High resolution melting

A técnica de HRM foi proposta para verificar a acurácia da metodologia no rastreamento das alterações em TP53. Assim, todas as amostras foram sequenciadas para testar o método.

Os exons 2, 3 e 4 necessitaram de maior padronização para tornar a amplificação mais específica, eliminando os dímeros de iniciadores e formação de estruturas secundárias. Foram testadas diferentes concentrações de iniciadores, de DNA, de MgCl2, e temperaturas de anelamento.

A análise do HRM para o exon 2 resultou em uma amplificação mais específica aumentando-se a temperatura de anelamento dos iniciadores para 62°C (ao invés de 60°C, utilizada nos demais ensaios). Apenas duas

amostras foram detectadas como variantes sem apresentarem alteração na sequência amplificada. Entretanto, a definição de variante foi realizada em apenas uma amostra de cada duplicata, o que não permite concluir a definição do software para estas amostras. Além disso, o software não conseguiu identificar as variantes que apresentam o polimorfismo no intron 2 (PIN2; c.74+38C>G). Os dados brutos deste ensaio estão representados no Anexo 6A. O gráfico utilizado para a análise das variantes está representado na Figura 24.

Figura 24 - Gráfico resultante da análise do HRM para o exon 2. O gráfico alinha os dados relativos às diferenças de fluorescência entre as curvas de dissociação das sequências referências com as sequências variantes.

A análise do HRM para o exon 3 resultou em uma amplificação mais específica aumentando-se a temperatura de anelamento dos iniciadores para 63°C. Como o intron 3 apresenta um polimorfismo de duplicação de 16

pb, ele passou também a ser alvo de estudo utilizando o HRM, de forma que os iniciadores desenhados para esta técnica, e que também seriam utilizados para subsequente reação de sequenciamento, foram desenhados de forma a incluir este polimorfismo para análise, o que resultou em maior dificuldade de padronização e interpretação das reações de HRM. Assim, a região amplificada contém o exon e o intron 3. Entretanto, mesmo após a adequação do ensaio às recomendações do fabricante, o software identificou seis tipos de variantes, sendo que o esperado seria que fossem encontradas apenas as três representativas do PIN3 em homozigose dominante, homozigose recessiva e heterozigose, já que nenhuma amostra apresenta mutação identificada no exon 3. Apesar da determinação de um número maior de variantes do que o esperado, o software foi capaz de diferenciar corretamente as variantes do PIN3 heterozigotas e homozigotas recessivas, das amostras homozigotas dominante. As amostras A2/A2 foram corretamente separadas das demais. Os dados brutos deste ensaio estão representados no Anexo 6B. O gráfico utilizado para a análise das variantes está representado na Figura 25.

Figura 25 - Gráfico resultante da análise do HRM para o exon 3. O gráfico alinha os dados relativos às diferenças de fluorescência entre as curvas de dissociação das sequências referências com as sequências variantes.

A análise do HRM para o exon 4 resultou em uma amplificação mais específica aumentando-se a temperatura de anelamento dos iniciadores para 63°C. O exon 4 apresenta o polimorfismo de alta frequência 72Pro>Arg, o que resulta na formação de mais de um pico na curva de dissociação.

Entretanto, mesmo após a adequação do ensaio às recomendações do fabricante, os resultados mostravam três picos distintos dentro da região ativa de dissociação. Em relação à detecção das variantes, espera-se encontrar três tipos, representativas do 72Pro>Arg em homozigose dominante, homozigose recessiva e heterozigose. Além destas, como algumas amostras apresentam mutação na mesma região amplificada, esperava-se que o software fosse capaz de identificar como variantes as amostras que continham a mutação além do polimorfismo. Entretanto, entre

as três variantes identificadas pelo software, apenas uma delas representou corretamente a variante que continha a mutação além do polimorfismo. As outras duas variantes encontradas pelo software reuniam dentro da mesma definição tanto casos homozigotos quanto heterozigotos. Os dados brutos deste ensaio estão representados no Anexo 6C. O gráfico utilizado para a análise das variantes está representado na Figura 26.

Figura 26 - Gráfico resultante da análise do HRM para o exon 4. O gráfico alinha os dados relativos às diferenças de fluorescência entre as curvas de dissociação das sequências referências com as sequências variantes.

A análise do HRM para o exon 5 não apresentou resultados satisfatórios, pois apesar de a reação ter sido corretamente padronizada e a amplificação ter sido realizada adequadamente, o software não identificou nenhuma das variantes encontradas no sequenciamento. Erroneamente, identificou uma amostra como variante, sendo que ela não apresenta

alteração na sequência amplificada. Como essa identificação foi feita em apenas uma amostra dentre a duplicata, o resultado encontrado não pode ser considerado como confiável. Os dados brutos deste ensaio estão representados no Anexo 6D. O gráfico utilizado para a análise das variantes está representado na Figura 27.

Figura 27 - Gráfico resultante da análise do HRM para o exon 5. O gráfico alinha os dados relativos às diferenças de fluorescência entre as curvas de dissociação das sequências referências com as sequências variantes.

As análises do HRM para os exons 6, 7, 8 e 10 apresentaram resultados excelentes, pois todas as variantes encontradas no sequenciamento foram corretamente identificadas na análise do software de HRM, nas duplicatas. Além das variantes corretamente identificadas, o software identificou como outras variantes amostras que não possuíam alteração na sequência amplificada, ainda que não sempre nas duplicatas,

gerando falsos positivos. Os dados brutos destes ensaios estão representados nos Anexos 6E, 6F, 6G, 6H. Os gráficos utilizados para as análises das variantes estão representados nas Figuras 28 a 31.

Figura 28 - Gráfico resultante da análise do HRM para o exon 6. O gráfico alinha os dados relativos às diferenças de fluorescência entre as curvas de dissociação das sequências referências com as sequências variantes.

Figura 29 - Gráfico resultante da análise do HRM para o exon 7. O gráfico alinha os dados relativos às diferenças de fluorescência entre as curvas de dissociação das sequências referências com as sequências variantes.

Figura 30 - Gráfico resultante da análise do HRM para o exon 8. O gráfico alinha os dados relativos às diferenças de fluorescência entre as curvas de dissociação das sequências referências com as sequências variantes.

Figura 31 - Gráfico resultante da análise do HRM para o exon 10. O gráfico alinha os dados relativos às diferenças de fluorescência entre as curvas de dissociação das sequências referências com as sequências variantes.

A análise do HRM para os exons 9 e 11 foi realizada de forma a cobrir todo o gene, seguindo a proposta de um rastreamento das alterações.

Entretanto, nenhuma das amostras revelou alteração na sequência destes exons. A análise do HRM, assim como para a maioria dos exons, identificou como variantes amostras sem alteração na sequência amplificada, ainda que não sempre nas duplicatas, gerando falsos positivos. Os dados brutos destes ensaios estão representados nos Anexos 6I e 6J. Os gráficos utilizados para as análises das variantes estão representados nas Figuras 32 e 33.

Figura 32 - Gráfico resultante da análise do HRM para o exon 9. O gráfico alinha os dados relativos às diferenças de fluorescência entre as curvas de dissociação das sequências referências com as sequências variantes.

Figura 33 - Gráfico resultante da análise do HRM para o exon 11. O gráfico alinha os dados relativos às diferenças de fluorescência entre as curvas de dissociação das sequências referências com as sequências variantes.

6 DISCUSSÃO

Este estudo buscou investigar as alterações de TP53, bem como buscar associações entre as alterações encontradas com a expressão imunoistoquímica e os dados clinicopatológicos, através de análises da proteína, do cDNA e do gDNA de TP53.