciação celular ocorrem
por meio da modificação da atividade de enzimas e sistema de transporte proteico, levando à
estimulação da síntese de DNA (ácido desoxirribonucleico), RNA (ácido ribonucleico),
proteínas e inibição da sua degradação (36, 48, 49).
A insulina pode induzir o fechamento mais rápido das feridas em virtude da regulação
do metabolismo da glicose e de citocinas inflamatórias. Em síntese o aumento das taxas de
cicatrização das feridas está associado com a diminuição da inflamação e o aumento do
depósito do colágeno no sítio das feridas. O colágeno é produzido pelos fibroblastos presentes
na matriz, onde há evidências de que a insulina também induz a síntese de colágeno (50).
Os efeitos biológicos da insulina iniciam-se com a sua ligação ao receptor proteico
específico, que sofre autofosforilação em tirosina e aumenta a atividade da tirosina quinase
em outras moléculas intermediárias incluindo substrato do receptor de insulina 1(IRS-1),
substrato do receptor de insulina 2 (IRS-2), substrato do receptor de insulina 3 (IRS-3),
substrato do receptor de insulina 4 (IRS-4) e intermediários de Shc (51).
Durante a interação com o receptor de insulina, as proteínas IRS são fosforiladas em
vários resíduos tirosina pelo receptor, ativando sítios de ligação para proteínas com domínio
SH2 (37). A enzima fosfatidilinositol 3-quinase (PI 3-quinase) foi a primeira molécula com
domínio SH2 com associação ao IRS-1, assim como ao IRS-2 (52-54).
Dentre as quinases dependentes de PI3K, destaca-se a AKT, que após o estímulo do
fator de crescimento, esta enzima que se localiza perto da membrana plasmática, após
fosforilação, tem a capacidade de se translocar para o núcleo. A AKT tem a capacidade de
fosforilar proteínas que regulam a síntese lipídica, de glicogênio e de proteínas, além da
A PI3K apresenta função importante, pois está diretamente relacionada em processos
metabólicos e mitogênicos regulados pela insulina como síntese proteica geral e crescimento
(55). Sustentando as evidências que sugerem que pode ser essa uma das vias pelas quais a
insulina induz a proliferação celular na pele (51).
Como outros fatores de crescimento, a insulina também estimula a proteína quinase
ativadora da mitogênese (MAPK). Esta via envolve a fosforilação de uma proteína adaptadora
Grb2, recrutando o fator permutador de guanina, chamado mSOS (son-of-senveless). Desta
forma o complexo Grb/mSOS ativa a p21 Ras que se trata de uma proteína intracelular com
importante papel no controle de crescimento celular e metabolismo (51).
Estudo que investiga a cicatrização de ratos diabéticos revela uma expressão
aumentada tanto da MAPK quanto da AKT no tecido cicatricial de ratos normais, enquanto a
expressão destes encontra-se diminuída em ratos diabéticos, justificando o comprometimento
do processo de cicatrização no diabetes(51).
Há descrição de evidências da melhora da resolução de feridas com o uso da insulina
em estudo que demonstrou um menor tempo no processo de cicatrização de lesões de ratos
diabéticos tratados com a insulina tópica, associado à recuperação da expressão de proteínas
da via de sinalização de insulina como os IR, IRS-1, IRS-2, Shc, MAP-K e AKT, demonstrando
fortes evidências da participação da insulina nos eventos celulares e moleculares na
reconstrução tecidual (48). Este estudo foi responsável por elucidar o mecanismo de ação da
insulina no processo de cicatrização de úlceras diabéticas e não diabéticas, sugerindo que o
tratamento tópico de insulina melhora o tempo de cicatrização em lesões de animais
diabéticos por meio da via AKT/ERK (48).
De acordo com alguns autores (50, 56, 57) a insulina participa do crescimento e a
diferenciação de diferentes tipos celulares e interfere na proliferação, migração de
queratinócitos, células endoteliais e fibroblastos (58).
tópica é capaz de acelerar o processo de cicatrização de queimaduras de segundo grau, por
meio da recuperação do recrutamento de células inflamatórias, formação de novos vasos
sanguíneos e maior síntese e organização das fibras colágenas tipo I e III, em animais
diabéticos, similar ao reparo tecidual observado nos animais saudáveis.
Embora os achados acima descritos revelem que a insulina tópica acelera o reparo
tecidual nas queimaduras de segundo grau em animais diabéticos, como nas lesões
incisionais, ainda não está claro quais são os mecanismos celulares e moleculares que
fundamentem o efeito da insulina tópica no processo de cicatrização de queimaduras de
2
2 OBJETIVO
Analisar os mecanismos celulares e moleculares do efeito da insulina tópica no
processo de cicatrização de queimadura de segundo grau em ratos diabéticos.
2.1 Estratégias metodológicas
Para tanto foi realizado a extração do tecido proveniente da ferida de queimadura nos
7º e 14º dias pós-lesão para realização das seguintes análises:
- Análise da expressão das citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6) e
anti-inflamatória (IL-10), no homogenato do tecido (ferida por queimadura), por ELISA.
- Avaliação da expressão de MCP-1, F4/80, TGF-β1, VEGF, α-SMA e Ki67, por
imuno-histoquímica.
- Análise da síntese e organização das fibras elásticas (oxitalânicas, eulanínicas e maduras) pelas colorações de Verhöeff e Weigert.
3
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais de experimentação
Ratos machos Wistar com idade entre oito e 10 semanas e peso entre 250-300g, foram
mantidos em gaiolas individuais sob condição padronizada de iluminação, em ciclos de 12h
de luz (06h00min-18h00min) e 12h de escuro (18h00min-06h00min), temperatura de 22 ± 2ºC
e acesso à água e ração ad libitum. Os animais foram obtidos no Centro Multidisciplinar para
Investigação Biológica na Área de Ciência em Animais de Laboratório (CEMIB) da Universidade Estadual de Campinas e randomizados em quatro grupos distintos (Figura 4).
Grupo CP: animais controles e tratamento com placebo tópico. Grupo CI: animais controles e tratamento com insulina tópica. Grupo DP: animais diabéticos e tratamento com placebo tópico. Grupo DI: animais diabéticos e tratamento com insulina tópica.
Figura 4. Composição dos grupos experimentais (n= 6-7grupo).
3.2 Indução do diabetes
Para indução do diabetes, os animais foram mantidos em jejum por 12 horas e
posteriormente realizado a administração de 65mgkg-1 de Streptozotocina (STZ) diluído em
QUEIMADURA 2º GRAU
Animais controles e tratamento com placebo tópico
Animais diabéticos (STZ) e tratamento com insulina tópica Animais diabéticos (STZ) e
tratamento com placebo tópico Animais controles e tratamento
50mmol l-1 de tampão de citrato 0,1M pH 4,2, por meio de uma única injeção endovenosa
peniana (19). Os animais controles receberam o correspondente da dosagem acima descrita,
apenas do tampão citrato, também por via endovenosa. Após 72 horas, os níveis de glicose
foram avaliados para confirmação do estado glicêmico de cada animal, sendo incluídos no estudo os animais com uma concentração de glicose ≥ 350mg/dl-1 para os animais diabéticos
induzidos e ≤ 120mg/dl para os animais controles, avaliados por meio de amostra de sangue
da veia caudal, com glicosímetro (Accu-chek Active), após 8 horas de pausa alimentar.
3.3 Modelo de ferida de queimadura de segundo grau
Para realização do procedimento da queimadura os animais foram anestesiados com
30mgKg-1 de Cloridrato de Cetamina (Ketalar, Parke-Davis, Brasil) e 15mgKg-1 de Cloridrato
de Xilasina (União Química Farmacêutica Nacional S/A, Brasil) intra-peritoneal (IP). Após
confirmação da indução anestésica através da ausência dos reflexos corneanos, foi realizada
tricotomia da região dorsal proximal e o procedimento de queimadura térmica, com um molde
de 1 cm2,aquecido a 120ºC e pressionado na pele por 20 segundos (Figura 2), provocando
uma queimadura de segundo grau de acordo com um protocolo previamente publicado (60) e
adaptado, confirmando a ferida de queimadura de segundo grau experimental (59). O cálculo
da superfície corpórea queimada (SCQ) foi baseado na fórmula de Meeh (61, 62), onde A=KW2/3 (A= área em cm2; K=8.95; W= peso corporal em gramas). A ferida de queimadura
deste estudo foi correspondente a 4% (quatro) de superfície corpórea queimadura de cada
Figura 5. Imagem do molde para realização da queimadura de segundo grau experimental.
Cada animal recebeu a seguir do procedimento da queimadura 50mgKg-1 de Cloridrato
de Tramadol (Medley Indústria Farmacêutica) intra-muscular (IM) e 6,2mgKg-1 de Dipirona
Sódica oral (adicionada à água de beber) (VO). Os analgésicos foram administrados até o
quinto dia após a queimadura, baseado em estudo que avaliou a dor no pós-operatório
demonstrando que os ratos que receberam analgésico nesta fase apresentaram redução do
quadro de dor e desconforto, recuperação mais rápida e aumento na ingestão de ração (10).
Os ratos foram reanimados com solução ringer com lactato (4 ml x kg (-1) x 1% TSCQ (-1), administrado pela via endovenosa (EV), seguindo a fórmula de Parkland, sendo a solução
administrada 30 minutos após a realização da ferida de queimadura (63), no intuito de reduzir
a taxa de mortalidade dos animais pós-queimadura, por desidratação.
3.4 Caracterização dos grupos experimentais
Para acompanhamento dos parâmetros zoométricos, os animais foram submetidos ao
controle de peso corporal, consumo alimentar e ingestão de água, assim como glicemia capilar
alimentar e ingestão de água foram determinados pela diferença entre a quantidade inicial e
final da ração/água oferecida em um período de 24 horas durante todo o experimento.
3.5 Tratamento das queimaduras com insulina tópica
A insulina tópica foi preparada como descrito anteriormente (48), na farmácia do
Hospital Universitário da Universidade Estadual de Campinas e número de patente PI
0705370-3, empregando insulina cristalina regular humana, com uma concentração de 0,5
U/100 g.
O creme sob o estudo, placebo ou insulina tópica foi aplicado na ferida de queimadura
imediatamente após o ferimento (dia 0) e reaplicada diariamente até o término do
experimento. Em todos os grupos, às feridas foram administradas topicamente ~ 0,35 g de
insulina tópica ou placebo. As feridas não foram cobertas com curativos secundários, sendo
a cicatrização por segunda intenção. Após a realização da ferida de queimaduras animais, os
animais foram alojados individualmente para evitar trauma as feridas. Os animais que
apresentaram sinais de infecção como secreção purulenta e hiperemia perilesional acima de
2 cm foram excluídos do estudo.
3.6 Determinação da área da ferida de queimadura
Para avaliação do processo de cicatrização, as feridas foram fotografadas nos 7º e 14º
dias pós-queimadura, com câmera digital Sony Cyber Shot (modelo DSC-S950S 10MP 4 x
Optical zoom) pelo mesmo avaliador. As imagens foram digitalizadas e a área das feridas
mensurada por meio da utilização do software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda,
da lesão imediatamente após o ferimento (D0) e a área da ferida ainda descoberto com
epiderme / área da lesão (D0) x 100.
Área inicial da queimadura – Área da queimadura diária x 100%
Área inicial da ferida
3.7 Acesso e retirada dos tecidos
Para extração do tecido, os animais foram anestesiados novamente com 30mgKg-1 de
Cloridrato de Cetamina (Ketalar, Parke-Davis, Brasil) e 15mgKg-1 de Cloridrato de Xilasina
(União Química Farmacêutica Nacional S/A, Brasil) intra-peritoneal (IP), nos 7º e 14º dia após
o ferimento de queimadura (Figura 6).
Figura 6. Desenho experimental.
As amostras de tecido foram obtidas conforme a ilustração a seguir (Figura 7), de
Figura 7. Representação esquemática da extração do tecido (pele - ferida).
3.8 Preparo das amostras para estudo histológico
Os fragmentos de tecido, proveniente da área das feridas logo após a coleta foram
dispostos em cortiça, fixados com alfinetes, de modo a não alterar a morfologia do tecido e
posteriormente acondicionados em potes individuais com solução de formaldeído 3,7% (pH
7,2), durante 8 horas, para o processo de fixação. Ao término do período de fixação os
fragmentos de pele foram armazenados em cassetes (individuais) e mantidos em solução de
álcool 70% overnight. Posteriormente o material foi submetido ao preparo por meio de uma
sequência de lavagens com álcool 95%, álcool 100% e xilol. Ao término dos banhos o material
foi submetido ao banho e inclusão em parafina, a uma temperatura de 60ºC.
3.8.1 Estudo histológico da reepitelização, infiltrado inflamatório e vasos
sanguíneos
Os cortes foram realizados em micrótomo, com espessura de 5 µ, e após disposição
em lâminas de microscopia realizado as colorações com hematoxilina e eosina (H&E) para
A reepitelialização da ferida foi estimada por análise morfométrica das secções de
feridas coradas com hematoxilina/eosina (H&E), (distância percorrida pelo epitélio) / (distância
entre as bordas da ferida). As imagens foram obtidas utilizando um microscópio Zeiss Stemi
SV6 Germay com um X 1.2, com câmera digital A640 10MP Power Canon e 4,8 (06-2009)
software Axion vision. Os resultados foram expressos como a percentagem da área da ferida
reepitelizada.
A análise quantitativa das células inflamatórias foi realizada pela contagem do número
dos núcleos das células mononucleares / campo. As imagens foram obtidas utilizando um
microscópio Nikon Eclipse Ti-U e aumento de 40X para análise do infiltrado inflamatório e 10X
para análise dos vasos sanguíneos, com câmera digital Nikon DS-Ri1 e NIS-Elements BR 3.1
software. Os resultados foram expressos em percentagem.
3.8.2 Estudo histológico das fibras elásticas
A avaliação histomorfométrica do sistema de fibras elásticas foi realizado por meio de
três tipos de colorações (64): Hematoxilina de Verhoeff ferro/iodo (65), utilizado para
identificação de fibras elásticas maduras; Resorcina-fucsina de Weigert (66), para
identificação das fibras elásticas maduras e eulanínicas (fibras elásticas jovens) e
Resorcina-Fucsina de Weigert com oxidação prévia com oxona 1% (35) que revela a presença e
disposição das fibras oxitalânicas (parcialmente maduras) e fibras elásticas maduras.
Para análise da presença e organização das fibras elásticas, foi realizado
primeiramente investigação histológicas das seções da pele íntegra (sem queimadura) do
animal de experimentação diabético induzido por estreptozotocina e saudável (animal controle
ou normoglicêmico), por meio das três colorações acima descritas. Posteriormente foi
realizada a investigação histológica de seções da pele queimada em processo de cicatrização,
diabéticos e controles, também por meio dos três tipos de colorações descritas acima.
Todas as imagens foram visualizadas no microscópio óptico (LEICA® DM 4000B com câmera LEICA® DFC 280 ligada ao computador AMD Athlon™64 2.00GHz equipado com
placa de vídeo NVIDIA GeForce4 MX4000) e capturadas no programa Image Pro-Plus 7.0
software, com objetiva de 10x e os inserts em 40x.
3.9 Reação de imuno-histoquímica (IHQ)
Para realização das reações de imuno-histoquímica, os cortes foram realizados em
micrótomo, com espessura de 5 µ e dispostos em lâminas silanizadas
(3-3-aminopropyltriethoxy silane) (Sigma Chemical Company – St. Louis, MO, EUA). Em seguida
foi realizado o processamento de desparafinização e hidratação das secções.
Para o bloqueio da peroxidase endógena as secções permaneceram submersas em
uma cuba com uma solução de 1:10; sendo 1ml de metanol para 10 ml de H2O2 0,3%, no
escuro, por 15 minutos. Após enxaguar com água milli-Q foi realizada a recuperação
antigênica com tampão citrato 0,1M pH 6,0 em panela de pressão, durante 24 minutos. Após
resfriamento das lâminas, foi realizado o bloqueio dos sítios inespecíficos com a utilização do reagente A – Blocking solution (Kit Histostain plus broad spectrum – Life Technologies) por 10
minutos em câmara úmida. As seções foram incubadas com o respectivo anticorpo primário,
overnight a 4ºC, e as concentrações e especificações de cada reação descritas na tabela 1.
Após o período de incubação do anticorpo primário, foi realizado lavagens das lâminas
com PBS (com pipeta Pasteur) (3X), em seguida as secções foram incubadas com o reagente B Broad Spectrum Second Ab (Kit Histostain plus broad spectrum – Life Technologies) durante
10 minutos e posteriormente com o reagente C HRP-Streptavidin (Kit Histostain plus broad
spectrum – Life Technologies), também por 10 minutos, nas mesmas condições. Após as
tetrahydrochloride (Immpact™ DAB peroxidase substrate Kit /SK – 4105 Vector) durante
1minuto e a contra-coloração nuclear foi realizada com Hematoxilina de Meyer, por 5 minutos.
Os cortes foram lavados novamente e mergulhados em solução de carbonato de lítio. Por fim,
Tabela 1. Padronização da imuno-histoquímica. São Paulo, 2016. Marcador Especificações do anticorpo Diluição utilizada Recuperação
antigênica Localização celular
MCP-1 Anti-MCP-1 policlonal obtido em coelho (cód. 7202 Abcam Plc) 1:100 Panela a vapor 40 min 95°C e tampão citrato pH 6,0 secretado F4/80 Anti-F4/80 monoclonal obtido em coelho (cód. 111101 Abcam Plc) 1:50 Panela a vapor 40 min 95°C e tampão TRIS/EDTA pH 7,0 membrana celular TGF-β1 Anti-TGF-β1 policlonal obtido em coelho (cód. sc 146 Santa Cruz Biotechnology Inc) 1:50 Panela a vapor 40 min 95°C e tampão citrato pH 6,0 extracelular VEGF Anti-VEGF Receptor1 monoclonal obtido em coelho (cód. 32152 Abcam Plc) 1:250 Panela a vapor 40 min 95°C e tampão citrato pH 6,0 secretado e membrana celular α-SMA Anti-α-SMA monoclonal obtido em coelho (cód. 32575 Abcam Plc) 1:100 Panela a vapor 40 min 95°C e tampão citrato pH 6,0 citoplasma/citoesqueleto Ki-67 Anti-Ki-67 monoclonal obtido em coelho (cód. SP6 Spring BioScience Biotechnology Company) 1:200 Panela a vapor 40 min 95°C e tampão citrato pH 6,0 núcleo
Todas as imagens foram visualizadas no microscópio óptico (LEICA® DM 4000B com câmera LEICA® DFC 280 ligada ao computador AMD Athlon™64 2.00GHz equipado com
placa de vídeo NVIDIA GeForce4 MX4000) e capturadas no programa NIS Elements BR
Para tanto, foram analisados para cada animal, de cada grupo (CP, CI, DP e DI), dois
cortes seriados (com distância de 30 µ entre cada corte)lâmina. Cada corte foi avaliado a derme superior (papilar) e inferior (reticular), de modo que todas as fotomicrografias fossem
analisadas no mesmo local da ferida, independentemente do resultado da imunomarcação,
conforme figura esquemática abaixo.
Figura 8. Esquema de seleção de campos para análises das marcações por
imuno-histoquímica (n=5-6).
Para avaliação qualitativa das reações de imuno-histoquímica foram consideradas a
intensidade de imunomarcação e a localização da marcação obtida, se em anexos (glândulas
anexas), vasos sanguíneos (endotélio), terminações nervosas, músculo e parênquima.
Para quantificação das imunomarcações foram capturadas 5 imagens das seções de imuno-histoquímica com aumento de 10/10X, da região da derme superior ̸ inferior, já descrito
anteriormente (67).
Para tanto, foi utilizado o Plugin “Colour Deconvolution” do software Image J
(APÊNDICE A – Etapa 1, 2 e 3), para quantificação da cor ocre (imunomarcação) na área total
da imagem. Na aba acima citada, em “Vectors” foi selecionado “H DAB” (APÊNDICE A – Etapa
4), o qual permite a separação da imagem em 3 cores: ocre (imunomarcação), azul (hematoxilina – coloração de fundo) e verde (fundo da lâmina), sendo apenas a imagem ocre
utilizado para a quantificação (APÊNDICE A – Etapa 5). Na aba Imagens, selecionado “Threshold” que apresenta por meio de histograma os tons em ocre detectado na amostra
(APÊNDICE A – Etapa 6). Entretanto para a quantificação das imagens de imuno-histoquímica
impedir que o software detecte muita marcação em secções pouco marcadas ou pouca
marcação em secções muito marcadas.
3.10 Determinação das citocinas pela técnica de ELISA
Para realização desta técnica foram coletadas amostras de tecido proveniente da
ferida de queimadura, nos 7º e 14º dias pós-queimadura.
As citocinas inflamatórias IL-1β, TNF-α, IL-6 e IL-10 foram medidas no homogenato da
pele, dos grupos controles (CP e CI) e diabéticos (DP e DI), nos 7º e 14º dias pós-lesão, por
ELISA utilizando kits Thermo Scientific (Rockford, IL, USA).
A homogeneização do tecido foi realizada com utilização do equipamento
POLITRON® e tampão PBS pH 7,4, contendo inibidores de proteases PMFS 0,5mM,
aprotinina (Sigma) 80 UI/ml, sonicadas durante 1 minuto. As amostras de tecido das feridas
de queimaduras, após extração, foram imediatamente acondicionadas em nitrogênio e
posteriormente armazenadas no freezer (- 80 °C). Em seguida, centrifugou-se o homogenato
a 12.000 rpm, 4ºC por 10 minutos, e O sobrenadante foi recolhido e armazenado a -80 °C. A partir do sobrenadante do homogenato das feridas foram realizadas as dosagens de IL-1β e
TGF-β1, IL-6 e IL-10, seguindo o protocolo realizado no Laboratório de Metabolismo Lipídico
do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo.
Placas de 96 poços foram cobertas com 50μL/poço do anticorpo específico
anti-TNF-α, anti-IL-1β, anti-IL-6 e anti-IL-10. Estes anticorpos foram diluídos em solução de ligação
binding bufffer pH 9,0 e incubados por 18-24 horas, a 4ºC. As placas foram lavadas três vezes
com PBS/Tween-20 (0,05% SIGMA). As ligações não específicas foram bloqueadas com 150μL de PBS/BSA 1% por 120 minutos a temperatura ambiente. Adicionou-se em cada
C. Em seguida, neutralizou-se com 1N NaOH a 1:25 e imediatamente pipetou-se as amostras na placa. As amostras e o padrão (curva padrão) foram adicionados nas placas (50μL/poço)
e incubados por 18-24 horas a 4ºC. Após esse período, as placas foram lavadas com PBS/Tween e foram adicionados 50Μl dos anticorpos biotinilados específicos. Após uma hora,
as placas foram lavadas com PBS/Tween, e o conjugado avidinaperoxidase foi adicionado a
cada poço e as placas incubadas por mais 30 minutos. Em seguida, as placas foram lavadas com PBS/Tween e foi adicionado 50μL do substrato OPD (o-fenilenediaminadihidrocloreto;
SIGMA) em tampão substrato (pH 5,0) para obtenção das dosagens. As placas foram incubadas por 15 a 20min a temperatura ambiente. A reação foi interrompida com 50μL de
H2SO4 (1M) e a densidade óptica medida a 490nm em espectrofotômetro (SPECRA
MAX-250, MOLECULAR DEVICES). As concentrações de citocinas contidas nas amostras foram
calculadas a partir de uma curva padrão com 11 pontos, obtida por diluição seriada. Os
resultados estão expressos em picogramas de citocina/mL de sobrenadante/mg de tecido.
3.11 Análise estatística
Os resultados preliminares foram analisados por meio do programa GraphPad Prism
versão 6.01® (GraphPad Software, La Jolla-CA, USA). O tamanho amostral mínimo por grupo
para cada parâmetro analisado foi definido por meio do n suficiente para realização da análise da distribuição das amostras através do “D’Agostino and Pearson omnibus normality test”
recomendado pelo programa GraphPad Prism versão 6.01®. As amostras foram avaliadas
quanto sua distribuição normal e submetidas a análise de variância por um e dois fatores
(oneway e 2way ANOVA). Quando o teste apresentou diferença significativa foi seguido do
pós-teste de Tukey para mais de duas variâncias (p<0,05). Os resultados apresentados foram
expressos como média desvio padrão da média (M SD) e posteriormente representados em porcentagens de variação em relação aos controles, aos quais foi atribuído o valor de
3.12 Aspectos éticos
De acordo com a Lei nº 11.794, de 8 de outubro de 2008, no inciso VII do § 1o do art.
225 da Constituição Federal, que estabelece os procedimentos para o uso científico de
animais, este projeto obteve a aprovação pelo Comitê de Ética no Uso de Animais do Instituto de Biologia (CEUA), da Universidade Estadual de Capinas – Unicamp (nº2581-1), filiado ao
Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA). Todos os
experimentos foram conduzidos seguindo-se os princípios éticos e procedimentos de cuidado
com o uso de animais experimentais em acordo com as diretrizes estabelecidas pelos órgãos
4
4 RESULTADOS
4.1 Análise dos parâmetros zoométricos, glicemia capilar em jejum e consumo
alimentar/dia antes e após a queimadura experimental
A insulina tópica não induziu alterações nos níveis de glicose no sangue dos animais
controles ou diabéticos. Todos os animais diabéticos induzidos-STZ apresentaram sintomas,
tais como hiperglicemia, perda de peso, o aumento da ingestão alimentar e polidipsia (Tabela
Tabela 2. Glicemia capilar em jejum, peso e consumo de ração e água/dia antes e após
queimadura/dia (n=5). São Paulo, 2015.
CP CI DP DI Glicemia (mg/dl) Antes queimadura Depois queimadura 93 ± 12.34* 97 ± 7.62 96 ± 6.55* 102 ± 5.23 415 ± 17.73 435 ± 19.34 439 ± 21.13 439 ± 25.76 Peso (g) Antes queimadura Depois queimadura 272 ± 7.93* 357 ± 9.02 285 14.33* 379 ± 10.69 231 13.58 203 ± 6.70 226 ± 16.6 208 ± 13.88 Consumo ração (g/dia) Antes queimadura Depois queimadura 22 ± 1.75* 27 ± 0.91 27 ± 2.07* 25 ± 1.90 45 ± 7.77 46 ± 6.21 45 ± 6.44 46 ± 6.25 Consumo água (ml/dia) Antes queimadura Depois queimadura 40 ± 8.86** 44 ± 10.11 39 ± 7.12** 46 ± 6.35 169 ± 21.21 185 ± 16.01 159 ± 20.45 182 ± 19.18
* P < .05 vs. DP e DI; ** P < .01 vs. DP e DI, valores expressos como média ± erro padrão. Dados publicados (59).
4.2 Análise morfométrica e histológica (H&E)
A análise morfométrica das áreas das feridas mostrou que a insulina tópica acelera o
processo de cicatrização nos animais diabéticos (DI), quando comparado aos animais
diabéticos tratados com creme placebo (DP) (Figura 9A). No 7º dia pós-queimadura, a área
da ferida dos animais CI foi significativamente menor quando comparada aos demais grupos
(CP, DP e DI) (Figura 9B, p<0,05). No 14º dia pós-queimadura, as áreas das feridas dos grupos CP, CI e DI, foram significativamente menores, quando comparado ao grupo DP
grupos CP e CI no 14º dia pós-queimadura.
Figura 9A
Figura 9. (A) Imagens da cicatrização das feridas dos animais controles e diabéticos, de
acordo com os tratamentos tópicos recebidos (creme placebo e insulina tópica), nos 7º e 14º
dias queimadura. (B) Área das feridas de queimaduras (porcentagem), no 7° dia
pós-queimadura: CI vs. CP, DP e DI (p<0,05); no 14° dia pós-queimadura CP, CI, DI vs. DP (p
<0,05) (n=7-8).
Análise histológica demonstrou uma maior porcentagem de reepitelização das feridas
dos grupos CP, CI e DI quando comparado ao grupo DP (Figura 10A), no 7º dia (p <0,05) e
no 14º dia pós-queimadura (p <0,001) (Figura 10B).
Fig
ura 10
