Sequenciamento direto

Para a reação de sequenciamento utilizou-se 1 µL de ExoSAP-IT (USB, Estados Unidos) para realizar a purificação de 7 µL do produto da PCR, para degradar o excesso de iniciadores e de dNTPs. A reação foi incubada 30 minutos a 37ºC, seguido de 15 minutos a 80ºC para inativação das enzimas.

Em seguida, 3 µL do produto da PCR purificado foi utilizado para 10 µL de reação de amplificação para o sequenciamento com 0,3 µM de iniciador específico e 1 µL de BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies, Estados Unidos). A reação foi incubada 2 minutos a 95ºC, mais 40 ciclos de 18 segundos a 95ºC, 18 segundos a 52ºC, e 4 minutos a 60ºC.

Para o método de precipitação da reação de sequenciamento foi adicionado a reação 1µl de EDTA 125 mM (pH 8,8) e Acetato de Sódio 3M (pH 5,2), além de 30 µl de etanol 100%. Em seguida, a reação foi deixada no escuro para precipitação do DNA, em temperatura ambiente, por 15 minutos.

Após a precipitação, a reação foi levada à centrífuga por 45 minutos a 4000

rpm e, em seguida o sobrenadante foi eliminado vertendo-se a placa e com uma rápida centrifugação da placa invertida para total eliminação do sobrenadante. Adicionou-se 30 µl de etanol 70% ao produto precipitado para lavagem, seguido de uma centrifugação de 45 minutos a 4000 rpm. O sobrenadante foi eliminado vertendo-se a placa e a reação foi levada ao termociclador a 95°C por 20 minutos, para evaporação do etanol. As amostras foram ressuspendidas em 13 μl de formamida Hi-Di (Life Technologies, Estados Unidos), denaturadas a 95°C em termociclador por 3 minutos e, imediatamente acondicionadas em gelo por 5 minutos. O sequenciamento foi realizado no equipamento ABI PRISM 3130xl Automated Genetic Analyser (Life Technologies, Estados Unidos).

4.8 HRM

As reações de HRM foram feitas no Real-Time Fast 7500 (Life Technologies, Estados Unidos), sendo necessárias três calibrações:

Background (com água), que assegura o mínimo de variação de sinal do fundo da placa; Pure Dye, utilizando a placa comercialmente pronta MeltDoctor^TM HRM Calibration Plate, que calibra o equipamento para reconhecer a fluorescência presente no master mix; e por fim, a calibração HRM, utilizando a mesma placa comercial, que calibra o software a quantificar a fluorescência durante a curva de dissociação. A curva de dissociação é gerada utilizando o “expert mode”, que coleta os dados apenas em um filtro, e, portanto, gera mais pontos de dados necessários

para a “alta resolução” necessária à técnica de HRM. Não é utilizada nenhuma referencia passiva.

Todas as calibrações do equipamento foram realizadas utilizando placas customizadas de acordo com as recomendações do fabricante. Os resultados das curvas resultantes da calibração HRM estão demonstrados na Figura 7.

Figura 7 - Gráficos representativos das calibrações de HRM, amplificação da placa comercial (esquerda) e a curva de dissociação derivada (direita).

Além das calibrações, foi comprado um kit de controle positivo do fabricante, o MeltDoctor™ HRM Positive Control Kit (Life Technologies, Estados Unidos). Trata-se de um par de iniciadores e três amostras de DNA compostas por variantes homozigota dominante, heterozigota e homozigota recessiva. Serve para verificar se o software está sendo capaz de detectar as variantes corretamente. Assim, o kit de controle positivo foi utilizado antes das análises de HRM para o gene TP53, e apresentou os resultados esperados na detecção das três variantes, conforme demonstrado na Figura 8.

Figura 8 - Gráficos representativos das análises de HRM para o MeltDoctor™ HRM Positive Control Kit (Life Technologies, Estados Unidos).

A: amplificação das amostras; B: curva de dissociação; C: dados brutos; D: derivados da curva de dissociação; E: alinhados da curva de dissociação; F: gráfico com a diferença relativa entre as amostras, mostrando a presença das três variantes esperadas.

A B

D C

F E

Para todos os ensaios foi utilizado o master mix MeltDoctor^TM HRM Master Mix (Life Technologies, Estados Unidos), que contém MgCl2, MeltDoctor^TM HRM Dye a a AmpliTaq Gold® 360 DNA Polymerase. Todas as reações foram preparadas utilizando pipetador automático Qiagility (Qiagen, Alemanha).

Para as análises do gene TP53 foram testadas três concentrações finais de iniciadores na reação: 0,1 uM, 0,2 uM e 0,3 uM, combinados um a um em uma matriz de diluição, totalizando 9 reações para cada ensaio (exon), realizados em duplicata. Os resultados revelaram que a concentração ótima para as reações foi a menor utilizada para todos os iniciadores, de 0,1 uM.

Em todas as reações foram utilizadas 40 ng de DNA, concentração ideal que foi encontrada nos testes de padronização. Todos os testes foram realizados em duplicatas, na mesma reação de amplificação e dissociação, incluindo-se o controle negativo na amplificação, que deve ser omitido na análise do HRM.

Para as corridas de quantificação absoluta para amplificar o DNA foram feitas reações em 20 µl, sendo: 10 µl de MeltDoctor^TM HRM Master Mix (Life Technologies, Estados Unidos), 1 µl de cada iniciador (concentração final de 0,1 mM cada), 40 ng de DNA por reação e água para completar o volume final.

A reação foi realizada utilizando as seguintes condições: 10 minutos a 95ºC para ativação enzimática; 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC para denaturação e 1 minuto a 60ºC para anelamento e extensão; e para a curva

de dissociação 10 segundos a 95ºC para denaturação, 1 minuto a 60ºC para anelamento, 15 segundos a 95ºC para o high resolution melting e 15 segundos finais para anelamento.

Características normais de amplificação são: níveis de fluorescência que ultrapassam o threshold (nível arbitrário de fluorescência estabelecido dentro da região de crescimento exponencial) entre os ciclos 8 e 35;

aumento exponencial de fluorescência; e picos definidos na curva de dissociação.

As análises de HRM foram realizadas no High Resolution Melt Software v3.0.1. Nas curvas de Derivative Melt e Raw Melt são definidas as regiões de pré-melt (todos os amplicons estão em dupla-fitas), active melt (pico que indica a temperatura de anelamento onde metade dos amplicons está dissociada) e pós-melt (todos os amplicons estão em simples-fitas), regiões que são usadas para definir os dados nas curvas de Aligned Melt e Difference Plot, onde as variantes são mais facilmente identificáveis.