SUMÁRIO
4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS
Diante do exposto, foram formuladas as seguintes hipóteses científicas:
I. Os membros dos sistemas TNF-α e IL-ńβ são expressos em folículos ovarianos bovinos em todos os estágios de desenvolvimento regulando a ativação e a sobrevivência de folículos pré- antrais cultivados in vitro.
II. A presença de Dexametasona é capaz de suprimir a produção endógena de TNF-α, reduzindo a apoptose em folículos pré-antrais bovinos após o cultivo in vitro.
III. As gonadotrofinas regulam a expressão de RNAm para o sistema TNF-α e IL-ńβ em células foliculares in vivo e in vitro.
IV. O TNF-α e a IL-ńβ são essenciais no processo ovulatório em bovinos.
V. O TNF-α e a IL-ńβ influenciam a expansão das células do cumulus, afetam a integridade ultraestrutural e a viabilidade de células foliculares cultivadas in vitro.
5. JUSTIFICATIVA
No ovário mamífero, cerca de 90 a 95% dos folículos encontram-se quiescentes e constituem o pool de reserva folicular. De toda a população folicular presente no ovário, apenas cerca de 0,1% atingirá a ovulação (NUTTINCK; MERMILLOD; DESSY, 1993), enquanto os demais folículos sofrerão atresia (OTALA et al., 2002). A regulação do desenvolvimento folicular é complexa e envolve fatores endócrinos, parácrinos e autócrinos, que são orquestrados de maneira estágio-específica a fim de controlar vários processos incluindo proliferação e diferenciação de células foliculares, esteroidogênese, angiogênese/vascularização, remodelamento da membrana basal e matriz extracelular, além de atresia/apoptose.
Estudos recentes comprovam que as citocinas atuam através de mecanismos autócrinos e parácrinos, como mensageiros intracelulares, na regulação de eventos intraovarianos. Contudo, avanços significativos nas técnicas de reprodução assistida requerem melhor compreensão dos mecanismos moleculares que controlam estes processos. Os sistemas TNF-α e IL-ńβ têm sido amplamente estudados em sua relação com os processos reprodutivos, especialmente na ovulação em roedores e equinos. No entanto, ressalta-se a escassez de informações no que se refere à ação destas citocinas no desenvolvimento folicular e ovulação na espécie bovina.
Desta forma, estudos que demonstrem a localização e os níveis de expressão de fatores que são normalmente produzidos pelos folículos são necessários para identificar e compreender as diferentes substâncias envolvidas na promoção do desenvolvimento e/ou atresia folicular. Sendo assim, para compreender o crescimento dos folículos em diferentes categorias, o desenvolvimento de um sistema de cultivo eficiente poderá contribuir para a propagação de biotécnicas reprodutivas para uma melhor compreensão sobre os fatores que regulam a foliculogênese na fase pré-antral, necessários para a sobrevivência, a ativação e o início do crescimento folicular.
Nesse contexto, diferentes substâncias vêm sendo utilizadas em sistemas de cultivo visando a manutenção da viabilidade folicular, bem como o estímulo ao crescimento de folículos pré-antrais in vitro. No entanto, o TNF-α e a IL-ńβ ainda não foram identificados em folículos pré-antrais nem utilizados no cultivo in situ de fragmentos de córtex de ovários bovino. Estudos in vitro apontam que a apoptose induzida por TNF-α em células da granulosa de humanos pode ser bloqueada pela ação de glicocorticóides, como a dexametasona (SASSON et al., 2002). Desta forma, o desenvolvimento de um sistema de cultivo eficiente
que ultilize TNF-α ou IL-1β poderá fornecer subsídios para uma melhor compreensão acerca dos fatores que regulam a foliculogênese na fase pré-antral e de proteínas e fatores necessários para a sobrevivência, a ativação e o início do crescimento folicular.
Além disso, a presença dos sistemas TNF-α e IL-1 em folículos pré-ovulatórios bovinos são desconhecidos até o momento. Tendo como base a hipótese de que estes sistemas são efetivos no processo de ovulação, ainda não foi demonstrado o efeito do estímulo de LH sobre a expressão de RNAm para o sistema TNF-α/IL-1 em células da granulosa no período periovulatório em bovinos.
6. OBJETIVOS
6.1 Objetivos Gerais
Identificar a presença e a distribuição do Sistema TNF-α e Sistema IL-1β, incluindo ligantes e receptores, em folículos ovarianos bovinos.
Avaliar os efeitos de diferentes concentrações de IL-1β, TNF-α e Dexametasona no desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais bovinos inclusos em tecido ovariano. Analisar a influência de gonadotrofinas sobre os Sistemas TNF-α e IL-1β em folículos ovarianos bovinos no período periovulatório, utilizando modelos in vivo e in vitro.
6.2 Objetivos específicos
•
Determinar a existência intrafolicular e distribuição de proteínas do Sistema TNF-α (TNF-α; TNFRI e TNFRII) e do Sistema IL-1 (IL-ńβ; IL-1RA, IL-1RI e IL-1RII) em folículos ovarianos bovinos por imunohistoquímica.•
Investigar a influência de diferentes concentrações de TNF-α, Dexametasona e IL-ńβ na sobrevivência e ativação de folículos primordiais bovinos cultivados in vitro.•
Avaliar o efeito do TNF-α e Dexametasona na integridade ultraestrutural de folículospré-antrais, bem como na expressão de RNAm para Bcl-2, BAX, P53, TNF-α, CASP 3 e CASP6 após o cultivo in vitro.
•
Quantificar os RNA´s mensageiros para o sistema IL-1 em folículos pré-antrais bovinos, bem como em células do cumulus, oócitos e na parede folicular de folículos antrais menores que 3 mm e maiores que 3 mm•
Avaliar o efeito in vivo do tratamento com GnRH (0, 3, 6, 12 e 24h) sobre a expressão de TNF-α, TNFR1 e TNFR2, bem como de IL-ńβ, IL-1RA e IL-1RI em folículos pré- ovulatórios bovinos.•
Analisar o efeito das gonadotrofinas na expressão de RNAm para TNF-α, TNFR1 e TNFR2, bem como de IL-ńβ, IL-1RA e IL-1RI em células foliculares bovinas cultivadas in vitro.•
Examinar o efeito do TNF-α na expansão das células do cumulus, integridade ultraestrutural de CCOs, bem como na expressão de RNAm para HAS-2, caspases 3 e 6 em células foliculares bovinas durante o cultivo in vitro•
Examinar o efeito da IL-1β na expansão das células do cumulus, integridade ultraestrutural de CCOs, bem como na expressão de RNAm para HAS-2, iNOS em células do cumulus bovino cultivadas in vitro.7. CAPÍTULO 1
Expressão dos membros do sistema TNF-α em folículos ovarianos bovinos e o efeito do TNF-α e da dexametasona na sobrevivência, desevolvimento e ultraestrutura de folículos
pré-antrais in vitro
Expression of TNF-α system members in bovine ovarian follicles and the effects of TNF-α and dexamethasone on in vitro preantral follicle survival, development and ultrastructure
Artigo científico submetido – Junho 2016 Molecular Reproduction and Development
Expression of TNF-α system members in bovine ovarian follicles and the effects of TNF- α and dexamethasone on preantral follicle survival, development and ultrastructure in
vitro
A.W.B. Silvaa, R.P. Ribeiroa, V. G. Menezesb, R.S. Barberinob, J.R.S. Passosa, A.M.P. Dauc, J.J.N. Costaa, L.R.F. Meloa, F.T.G, Bezerraa, M.A.M., Donatod, C.A. Peixotod, M.H.T.
Matosb, P.B.D Gonçalvesc, R. van den Hurke, J.R.V. Silvaa,*
a
Biotechnology Nucleus of Sobral - NUBIS, Federal University of Ceara, Sobral, CE, Brazil. b
Nucleus of Biotechnology Applied to Ovarian Follicle Development, Federal University of San Francisco Valley, Petrolina-PE, Brazil. c Laboratory of Biotechnology and Animal
Reproduction - BioRep, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, RS, Brazil. d
Laboratory of Ultrastructure, CPqAM/FIOCRUZ, Federal University of Pernambuco, Recife-PE, Brazil. eDepartment of Pathobiology, Faculty of Veterinary
Medicine, Utrecht University, Utrecht, The Netherlands.
*Corresponding address (J.R.V. Silva): Biotechnology Nucleus of Sobral - NUBIS, Federal University of Ceara, Av. Comandante Maurocélio Rocha Ponte 100, CEP 62041-040, Sobral,
CE, Brazil. Phone / Fax: +55 88 36118000 [jrvsilva@ufc.br]
TNF-α and DEX on bovine folliculogenesis
Grant sponsor: National Council for Scientific and Technological Development (CNPq, Brazil); Grant number 552376/2011-6.
Abbreviations: CASP3, caspase 3; CASP6, caspase 6; TNF-α, tumour necrosis factor-α; TNFR1, TNF-α receptor type 1; TNFR2, TNF-α receptor type 2; DEX, dexamethasone; BCL-
Abstract
This study was conducted to detect the expression of protein to TNF-α system members (TNF-α/ TNFRń/TNFR2) in bovine ovarian follicles and to evaluate the effects of TNF-α or dexamethasone on the survival and growth of primordial follicles in vitro, as well as on gene expression in cultured ovarian tissue. Ovarian fragments were cultured for 6 days in α-MEM+
supplemented with TNF-α (Ń, ń, ńŃ, ńŃŃ or 2ŃŃ ng/mL) or dexamethasone (Ń, ń, ńŃ, 100 or 200 ng/mL). After culture, was evaluated the expression of mRNAs for BCL-2, BAX, P53, TNF -α, and CASP3 and CASP6. Immunohistochemical results showed that the TNF-α system members, were detected in bovine preantral and antral follicles. After 6 days, TNF-α (10 ng/ml) reduced the percentage of normal preantral follicles and increased the number of TUNEL-positive cells in cultured tissue. Dexamethasone (10 ng/mL) during 6 days of culture did maintain the percentage of normal follicles and maintains the ultrastructure of follicles, while presence of TNF-α or dexamethasone did not influence primordial follicle activation. However, TNF-α or dexamethasone had no effect on the levels of mRNA for P53, BCL-2, BAX and CASP6, in cultured tissues, but the presence of DEX reduced the levels of CASP3 compared to ovarian slices cultured in control medium (α-MEM+). In conclusion, proteins of TNF-α system are expressed at different bovine follicle stages. Addition of TNF-α in culture reduces follicle survival and increases the number of apoptotic cells in ovarian tissue, while the presence of dexamethasone maintains follicle ultrastructure in cultured tissue.
Introduction
In the context of fertility preservation, the physiology of preantral ovarian follicles acquired substantial interest over the last decade. In this regard, many studies have evaluated the effect of various compounds, such as hormones, growth factors and cytokines, during in vitro culture of preantral follicles from different species to develop a culture system to enable follicular growth and development in vitro (Araújo et al., 2014). Cytokines are small soluble signaling proteins that have immunoregulatory properties, but increasingly recognized as growth factors governing cell function, proliferation and differentiation (Best et al., 2000). The synthesis of cytokines in the ovary, their presence in follicular fluid and their effects on follicular growth suggest that cytokines can act in autocrine, paracrine and endocrine manner to control ovarian functions (Richards et al., 2010; Qiao et al., 2011). Among these, the tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) seems to exert important activities in the ovary.
TNF-α is a 17,000 kDa polypeptide that elicits different biological responses, like inflammation, cell proliferation, differentiation and apoptosis (Liu, 2005). TNF-α exerts its effects by binding to types 1 and 2 receptors (TNFR1 and TNFR2) (Gupta, 2001; Vandenabeele et al., 1995). However, there is no information about the expression of TNF-α system proteins and protein localization of these ligand and their receptors in bovine ovarian follicles. TNF-α is one of the most important modulators of apoptosis in rat ovary (Kaipia et al., 1996), and in cultured granulosa cells of the mouse (Quirk et al., 1998), hen (Witty et al., 1996), and human (Matsubara et al., 2000). It was documented that TNF-α induced apoptosis in human granulosa cells may be blocked by glucocorticoids such as dexamethasone (DEX) (Sasson et al., 2002). In vitro studies with human monocytes have also demonstrated that dexamethasone suppress the production of endogenous TNF (Waage and Bakke, 1998). On the other hand, in vitro exposure to dexamethasone decreased germ cell density and disturbs human fetal oogenesis (Poulain et al., 2012). In addition, a recent study showed that
dexamethasone stimulates activation of caspase 3 (CASP3) which results in apoptosis of granulosa cell in rat preovulatory follicles (Yuan et al., 2014). Thus, the mechanism of how TNF-α and dexamethasone affects ovarian folliculogenesis and apoptosis is not completely understood. In addition, the effects of TNF-α and dexamethasone on early follicular development and on expression of genes involved in the apoptotic process (BCL-2, BAX, P 53, TNF-α, CASP3 and CASP6) in cows are still unknown. Knowledge of the role of TNF-α and dexamethasone during activation of primordial follicles is important to provide new insights in the molecular mechanism controlling early follicle development. Because of ethical reasons, access to human ovaries for research is limited and thus, use of bovine ovarian tissue as a model for the study of factors that regulate follicle growth could be a valuable alternative (Petro et al., 2012).
To better understand the role of TNF-α and dexamethasone in the early stages of folliculogenesis and to develop an efficient culture system for bovine primordial follicles, this study aimed to (1) evaluate the expression of protein for TNF-α and its receptors (TNFR1/TNFR2) in preantral and antral follicles; (2) to investigate the effects of different concentrations of TNF-α and dexamethasone on the in vitro survival and activation of bovine preantral follicles; (3) to evaluate the effects of TNF-α and dexamethasone on the ultrastructural integrity and apoptosis of preantral follicles, as well as on the expression of mRNAs for BCL-2, BAX, P53, TNF-α, CASP3 and CASP6 in ovarian tissue after in vitro- culture.
Results